Name: a high-throughput method for measurement of glomerular filtration rate in conscious mice
Uploaded: 2013-05-10T12:00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice at JoVE.com

أشكر الدكتور جيسيكا دومينغيز Rieg لقراءة نقدية لهذه المخطوطة. وأيد هذا العمل من قبل جمعية القلب الأمريكية (عالم التنمية المنحة 10SDG2610034)، وكارل جورج جوتشالك بحوث المنح للجمعية الأمريكية لأمراض الكلى، والمعهد الوطني للسكري وأمراض الجهاز الهضمي والكلى مركز أوبراين للأبحاث إصابة الكلى الحاد ( P30DK079337)، وزارة شؤون المحاربين القدامى.

1. حلول <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.85٪ كلوريد الصوديوم: 8.5 غرام كلوريد الصوديوم / 1 لتر [ده 2 O (8.5 جم / لتر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.5 مول / لتر HEPES 7.4 درجة الحموضة (حل 59.6 غرام من HEPES في 0.5 L من ده 2 0 وضبط درجة الحموضة إلى 7.4 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم 10 N). </li></ol> 2. إعداد FITC-حبوب حقن الحل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزن FITC-حبوب لإعداد محلول 5٪ وتذوب في 0.85٪ كلوريد الصوديوم (عادة 100 ملغ / 2 مل 0.85٪ كلوريد الصوديوم) عن طريق التسخين إلى 90 درجة مئوية حتى يذوب تماما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزن حل حل FITC-حبوب وملاحظة الوزن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع 20 سم قطعة من غشاء غسيل الكلى (الوزن الجزيئي قطع: 1،000) ووضعها في DDH 2 O لمدة 30 دقيقة لإزالة نان المتبقية 3 من الغشاء وطرد عدة مرات بعد ذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء حل FITC-حبوب في غشاء غسيل الكلى وختم صحيح مع الإغلاق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزن كامل غشاء غسيل الكلى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع غشاء غسيل الكلى في 1 L محلول كلوريد الصوديوم 0.85٪ ويحرك ببطء محمية ضوء لمدة 24 ساعة عند ريال عمانيدرجة الحرارة ام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزن كامل غشاء غسيل الكلى مرة أخرى وحساب تركيز جديد (سوف تتحرك المياه osmotically في غشاء وFITC غير منضم، أو ملزمة FITC-حبوب &lt;1،000 الوزن الجزيئي والخروج من الغشاء، وبالتالي، فإن تركيز حبوب FITC-يقلل إلى حد كبير) . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم حساب تركيز FITC-حبوب جديدة (ج) باستخدام الصيغة التالية: C = N / V، حيث n = كمية FITC-حبوب الأولي، V = حجم جديد (الفرق في الوزن من أنابيب غسيل الكلى قبل وبعد غسيل الكلى بالإضافة إلى حجم الأولي حل FITC-سكري). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل استخدام تعقيم مدال حل FITC-حبوب عن طريق الترشيح من خلال مرشح 0.22 ميكرون حقنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على FITC-حبوب محمية من الضوء (رقائق الألومنيوم) في 4 درجات مئوية. مدال وتعقيمها FITC-حبوب يمكن استخدامه لمدة تصل الى 2 أسابيع. شارك FITC-حبوب يمكن حله من خلال إعادة التسخين عند 90 درجة مئوية لمدة بضع دقائق. </li></ol> ملاحظة: في حالة استخدامFITC-sinistrin 16-18، والتي لا تتطلب غسيل الكلى، وجميع الخطوات اللازمة لغسيل الكلى يمكن تخطي. 3. حقن وجمع الدم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأخذ وزن الجسم (وزن الجسم) من الفئران قبل التجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الفئران لفترة وجيزة مع isoflurane و. