Name: real-time imaging of heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice
Uploaded: 2013-04-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mic

Diese Arbeit wurde zum Teil durch Zuschüsse aus National Institutes of Health (P30 HL101302 und RO1 HL109439 um JC) und der American Heart Association (SDG 5270005 JC) unterstützt. A. Barazia wurde von einem T32HL007829 NIH Ausbildungsförderung unterstützt.

Ein. Vorbereitung der Intravital Mikroskop (Abbildung 1A) <ol><li> Bereiten Superfusion Puffer (125 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 2,5 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2 und 17 mM NaHCO 3, pH 7,4). </li><li> Schalten Sie eine Durchblutungsstörung Wasserbad auf eine Temperatur von Puffer und eine thermo-kontrollierten Decke bei 37 ° C zu halten Belüften mit Stickstoffgas Puffer (5% CO 2 mit Stickstoff ausgeglichen). </li><li> Schalten Sie den Mikroskop-System (Sutter Lambda DG-4 High-Speed-Well...

<ol>
	<li>Wagner, D. D., Frenette, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vessel+wall+and+its+interactions.">The vessel wall and its interactions.</a> Blood. 111, 5271-5281 (2008).</li><li>Nieswandt, B., Kleinschnitz, C., Stoll, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischaemic+stroke:+a+thrombo-inflammatory+disease.">Ischaemic stroke: a thrombo-inflammatory disease.</a> J. Physiol. 589, 4115-4123 (2011).</li><li>Yang, J., Furie, B. C., Furie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+P-selectin+glycoprotein+ligand-1:+its+role+as+a+selectin+counterreceptor+in+leukocyte-endothelial+and+leukocyte-platelet+interaction.">The biology of P-selectin glycoprotein ligand-1: its role as a selectin counterreceptor in leukocyte-endothelial and leukocyte-platelet interaction.</a> Thromb. Haemost. 81, 1-7 (1999).</li><li>Zarbock, A., Polanowska-Grabowska, R. K., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-neutrophil-interactions:+linking+hemostasis+and+inflammation.">Platelet-neutrophil-interactions: linking hemostasis and inflammation.</a> Blood Rev. 21, 99-111 (2007).</li><li>Chen, J., Lopez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+platelets+with+subendothelium+and+endothelium.">Interactions of platelets with subendothelium and endothelium.</a> Microcirculation. 12, 235-246 (2005).</li><li>Konstantopoulos, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Venous+levels+of+shear+support+neutrophil-platelet+adhesion+and+neutrophil+aggregation+in+blood+via+P-selectin+and+beta2-integrin.">Venous levels of shear support neutrophil-platelet adhesion and neutrophil aggregation in blood via P-selectin and beta2-integrin.</a> Circulation. 98, 873-882 (1998).</li><li>Maugeri, N., de Gaetano, G., Barbanti, M., Donati, M. B., Cerletti, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+platelet-polymorphonuclear+leukocyte+interactions:+new+clues+to+the+antithrombotic+properties+of+parnaparin,+a+low+molecular+weight+heparin.">Prevention of platelet-polymorphonuclear leukocyte interactions: new clues to the antithrombotic properties of parnaparin, a low molecular weight heparin.</a> Haematologica. 90, 833-839 (2005).</li><li>Hidalgo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotypic+interactions+enabled+by+polarized+neutrophil+microdomains+mediate+thromboinflammatory+injury.">Heterotypic interactions enabled by polarized neutrophil microdomains mediate thromboinflammatory injury.</a> Nat. Med. 15, 384-391 (2009).</li><li>Cho, J., Furie, B. C., Coughlin, S. R., Furie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+role+for+extracellular+protein+disulfide+isomerase+during+thrombus+formation+in+mice.">A critical role for extracellular protein disulfide isomerase during thrombus formation in mice.</a> J. Clin. Invest. 118, 1123-1131 (2008).</li><li>Cho, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+disulfide+isomerase+capture+during+thrombus+formation+in+vivo+depends+on+the+presence+of+beta3+integrins.">Protein disulfide isomerase capture during thrombus formation in vivo depends on the presence of beta3 integrins.</a> Blood. 120, 647-655 (2012).</li><li>Gross, P. L., Furie, B. C., Merrill-Skoloff, G., Chou, J., Furie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte-versus+microparticle-mediated+tissue+factor+transfer+during+arteriolar+thrombus+development.">Leukocyte-versus microparticle-mediated tissue factor transfer during arteriolar thrombus development.</a> Journal of Leukocyte Biology. 78, 1318-1326 (2005).</li><li>Falati, S., Gross, P., Merrill-Skoloff, G., Furie, B. C., Furie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+in+vivo+imaging+of+platelets,+tissue+factor+and+fibrin+during+arterial+thrombus+formation+in+the+mouse.">Real-time in vivo imaging of platelets, tissue factor and fibrin during arterial thrombus formation in the mouse.</a> Nat. Med. 8, 1175-1181 (2002).</li><li>Barthel, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha+1,3+fucosyltransferases+are+master+regulators+of+prostate+cancer+cell+trafficking.">Alpha 1,3 fucosyltransferases are master regulators of prostate cancer cell trafficking.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 19491-19496 (2009).</li><li>Trzpis, M., McLaughlin, P. M., de Leij, L. M., Harmsen, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+cell+adhesion+molecule:+more+than+a+carcinoma+marker+and+adhesion+molecule.">Epithelial cell adhesion molecule: more than a carcinoma marker and adhesion molecule.</a> The American Journal of Pathology. 171, 386-395 (2007).</li><li>Junt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+visualization+of+thrombopoiesis+within+bone+marrow.">Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow.</a> Science. 317, 1767-1770 (2007).</li><li>Egan, C. E., Sukhumavasi, W., Bierly, A. L., Denkers, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+multiple+functions+of+Gr-1(+)+cell+subpopulations+during+microbial+infection.">Understanding the multiple functions of Gr-1(+) cell subpopulations during microbial infection.</a> Immunologic Research. 40, 35-48 (2008).</li></ol>

