Name: a high-throughput method for measurement of glomerular filtration rate in conscious mice
Uploaded: 2013-05-10T12:00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice at JoVE.com

मैं इस पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए डॉ. जेसिका डोमिंग्वेज़ Rieg धन्यवाद. इस काम अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन (वैज्ञानिक विकास अनुदान 10SDG2610034), नेफ्रोलोजी के अमेरिकन सोसायटी की एक कार्ल डब्ल्यू Gottschalk अनुसंधान अनुदान, मधुमेह के राष्ट्रीय संस्थान और तीव्र गुर्दे की चोट अनुसंधान के लिए पाचन और गुर्दा रोग ओ &#39;ब्रायन (केंद्र द्वारा समर्थित किया गया P30DK079337), और दिग्गजों मामलों के विभाग.

1. समाधान <ol><li> 0.85% NaCl: 8.5 छ NaCl / 1 एल DDH 2 ओ (8.5 छ / एल). </li><li> 0.5 मोल / एल HEPES पीएच 7.4 (DDH 2 0 से 0.5 एल में HEPES की 59.6 छ भंग करने और 10 एन NaOH का उपयोग कर 7.4 पीएच को समायोजित). </li></ol> 2. FITC-inulin इंजेक्शन समाधान की तैयारी <ol><li> पूरी तरह से भंग कर दिया जब तक 90 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करने से 0.85% NaCl (आमतौर पर 100 मिग्रा / 2 मिलीलीटर 0.85% NaCl) में 5% समाधान के लिए तैयार है और भंग करने के लिए FITC-inulin वजन. </li><li> भंग FITC-inulin के समाधान और नोट वजन तौलना. </li><li> डायलिसिस झिल्ली का एक 20 सेमी टुकड़ा (आणविक वजन कट ऑफ: 1000) में कटौती और झिल्ली से अवशिष्ट नेन 3 हटाने और बाद में कुछ एक बार फ्लश करने के लिए 30 मिनट के लिए DDH 2 ओ में डाल दिया. </li><li> डायलिसिस झिल्ली में FITC-inulin भंग भरें और closures के साथ ठीक से सील. </li><li> पूरे डायलिसिस झिल्ली वजन. </li><li> 1 एल 0.85% NaCl समाधान में डायलिसिस झिल्ली रखो और ro से कम 24 घंटे के लिए प्रकाश संरक्षित धीरे हलचलओम तापमान. </li><li> फिर पूरे डायलिसिस झिल्ली वजन और (पानी osmotically झिल्ली और अपार FITC में चलते हैं, या FITC-inulin &lt;1000 आणविक भार झिल्ली के बाहर कदम होगा बाध्य होगा, इस प्रकार, FITC-inulin के एकाग्रता काफी हद तक कम हो जाएगा) नई एकाग्रता की गणना . </li><li> नई FITC-inulin एकाग्रता (ग) निम्न सूत्र का उपयोग कर की गणना की जाती है: ग = एन / वी, जहां एन = प्रारंभिक FITC-inulin राशि, वी = नई मात्रा (डायलिसिस प्लस प्रारंभिक की मात्रा पहले और बाद में डायलिसिस टयूबिंग के वजन में अंतर FITC-Inulin समाधान). </li><li> 0.22 सुक्ष्ममापी सिरिंज फिल्टर के माध्यम से निस्पंदन द्वारा dialyzed FITC-inulin के समाधान बाँझ का उपयोग करने से पहले. </li><li> FITC-inulin 4 पर प्रकाश (एल्यूमीनियम पन्नी) से सुरक्षित रखें डिग्री सेल्सियस Dialyzed और FITC-inulin निष्फल करने के लिए 2 सप्ताह तक के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. FITC-inulin के कुछ मिनट के लिए 90 डिग्री सेल्सियस पर फिर हीटिंग द्वारा भंग किया जा सकता भाग लिया. </li></ol> नोट: यदि का उपयोगडायलिसिस की आवश्यकता नहीं है जो FITC-sinistrin 16-18, डायलिसिस के लिए आवश्यक सभी कदम छोड़ी जा सकती हैं. 3. इंजेक्शन और रक्त संग्रह <ol><li> प्रयोग से पहले चूहों के शरीर के वजन (BW) ले लो. </li><li> Isoflurane के साथ संक्षिप्त चूहों anesthetize. </li><li> 6 चूहों के उच्च throughput के लिए 3 चित्र में प्रदान प्रोटोकॉल का पालन करें. </li><li> (पहले के लिए सुई में एक G30 साढ़े को स्विचिंग तो सुई में एक G26 साढ़े उपयोग करके 100 μl हैमिल्टन सिरिंज से हवाई बुलबुले को दूर सुई में एक G30 साढ़े उपयोग करके retroorbital जाल 24 में dialyzed FITC-inulin के 2 ग्राम / μl bw इंजेक्षन इंजेक्शन). </li><li> एक