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لعالية الإنتاجية من 6 الفئران يرجى اتباع البروتوكول تنص في الشكل 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن 2 ميكرولتر / ز من وزن الجسم من مدال FITC-حبوب في الضفيرة retroorbital 24 باستخدام ½ G30 في إبرة (إزالة فقاعات الهواء من 100 ميكرولتر حقنة هاميلتون بواسطة الأول باستخدام ½ G26 في إبرة ومن ثم التحول إلى ½ G30 في إبرة لل حقن). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع 1 ملم من ذيل الفأر مع مقص مرة واحدة وجمع الدم في 3، 5، 7، 10، 15، 35، 56 و 75 دقيقة بعد الحقن في نا الهيبارين minicapillaries. ختم minicapillaries بعد جمع الدم مع تشا الختم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاحتفاظ بعينات محمية من الضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع مختومة minicapillaries داخل أمراض الدمالحرجة الشعيرات الدموية وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كسر minicapillaries باستخدام قطع الماس ونقل البلازما كامل من قبل pipetting في أنبوب مل 0.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل تخفيف 01:10 باستخدام 2 ميكرولتر من البلازما و 18 ميكرولتر 0.5 مول / لتر HEPES (7.4 درجة الحموضة) في أنبوب 0.2 مل جديدة (يمكن تخزين العينات بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية لمدة قياسات مضان). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس 2 ميكرولتر من العينة المخففة مع معمل NanoDrop 3300 في التكرارات. وصفت وصف واستخدام الصك هنا 5. </li></ol> 4. إعداد معايير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الدم من الفئران من سلالة الخلفية نفسه في الهيبارين المغلفة الهيماتوكريت الشعيرات الدموية، وتدور باستمرار وتمييع 01:10 مع 0.5 مول / لتر HEPES (الرقم الهيدروجيني 7.4)، وعادة 80 ميكرولتر بلازما + 720 HEPES ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الحل حقن FITC-حبوب مع البلازما الماوس المخفف للحصول على التخفيفات القياسية التالية: 01:10: 10 ميكرولتر مخفف حل FITC-حبوب + 90 ميكرولتر البلازما الماوس المخفف 1:100: 10 &amp; مو، L (1:10) حل + 90 ميكرولتر البلازما الماوس المخفف 1:1،000: 10 ميكرولتر (1:100) حل + 90 ميكرولتر البلازما الماوس المخفف 1:2،000: 30 ميكرولتر (1:1) حل + 30 ميكرولتر البلازما الماوس المخفف 1:10،000: 10 ميكرولتر (1:5) حل + 40 ميكرولتر البلازما الماوس المخفف 1:20،000: 20 ميكرولتر (1:1) حل + 20 ميكرولتر البلازما الماوس المخفف 1:100،000: 10 ميكرولتر (1:5) حل + 40 ميكرولتر البلازما الماوس المخفف سوف تركيز المعايير تعتمد على غسيل الكلى، وسوف تكون دائما مختلفة لكل إعداد FITC-حبوب. فمن الضروري لدخول تركيز لمنحنى معيار جديد في كل مرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل البيانات لحساب GFR مع البرامج المناسبة (على سبيل المثال بريزم GraphPad) باستخدام دالة الاضمحلال الأسي على مرحلتين كما هو موضح في هنا 15 و 20 و هو مبين في القسم ممثل النتائج. </li></ol>