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für Echtzeit-Fluoreszenz-Intravitalmikroskopie um heterotypische Thrombozyten-Neutrophilen-Interaktionen auf dem aktivierten Endothel während der vaskulären Entzündung und Thrombose zu visualisieren. Zuvor ähnliche fluoreszenzmikroskopische Ansätze gemeldet wurden, um die molekularen Mechanismen der Thrombusbildung und vaskuläre Entzündungen zu studieren. 8,12 Da die heterotypische Zell-Zell-Interaktion könnte für Vaso-Okklusion wichtig, an der verlet...

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 2H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10035-04-8</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 6H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% NaCl Saline</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>0409-4888-10</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>0409-2051-05</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Lloyd</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intramedic Tubing (PE 90)</td>
			<td>BD Diagnostics</td>
			<td>427421</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intramedic Tubing (PE 10)</td>
			<td>BD Diagnostics</td>
			<td>427401</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine TNF-&alpha;</td>
			<td>R&amp;D Systems</td>
			<td>410-MT</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight 488- labeled rat anti-mouse CD42b antibody</td>
			<td>Emfret Analytics</td>
			<td>X488</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647-conjugated anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>108418</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NESLAB EX water bath/circulator</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus BX61W microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TH4-100 Power</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda DG-4</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPC-200 multi-manipulator</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROE-200 stage controller</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C9300 high-speed camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intensifier</td>
			<td>Video Scope International</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ablation Laser</td>
			<td>Photonic Instruments, Inc.</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SlideBook 5.0</td>
			<td>Intelligent Imaging Innovations</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time imaging of heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice

Wechselwirkung von aktivierten Blutplättchen und Leukozyten (hauptsächlich Neutrophile) auf der aktivierten Endothel vermittelt Thrombose und vaskuläre Entzündung. 1,2 Während Thrombusbildung an der Stelle der Verletzung arteriolären unterstützen Blutplättchen Anhänger der aktiviertes Endothel und subendothelialen Matrixproteinen neutrophilen rollenden und Haftung. 3 Umgekehrt unter venulären entzündlichen Erkrankungen können Neutrophile Anhänger der aktiviertes Endothel unterstützt Haftung und Akkumulation von zirkulierenden Blutplättchen. Heterotypische Blutplättchen-Aggregation neutrophilen erfordert sequentiellen Prozessen von den spezifischen Rezeptor-counter Rezeptor-Wechselwirkungen zwischen Zellen. 4 Es ist bekannt, aktivierten Endothelzellen Adhäsionsmolekülen wie von Willebrand-Faktor freizusetzen, initiiert somit Plättchenadhäsion und Akkumulation unter Hochscherbedingungen. 5 Außerdem aktivierten Endothelzellen unterstützt Neutrophilen rolling und Haftung durch die Expression Selektine eined interzellulären Adhäsionsmoleküls-1 (ICAM-1), bzw. bei niedrigen Shear-Bedingungen. 4 Platelet P-Selektin interagiert mit Neutrophilen durch P-Selektin Glykoprotein Ligand-1 (PSGL-1), dadurch Induzieren Aktivierung der neutrophilen β2 Integrinen und feste Haftung zwischen zwei Zelltypen. Trotz der Fortschritte in der in vitro-Experimenten, bei denen heterotypische Blutplättchen neutrophilen Wechselwirkungen in Vollblut oder isolierte Zellen, 6,7 ermittelt werden diese Studien nicht manipulieren kann Oxidationsmittel Stressbedingungen bei Gefäßerkrankungen. In diesem Bericht mit fluoreszenzmarkierten, spezifische Antikörper gegen eine Maus Blutplättchen und Neutrophilen-Marker beschreiben wir eine detaillierte Protokoll zu intravitalmikroskopische heterotypische Wechselwirkungen von Blutplättchen und Neutrophilen auf der aktivierten Endothelzellen während TNF-α-induzierte Entzündung oder nach laserinduzierten überwachen Verletzungen M. cremaster Mikrogefäßen von lebenden Mäusen.