बार कैंची से माउस पूंछ से 1 मिमी कटौती और 35, 15, 10, 5, 3 पर 7 खून इकट्ठा, 56 और ना हेपरिन minicapillaries में इंजेक्शन के बाद 75 मिनट. चा मुहर के साथ रक्त संग्रह के बाद सील minicapillaries. </li><li> प्रकाश से संरक्षित नमूनों रखें. </li><li> सील minicapillaries अंदर hemato रखोcrit के capillaries और 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र. </li><li> एक 0.2 मिलीलीटर ट्यूब में pipetting द्वारा एक हीरे कटर और हस्तांतरण पूरे प्लाज्मा का उपयोग करके minicapillaries तोड़ो. </li><li> नया 0.2 मिलीलीटर ट्यूब (नमूने 4 में रात भर संग्रहीत किया जा सकता डिग्री सेल्सियस प्रतिदीप्ति माप के लिए) में प्लाज्मा के 2 μl और 18 μl 0.5 मोल / एल HEPES (7.4 पीएच) का उपयोग कर एक 1:10 कमजोर पड़ने बनाओ. </li><li> डुप्लिकेट में NanoDrop 3300 के साथ पतला नमूना के 2 μl उपाय. साधन का विवरण और उपयोग यहाँ 5 वर्णित है. </li></ol> 4. मानकों की तैयारी <ol><li> हेपरिन लेपित हेमाटोक्रिट केशिकाओं में एक ही पृष्ठभूमि तनाव के चूहों से रक्त ले लीजिए, नीचे स्पिन और 0.5 मोल / एल HEPES (7.4 पीएच) के साथ 1:10 पतला, आमतौर पर 80 μl प्लाज्मा + 720 μl HEPES. </li><li> निम्न मानक dilutions के पाने के लिए पतला माउस प्लाज्मा साथ FITC-inulin इंजेक्शन समाधान पतला: 01:10: 10 μl undiluted FITC-inulin के समाधान + 90 μl पतला माउस प्लाज्मा 1:100: 10 और म्यू, एल (1:10) समाधान + 90 μl पतला माउस प्लाज्मा 1:1,000: 10 μl (1:100) समाधान + 90 μl पतला माउस प्लाज्मा 1:2,000: 30 μl (1:1) समाधान + 30 μl पतला माउस प्लाज्मा 1:10,000: 10 μl (1:5) समाधान +40 μl पतला माउस प्लाज्मा 1:20,000: 20 μl (1:1) समाधान + 20 μl पतला माउस प्लाज्मा 1:100,000: 10 μl (1:5) समाधान +40 μl पतला माउस प्लाज्मा मानकों की एकाग्रता डायलिसिस पर निर्भर करेगा और हमेशा FITC-inulin के प्रत्येक तैयारी के लिए अलग अलग हो जाएगा. यह नया मानक वक्र हर समय के लिए एकाग्रता दर्ज करने के लिए आवश्यक है. </li><li> यहां 15, 20 में वर्णित और प्रतिनिधि परिणाम धारा में दिखाया के रूप में एक दो चरण घातीय क्षय समारोह का उपयोग करके उपयुक्त सॉफ्टवेयर (जैसे GraphPad चश्मे) के साथ जीएफआर गणना करने के लिए डेटा का विश्लेषण. </li></ol>

<ol>
	<li>Bauer, J. H., Brooks, C. S., Burch, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+appraisal+of+creatinine+clearance+as+a+measurement+of+glomerular+filtration+rate.">Clinical appraisal of creatinine clearance as a measurement of glomerular filtration rate.</a> Am. J. Kidney Dis. 2 (3), 337-346 (1982).</li><li>Carrie, B. J., Golbetz, H. V., Michaels, A. S., Myers, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creatinine:+an+inadequate+filtration+marker+in+glomerular+diseases.">Creatinine: an inadequate filtration marker in glomerular diseases.</a> Am. J. Med. 69 (2), 177-182 (1980).</li><li>Chasis, H., Ranges, H. A., Goldring, W., Smith, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Control+of+Renal+Blood+Flow+and+Glomerular+Filtration+in+Normal+Man.">The Control of Renal Blood Flow and Glomerular Filtration in Normal Man.</a> J. Clin. Invest. 17 (5), 683-697 (1938).</li><li>Darling, I. M., Morris, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+"true"+creatinine+clearance+in+rats+reveals+extensive+renal+secretion.">Evaluation of "true" creatinine clearance in rats reveals extensive renal secretion.</a> Pharm. Res. 8 (10), 1318-1322 (1991).