<ol>
	<li>Bauer, J. H., Brooks, C. S., Burch, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+appraisal+of+creatinine+clearance+as+a+measurement+of+glomerular+filtration+rate.">Clinical appraisal of creatinine clearance as a measurement of glomerular filtration rate.</a> Am. J. Kidney Dis. 2 (3), 337-346 (1982).</li><li>Carrie, B. J., Golbetz, H. V., Michaels, A. S., Myers, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creatinine:+an+inadequate+filtration+marker+in+glomerular+diseases.">Creatinine: an inadequate filtration marker in glomerular diseases.</a> Am. J. Med. 69 (2), 177-182 (1980).</li><li>Chasis, H., Ranges, H. A., Goldring, W., Smith, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Control+of+Renal+Blood+Flow+and+Glomerular+Filtration+in+Normal+Man.">The Control of Renal Blood Flow and Glomerular Filtration in Normal Man.</a> J. Clin. Invest. 17 (5), 683-697 (1938).</li><li>Darling, I. M., Morris, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+"true"+creatinine+clearance+in+rats+reveals+extensive+renal+secretion.">Evaluation of "true" creatinine clearance in rats reveals extensive renal secretion.</a> Pharm. Res. 8 (10), 1318-1322 (1991).</li><li>Dunn, S. R., Qi, Z., Bottinger, E. P., Breyer, M. D., Sharma, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utility+of+endogenous+creatinine+clearance+as+a+measure+of+renal+function+in+mice.">Utility of endogenous creatinine clearance as a measure of renal function in mice.</a> Kidney Int. 65 (5), 1959-1967 (2004).</li><li>Eisner, C., Faulhaber-Walter, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Major+contribution+of+tubular+secretion+to+creatinine+clearance+in+mice.">Major contribution of tubular secretion to creatinine clearance in mice.</a> Kidney Int. 77 (6), 519-526 (2010).</li><li>Faulhaber-Walter, R., Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+A1+adenosine+receptors+augments+diabetic+hyperfiltration+and+glomerular+injury.">Lack of A1 adenosine receptors augments diabetic hyperfiltration and glomerular injury.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 19 (4), 722-730 (2008).</li><li>FINGL, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubular+excretion+of+creatinine+in+the+rat.">Tubular excretion of creatinine in the rat.</a> Am. J. Physiol. 169 (2), 357-362 (1952).</li><li>Keppler, A., Gretz, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+creatinine+determination+in+mice+and+rats:+an+enzymatic+method+compares+favorably+with+a+high-performance+liquid+chromatography+assay.">Plasma creatinine determination in mice and rats: an enzymatic method compares favorably with a high-performance liquid chromatography assay.</a> Kidney Int. 71 (1), 74-78 (2007).</li><li>Levey, A. S., Perrone, R. D., Madias, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+creatinine+and+renal+function.">Serum creatinine and renal function.</a> Annu. Rev. Med. 39, 465-490 (1988).</li><li>Lorenz, J. N., Gruenstein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+nonradioactive+method+for+evaluating+single-nephron+filtration+rate+using+FITC-inulin.">A simple, nonradioactive method for evaluating single-nephron filtration rate using FITC-inulin.</a> Am. J. Physiol. 276, 172-177 (1999).</li><li>Meyer, M. H., Meyer, R. A., Gray, R. W., Irwin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Picric+acid+methods+greatly+overestimate+serum+creatinine+in+mice:+more+accurate+results+with+high-performance+liquid+chromatography.">Picric acid methods greatly overestimate serum creatinine in mice: more accurate results with high-performance liquid chromatography.</a> Anal. Biochem. 144 (1), 285-290 (1985).</li><li>Qi, Z., Breyer, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+glomerular+filtration+rate+in+conscious+mice.">Measurement of glomerular filtration rate in conscious mice.</a> Methods Mol. Biol. 466, 61-72 (2009).</li><li>Qi, Z., Whitt, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+determination+of+glomerular+filtration+rate+in+conscious+mice+using+FITC-inulin+clearance.">Serial determination of glomerular filtration rate in conscious mice using FITC-inulin clearance.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 286 (3), F590-F596 (2004).</li><li>Schock-Kusch, D., Sadick, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcutaneous+measurement+of+glomerular+filtration+rate+using+FITC-sinistrin+in+rats.">Transcutaneous measurement of glomerular filtration rate using FITC-sinistrin in rats.</a> Nephrol. Dial Transplant. 24 (10), 2997-3001 (2009).</li><li>Schock-Kusch, D., Xie, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcutaneous+assessment+of+renal+function+in+conscious+rats+with+a+device+for+measuring+FITC-sinistrin+disappearance+curves.">Transcutaneous assessment of renal function in conscious rats with a device for measuring FITC-sinistrin disappearance curves.</a> Kidney Int. 79 (11), 1254-1258 (2011).</li><li>Schreiber, A., Shulhevich, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcutaneous+measurement+of+renal+function+in+conscious+mice.">Transcutaneous measurement of renal function in conscious mice.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 303 (5), F783-F788 (2012).</li><li>Shemesh, O., Golbetz, H., Kriss, J. P., Myers, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+creatinine+as+a+filtration+marker+in+glomerulopathic+patients.">Limitations of creatinine as a filtration marker in glomerulopathic patients.</a> Kidney Int. 28 (5), 830-838 (1985).</li><li>Sturgeon, C., Sam, A. D., Law, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+determination+of+glomerular+filtration+rate+by+single-bolus+inulin:+a+comparison+of+estimation+analyses.">Rapid determination of glomerular filtration rate by single-bolus inulin: a comparison of estimation analyses.</a> J. Appl. Physiol. 84 (6), 2154-2162 (1998).</li><li>Vallon, V., Blantz, R. C., Thomson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+hyperfiltration+and+the+salt+paradox+in+early+[corrected]+type+1+diabetes+mellitus:+a+tubulo-centric+view.">Glomerular hyperfiltration and the salt paradox in early [corrected] type 1 diabetes mellitus: a tubulo-centric view.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 14 (2), 530-537 (2003).</li><li>Vallon, V., Eraly, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+the+organic+anion+transporter+OAT3+in+renal+creatinine+secretion+in+mice.">A role for the organic anion transporter OAT3 in renal creatinine secretion in mice.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 302 (10), F1293-F1299 (2012).</li><li>Vallon, V., Schroth, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosine+A(1)+receptors+determine+glomerular+hyperfiltration+and+the+salt+paradox+in+early+streptozotocin+diabetes+mellitus.">Adenosine A(1) receptors determine glomerular hyperfiltration and the salt paradox in early streptozotocin diabetes mellitus.</a> Nephron. Physiol. 111 (1), 30-38 (2009).</li><li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retro-orbital+injections+in+mice.">Retro-orbital injections in mice.</a> Lab Anim. (NY. 40 (5), 155-160 (2011).</li></ol>