Verwendung einer detaillierten Intravitalmikroskopie Analyse waren heterotypische Blutplättchen neutrophilen Wechselwirkungen auf der aktivierten Endothel visualisiert durch Infusion von fluoreszenzmarkierten Antikörpern gegen ein Plättchen (CD42c) oder Neutrophilen Marker (Gr-1) in einen Live-Mäusen. In einem Modell der TNF-α-induzierte venulären Entzündungen, wurden die meisten Rollen Neutrophilen stabil an das Endothel vermutlich durch Interaktion von aktivierten β2 Integrine mit ...

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Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

Hier berichten wir über eine experimentelle Technik der Fluoreszenz-Intravitalmikroskopie um heterotypische Thrombozyten-Neutrophilen-Interaktionen auf dem aktivierten Endothel während der vaskulären Entzündungen und Thrombusbildung in lebenden Mäusen sichtbar zu machen. Diese mikroskopische Technik wird wertvoll sein, um die molekularen Mechanismen der vaskulären Erkrankungen zu studieren und pharmakologische Mittel unter pathophysiologischen Bedingungen zu testen.

Real-time Imaging der heterotypische Platelet-Neutrophilen-Interaktionen auf aktiviertem Endothel Während Vascular Entzündung und Thrombusbildung in lebenden Mäusen

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &beta;-arrestin

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with ÃƒÅ½Ã‚Â²-arrestin

Real-time Imaging von Leukotrien B 4 Vermittelte Zellmigration und BLT1 Wechselwirkungen mit β-Arrestin

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Imaging Leukocyte Adhesion to the Vascular Endothelium at High Intraluminal Pressure

Imaging Leukozytenadhäsion an das vaskuläre Endothel bei hohen intraluminalen Druck

Worldwide, hypertension is reported to be in approximately a quarter of the population and is the leading biomedical risk factor for mortality worldwide. ...

Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation

Nachweis von microRNAs in Mikroglia durch Real-time PCR in Normal-und ZNS Während Neuroinflammation

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Echtzeit-Live-Imaging von T-Zell-Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

Echtzeit-Bildgebung von Zell-Zell-Endothelial Junctions Während Neutrophile Transmigration unter physiologischen Fluss

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

Entschlüsselung und Imaging Pathogenese und Cording von<em&gt; Mycobacterium abscessus</em&gt; In Zebrafischembryonen

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Abbilden Neutrophilen und Monozyten in Mesenterialvenen von Intravitalmikroskopie an narkotisierten Ratten in Echtzeit

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Metabolic Characterization of Polarized M1 and M2 Bone Marrow-derived Macrophages Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Metabolische Charakterisierung Polarized M1 und M2-Knochenmark-Makrophagen über die Echtzeit-Extrazelluläre Flußanalyse

Specific metabolic pathways are increasingly being recognized as critical hallmarks of macrophage subsets. While LPS-induced classically activated M1 or ...

In Vitro Microfluidic Disease Model to Study Whole Blood-Endothelial Interactions and Blood Clot Dynamics in Real-Time

In Vitro Mikrofluidic Disease Model zur Untersuchung von Blut-Endothel-Wechselwirkungen und Blutgerinnsungsdynamik in Echtzeit

The formation of blood clots involves complex interactions between endothelial cells, their underlying matrix, various blood cells, and proteins. The ...

Blocking Lymph Flow by Suturing Afferent Lymphatic Vessels in Mice

Blockierung des Lymphflusses durch Suieren von afferenten Lymphgefäßen bei Mäusen

Lymphatic vessels are critical in maintaining tissue fluid balance and optimizing immune protection by transporting antigens, cytokines, and cells to ...