</li><li>Dunn, S. R., Qi, Z., Bottinger, E. P., Breyer, M. D., Sharma, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utility+of+endogenous+creatinine+clearance+as+a+measure+of+renal+function+in+mice.">Utility of endogenous creatinine clearance as a measure of renal function in mice.</a> Kidney Int. 65 (5), 1959-1967 (2004).</li><li>Eisner, C., Faulhaber-Walter, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Major+contribution+of+tubular+secretion+to+creatinine+clearance+in+mice.">Major contribution of tubular secretion to creatinine clearance in mice.</a> Kidney Int. 77 (6), 519-526 (2010).</li><li>Faulhaber-Walter, R., Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+A1+adenosine+receptors+augments+diabetic+hyperfiltration+and+glomerular+injury.">Lack of A1 adenosine receptors augments diabetic hyperfiltration and glomerular injury.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 19 (4), 722-730 (2008).</li><li>FINGL, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubular+excretion+of+creatinine+in+the+rat.">Tubular excretion of creatinine in the rat.</a> Am. J. Physiol. 169 (2), 357-362 (1952).</li><li>Keppler, A., Gretz, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+creatinine+determination+in+mice+and+rats:+an+enzymatic+method+compares+favorably+with+a+high-performance+liquid+chromatography+assay.">Plasma creatinine determination in mice and rats: an enzymatic method compares favorably with a high-performance liquid chromatography assay.</a> Kidney Int. 71 (1), 74-78 (2007).</li><li>Levey, A. S., Perrone, R. D., Madias, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+creatinine+and+renal+function.">Serum creatinine and renal function.</a> Annu. Rev. Med. 39, 465-490 (1988).</li><li>Lorenz, J. N., Gruenstein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+nonradioactive+method+for+evaluating+single-nephron+filtration+rate+using+FITC-inulin.">A simple, nonradioactive method for evaluating single-nephron filtration rate using FITC-inulin.</a> Am. J. Physiol. 276, 172-177 (1999).</li><li>Meyer, M. H., Meyer, R. A., Gray, R. W., Irwin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Picric+acid+methods+greatly+overestimate+serum+creatinine+in+mice:+more+accurate+results+with+high-performance+liquid+chromatography.">Picric acid methods greatly overestimate serum creatinine in mice: more accurate results with high-performance liquid chromatography.</a> Anal. Biochem. 144 (1), 285-290 (1985).</li><li>Qi, Z., Breyer, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+glomerular+filtration+rate+in+conscious+mice.">Measurement of glomerular filtration rate in conscious mice.</a> Methods Mol. Biol. 466, 61-72 (2009).</li><li>Qi, Z., Whitt, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+determination+of+glomerular+filtration+rate+in+conscious+mice+using+FITC-inulin+clearance.">Serial determination of glomerular filtration rate in conscious mice using FITC-inulin clearance.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 286 (3), F590-F596 (2004).