المؤلف تلقت تمويلا لتغطية تكاليف هذا المنشور من قبل الحرارية فيشر العلمية.

يصف هذه الدراسة تقنية لتحديد GFR في الفئران واعية من قبل حقن بلعة واحد وتحليل مضان في 8 عينات الدم عن طريق مرحلتين الاضمحلال الأسي. A قياس GFR في 1 الفأر يأخذ 75 دقيقة. باستخدام الخاصة لوحة المجريات، فمن الممكن لقياس GFR من 6 الفئران في 130 دقيقة. فمن الممكن أن يكرر هذا البروتوكول تدفق الرسم البياني يصل إلى 4 مرات في اليوم الواحد وقياس GFR في 24 الفئران. نحن تعديل هذه الطريقة حتى أنه من الممكن لجمع الدم من قص ذيل صغير بدلا من ذيل ثقب الوريد، والتي هي أسرع وأسهل للمحققين لإجراء مقارنة مع ذيل ثقب الوريد. باستخدام 10 ميكرولتر الهيماتوكريت الشعيرات الدموية والتخفيف 01:10، فمن الممكن للحد من المبلغ الإجمالي من الدم اللازم ل&lt;100 ميكرولتر. وأخيرا، يتم قياس مضان باستخدام معمل NanoDrop 3300 fluorospectrometer، الذي يسمح بتحديد مضان في 1-2 ميكرولتر من العينة المخففة. وهذه الطريقة سوف تعطي محقق المهتمةصحيح را قيمة GFR. في المقابل، قياسات الكرياتينين في الفئران لديها العديد من نقاط الضعف بما في ذلك &quot;مجموعة أعمى الكرياتينين&quot; والصعوبات المتعلقة بتحديد محددة وحساسة. في &quot;مجموعة أعمى الكرياتينين&quot; حدود وظيفتها كعلامة للGFR بسبب مصل الكرياتينين يبقى في المعدل الطبيعي حتى يتم فقدان 50٪ من وظيفة الكلى 19. منذ عدة محققين استخدام الفئران المعدلة وراثيا في أبحاثهم لدراسة علم وظائف الأعضاء والفيزيولوجيا المرضية الكلوية، وهذا يحمل المشكلة التالية: وعلى افتراض ماوس خروج المغلوب من الجينات X لديها GFR أقل من ذلك بكثير (بنسبة 40٪) مقارنة مع الماوس من النوع البري، وهو وفحص بسيط بمقارنة البلازما الكرياتينين لا يكشف هذا الاختلاف. الحاجة إلى وجود طريقة دقيقة جيدة من GFR تقرير يصبح أكثر أهمية أصغر الفوارق في GFR تصبح. الفئران لديهم تركيزات عالية من chromagens غير الكرياتينين في البلازما والبول التي تتداخل مع تجارياالمقايسات الكرياتينين المتاحة. ونتيجة لذلك، المقايسات التي تستند إلى جافيه تتجمع القلوية رد الفعل المبالغة تركيز الكرياتينين في البلازما مقارنة مع عالية الأداء اللوني السائل (HPLC) تحديد 6 و 13. الحد الآخر هو أن الكرياتينين في مصل الدم هو أقل من حدود الكشف عن عدة فحوصات متوفرة تجاريا مقارنة HPLC تقرير. ومع ذلك، باستخدام التفاعلات الإنزيمية المحققين تمكنوا من تحديد البلازما الكرياتينين في الفئران 10، 22. تم العثور على GFR في مجموعة مشابهة في الفئران واعية باستخدام أسلوب حقن بلعة واحدة قابلة للمقارنة وكذلك البولية التخليص FITC-حبوب 14. وعلى النقيض من البروتوكول، وبروتوكول لدينا باستخدام قص ذيل لا يتطلب احتياطات خاصة للحفاظ على سلامة السفينة بالمقارنة مع الوريد الصافن الذيل أو ثقب الوريد. عن التخليص البولية / بلازما استنادا FITC-حبوب فمن الضروري لزرع جراحيا اثنين ميل ناضحnipumps. مضختين ضرورية لتحقيق عالية بما فيه الكفاية الحالة المستقرة البلازما تركيزات FITC-حبوب التي يمكن تمييزها بوضوح من الخلفية. وهذا يتطلب أيضا استخدام الأقفاص الأيضية لجمع البول الكامل وتوقيتها. تحتاج الأقفاص إلى أن تشطف لحساب خسارة من 25-37٪ من FITC-حبوب، والذي يحدث خلاف ذلك دون الشطف. مطبات باستخدام هذا الأسلوب FITC-حبوب محدودة. ينبغي للمحققين أن تكون على علم بما يلي: (ط) أؤكد أنه لا توجد فقاعات الهواء في الحقنة المستخدمة للحقن للحل FITC، يجب أن يتحقق (II) الحقن خلف المقلة كاملة لأن كمية حقن يحدد GFR محسوب، و ( III) الفئران فإن معظم التبول المرجح خلال دقيقة التجربة GFR 75، لذا تجنب تلويث عينات الدم مع البول، والتي سيكون لها تركيز FITC-حبوب عالية جدا نتيجة لقدرة تركيز الكلى. مزايا عامة سو هذا الأسلوب FITC-حبوب تتضمن ما يلي: (ط) وهي تقنية غير المشعة، (الثاني) أنه من الممكن تكرار القياسات عدة مرات في نفس الماوس، (الثالث) الفحص لا يمكن أن يؤديها في الفئران واعية، ( رابعا) لا يلزم جمع البول، و(V) خيار الإنتاجية العالية يمكن استخدامها. وتشمل مساوئ لحقن بلعة واحد الحاجة لغسيل الكلى من FITC-حبوب، والتي يمكن التغلب عليها باستخدام أفضل FITC-علامة، FITC-sinistrin، والذي يتوفر الآن، ويمكن أن يقاس transcutaneously باستخدام جهاز المنمنمة الخاصة 18. على الرغم من GFR يقاس، فمن غير الممكن قياس إفرازات كسور من السوائل أو الأيونات مع هذا الأسلوب. أخذت معا، ويوفر هذا الأسلوب جدوى أسلوب الإنتاجية العالية لقياس GFR في الفئران واعية. وبالتالي، هذه التقنية قد تكون ذات فائدة للمحققين آخرين يرغبون في تحديد وظيفة الكلى في الفئران.

أصبح معدل تشكيل البلازما رشاحة مستدقة في الكبيبة أساس لتقييم وظائف الكلى (معدل الترشيح الكبيبي، GFR). علامة مثالية لتحديد GFR ينبغي تصفيتها بحرية، لا يفرز أو استيعابها وليس استقلابه. تم العثور على مثل هذا السلوك أن يكون صحيحا لحبوب، وأصبحت إزالة حبوب معيار الذهب لتحديد GFR 3. في حين يتم استخدام إزالة الكرياتينين على نطاق واسع كمقياس للGFR في البشر والحيوانات، والكرياتينين لا يلبي متطلبات من GFR علامة مثالية. حوالي 10 - 40٪ من تصفية الكرياتينين في البشر هو نتيجة لإفراز أنبوبي بالموقع 1، 11، وإفراز الكلوي من الكرياتينين هو أيضا بارزة في الفئران والجرذان 4، 7، 9، 22. ومن المعروف الكلى اختلال وظيفي لزيادة إفراز أنبوبي من الكرياتينين مما يحد من قيمتها كعلامة من GFR 1، 2. لقد أظهرنا سابقا أن العضوية أنيون الإسوي نقل3 (OAT3) يسهم في إفراز الفئران الكرياتينين كلوي 22. ومع ذلك، وإزالة حبوب يتطلب عادة استخدام المشعة صفت حبوب (3 H أو 14 C). تحديد المشعة من حبوب يمكن استخدامه في كل من الفئران تخدير واعية، ولكن تؤوي مساوئ عديدة لوائح السلامة والتعامل مع قضايا صارمة متأصلة مع استخدام النظائر المشعة. على طول تلك الخطوط، والأعمال التحضيرية إزالة الجراحية لتحديد GFR هي مضيعة للوقت وكذلك محطة في الطبيعة. في عام 1999 لورينز وآخرون. 12 قدم FITC-حبوب كعلامة من واحد كليون GFR في تخدير الفئران. خمس سنوات بعد الانعقاد تشى وآخرون. 15 تحديد كامل GFR الكلى في الفئران واعية باستخدام FITC-حبوب. بروتوكولات بديلة تستخدم الآن FITC-حبوب باعتباره علامة خارجية لقياس GFR في الفئران واعية وتخدير. هذه البروتوكولات الإبقاء على حساسية حبوب المشعة باستخدام مضان detectiعلى التحايل وعيوب العمل مع علامة مشعة المسمى. تم تعديل مقايسة FITC-حبوب من قبل الآخرين 7 و 8 و لنا 22 و 23 للاستفادة من القدرة microvolume من معمل NanoDrop 3300 fluorospectrometer. وهذا يسمح تخفيض مجموع حجم العينة المطلوبة ل&lt;100 ميكرولتر من الدم في قياس GFR. مع أسلوب وبروتوكول الإنتاجية العالية المقدمة في هذا المنشور، ونحن لشرح جدوى قياس GFR في ما يصل الى 24 الفئران واعية لكل يوم. هذه التقنية يمكن أن تكون مفيدة للمحققين آخرين يدرسون GFR الفئران، ونحن نأمل أن تحل محل أساليب أقل دقة مؤشرين لوظائف الكلى، مثل الكرياتينين واليوريا والنيتروجين في الدم.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-inulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3272</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7706</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Webster Veterinary</td>
			<td>78366551</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis membrane (MWCO 1000)</td>
			<td>Spectrum Laboratories</td>
			<td>132636</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane closure</td>
			<td>Spectrum Laboratories</td>
			<td>132736</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80 &mu;l Hematocrit capillaries</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>22362566</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematocrit centrifuge</td>
			<td>IEC</td>
			<td>Micro-MB</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &mu;l Na+-Heparin minicaps</td>
			<td>Hirschmann</td>
			<td>9000210</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (100 &mu;l)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80601</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorospectrometer</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>NanoDrop 3300</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter (0.22 &mu;m)</td>
			<td>Spectrum Laboratories</td>
			<td>880-26464-UE</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealant</td>
			<td>Ch&acirc;-seal</td>
			<td>510</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles (G26 &frac12; and G30 &frac12;)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305111 &amp; 305106</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput method for measurement of glomerular filtration rate in conscious mice

قياس معدل الترشيح الكبيبي (GFR) هو معيار الذهب في تقييم وظائف الكلى. حاليا، محققين تحديد GFR عن طريق قياس مستوى الكرياتينين العلامات البيولوجية الذاتية أو خارجيا التطبيقية المشعة صفت حبوب (3 H أو 14 C). الكرياتينين لديه عيب كبير أن الداني حسابات إفراز أنبوبي ل~ 50٪ من إجمالي إفراز الكرياتينين الكرياتينين كلوي وبالتالي ليس GFR علامة موثوق بها. اعتمادا على تجربة أداء، يمكن تحديد إزالة حبوب عن طريق حقن بلعة واحدة في الوريد أو التسريب المستمر (minipump في الوريد أو ناضح). كلا النهجين يتطلب جمع البلازما أو البلازما والبول، على التوالي. وتشمل العوائق الأخرى المشعة حبوب صفت استخدام النظائر، مضيعة للوقت إعداد الجراحية للحيوانات، واشتراط وجود تجربة محطة. نحن هنا وصف الأسلوب الذي يستخدم حقن بلعة واحدة منفلوريسئين ثيوسيانات-(FITC) حبوب وصفت وقياس مضان في 1-2 ميكرولتر من البلازما المخفف. عن طريق تطبيق نموذج اثنين من المقصورة، مع 8 مجموعات الدم في الماوس، فمن الممكن لقياس GFR في ما يصل الى 24 فئران لكل يوم باستخدام بروتوكول تدفق العمل الخاص. هذا الأسلوب يتطلب سوى تخدير isoflurane وجيزة مع جميع عينات الدم التي يتم جمعها في الماوس غير مقيدة ومستيقظا. ميزة أخرى هي أنه من الممكن لمتابعة الفئران على مدى فترة من عدة أشهر والعلاجات (أي القيام بتجارب إرفاقها مع التغييرات الغذائية أو التطبيقات المخدرات). نأمل أن هذا الأسلوب من قياس GFR هو مفيد للمحققين الأخرى دراسة وظائف الكلى الماوس وسوف تحل محل أساليب أقل دقة من تقدير وظائف الكلى، مثل البلازما الكرياتينين واليوريا والنيتروجين في الدم.

وسيتم احتساب GFR باستخدام الصيغة التالية: GFR = ن / (A/K1 + B/K2)، حيث ن = كمية حقن (ن = ج • V، حيث C = FITC-حبوب التركيز، V = حجم حقن) A = Span1، التقاطع y القضاء K1 = الاضمحلال المستمر للقضاء B = Span2، التقاطع y التوزيع K2 = الاضمحلال المستمر للتوزيع ملاحظة: A، K1، K2 وB هي الاختصارات التي قدمها GraphPad بريزم، كل برنامج قادر على تحليل مرحلتين الاضمحلال الأسي يمكن استخدامها، ومع ذلك، قد البرامج العلمية الأخرى تستخدم الاختصارات المختلفة. من خلال توظيف مرحلتين الأسي الاضمحلال تناسب منحنى، والتي تقوم على تركيزات البلازما FITC-حبوب، منحنى مماثلة لتلك التي تظهر في الشكل 1 ينبغي الحصول عليها. حساب GFR بواسطة الصيغة أعلاه هو مبين (وكما هو موضح في هنا &lt;سوب&gt; 20) يتيح للكشف عن الضعف في وظائف الكلى أو 15 hyperfiltration الكبيبي 8، 23 كما هو موجود في الفئران مع نوع 1 داء السكري (الشكل 2). <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/50330/50330fig1.jpg" /> الشكل 1. لقياس GFR في الفئران واعية، ويتم استخدام البلازما حركية FITC-حبوب بعد الحقن في الوريد بجرعة واحدة. لحساب GFR، ويستخدم نموذج اثنين من المقصورة. في النموذج ثنائي مقصورة، مرحلة الاضمحلال السريع الأولي يمثل إعادة توزيع FITC-حبوب من مقصورة داخل الأوعية الدموية إلى السائل خارج الخلية. في مرحلة لاحقة، مع الاضمحلال أبطأ في تركيز FITC-حبوب، يعكس في الغالب إزالة نظامية من البلازما. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/50330/50330fig2.jpg" /> الشكل 2. Detectioن من hyperfiltration السكري في الفئران من النوع البري. النوع الأول وكان المستحث داء السكري من خلال تطبيق داخل الصفاق من بالستربتوزوتوسين (STZ، 50 ملغ / كغ لمدة 5 أيام متتالية). تم تحديد GFR بعد قبل (القاعدية) و 5 أسابيع تحريض السكري. ونظرا لردود الفعل tubuloglomerular، زيادة الابتدائية في استيعاب الداني في وقت مبكر يسبب السكري hyperfiltration 21 وهو الاكتشاف الذي هو استنساخه في الفئران البرية من نوع (ن = 10، P &lt;0.01 مقابل نفس الماوس القاعدية). <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/50330/50330fig3.jpg"/> الشكل (3). مخطط بياني لقياس GFR في مجموعة من 6 الفئران. لقياس كله الكلى GFR من خلال طريقة واحدة حقن بلعة، يجب جمع 8 عينات الدم في 3، 5، 7، 10، 15، 35، 56 و 75 دقيقة بعد FITC-حبوب الحقن. تشير الأرقام إلى نقاط زمنية. أرقام بين قوسين تشير إلى عدد عينة. نقاط الوقت المتبقي من الخط الأحمر العمودي تشير حقننقاط زمنية (في 0، 11، 22، 33، 44 و 55 دقيقة). ويتميز كل الفأر مع لون مختلف. للحصول على مجموعات الدم متتابعة اتبع السهام. مربعات رمادي إشارة عندما يجب أن يكون مستعدا الماوس المقبل للتخدير isoflurane وقبل الحقن. باستخدام هذا البروتوكول الحد الأدنى من الوقت بين 2 مجموعات الدم من الفئران مختلفة هي 1 دقيقة.

Watch this Scientific Journal Video about A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice at JoVE.com

A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice (Video) | JoVE

قياس معدل الترشيح الكبيبي (GFR) هو المعيار الذهبي لتقييم وظائف الكلى. هنا نحن تصف طريقة الإنتاجية العالية التي تسمح بتحديد GFR في الفئران واعية باستخدام حقنة واحدة بلعة، وتحديد فلوريسئين ثيوسيانات (FITC)، حبوب في البلازما وحساب GFR بواسطة نموذج الاضمحلال الأسي على مرحلتين.

وهناك طريقة عالية الإنتاجية لقياس معدل الترشيح الكبيبي في الفئران وإدراكا

The measurement of  glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function  assessment. Currently, investigators determine GFR by ...

Research

JoVE Journal

Biology

A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae (Video) | JoVE

أسلوب الإنتاجية العالية عالميا لدراسة مورفولوجية عضية في البيرة س.

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization (Video) | JoVE

أسلوب الإنتاجية العالية للحصول على الحيوانات المنوية الحفظ بالتبريد واسماك الزرد في المختبر التسميد

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA (Video) | JoVE

سريع سرعة عالية طريقة لرسم الخرائط Ribonucleoproteins (RNPs) على مرنا ما قبل الإنسان

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

High-Throughput Measurement and Classification of Organic P in Environmental Samples

High-Throughput Measurement and Classification of Organic P in Environmental Samples (Video) | JoVE

عالية الإنتاجية قياس وتصنيف ف العضوية في العينات البيئية

Many types of organic phosphorus (P) molecules exist in environmental samples1.  Traditional P measurements do not detect these organic P compounds since ...

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping (Video) | JoVE

الايس كاب : منهج في تزايد Arabidopsis الطماطم والنباتات في لوحات 96 - جيدا لالرفيع المناولة التنميط الجيني

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method (Video) | JoVE

الإنتاجية العالية للبروتينات غشاء البلورة باستخدام أسلوب Bicelle Lipidic

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry (Video) | JoVE

قياس معدل الأيض في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; باستخدام قياس التنفس

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Physiology Lab Demonstration: Glomerular Filtration Rate in a Rat

Physiology Lab Demonstration: Glomerular Filtration Rate in a Rat (Video) | JoVE

علم وظائف الأعضاء مختبر مظاهرة: معدل الترشيح الكبيبي في الجرذ

Measurements of glomerular filtration rate (GFR), and the fractional excretion of sodium (Na) and potassium (K) are critical in assessing renal function ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes (Video) | JoVE

الإنتاجية العالية للكشف عن المغيرون الكيميائية من الجينات المشاركة ما بعد transcriptionally الخاضعة للرقابة

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate (Video) | JoVE

قياس وتحليل حمض خارج الخلية الإنتاج لتحديد معدل حال السكر

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...