</li><li>Schock-Kusch, D., Sadick, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcutaneous+measurement+of+glomerular+filtration+rate+using+FITC-sinistrin+in+rats.">Transcutaneous measurement of glomerular filtration rate using FITC-sinistrin in rats.</a> Nephrol. Dial Transplant. 24 (10), 2997-3001 (2009).</li><li>Schock-Kusch, D., Xie, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcutaneous+assessment+of+renal+function+in+conscious+rats+with+a+device+for+measuring+FITC-sinistrin+disappearance+curves.">Transcutaneous assessment of renal function in conscious rats with a device for measuring FITC-sinistrin disappearance curves.</a> Kidney Int. 79 (11), 1254-1258 (2011).</li><li>Schreiber, A., Shulhevich, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcutaneous+measurement+of+renal+function+in+conscious+mice.">Transcutaneous measurement of renal function in conscious mice.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 303 (5), F783-F788 (2012).</li><li>Shemesh, O., Golbetz, H., Kriss, J. P., Myers, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+creatinine+as+a+filtration+marker+in+glomerulopathic+patients.">Limitations of creatinine as a filtration marker in glomerulopathic patients.</a> Kidney Int. 28 (5), 830-838 (1985).</li><li>Sturgeon, C., Sam, A. D., Law, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+determination+of+glomerular+filtration+rate+by+single-bolus+inulin:+a+comparison+of+estimation+analyses.">Rapid determination of glomerular filtration rate by single-bolus inulin: a comparison of estimation analyses.</a> J. Appl. Physiol. 84 (6), 2154-2162 (1998).</li><li>Vallon, V., Blantz, R. C., Thomson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+hyperfiltration+and+the+salt+paradox+in+early+[corrected]+type+1+diabetes+mellitus:+a+tubulo-centric+view.">Glomerular hyperfiltration and the salt paradox in early [corrected] type 1 diabetes mellitus: a tubulo-centric view.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 14 (2), 530-537 (2003).</li><li>Vallon, V., Eraly, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+the+organic+anion+transporter+OAT3+in+renal+creatinine+secretion+in+mice.">A role for the organic anion transporter OAT3 in renal creatinine secretion in mice.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 302 (10), F1293-F1299 (2012).</li><li>Vallon, V., Schroth, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosine+A(1)+receptors+determine+glomerular+hyperfiltration+and+the+salt+paradox+in+early+streptozotocin+diabetes+mellitus.">Adenosine A(1) receptors determine glomerular hyperfiltration and the salt paradox in early streptozotocin diabetes mellitus.</a> Nephron. Physiol. 111 (1), 30-38 (2009).</li><li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retro-orbital+injections+in+mice.">Retro-orbital injections in mice.</a> Lab Anim. (NY. 40 (5), 155-160 (2011).</li></ol>

लेखक थर्मो फिशर साइंटिफिक द्वारा इस प्रकाशन की लागत को कवर करने के लिए धन प्राप्त किया.

वर्तमान अध्ययन दो चरण घातीय क्षय द्वारा 8 रक्त के नमूनों में रोशनी की एक सांस में इंजेक्शन और विश्लेषण द्वारा सचेत चूहों में जीएफआर के निर्धारण के लिए एक तकनीक का वर्णन करता है. 1 माउस में एक जीएफआर माप 75 मिनट लगते हैं. एक विशेष प्रवाह चार्ट का उपयोग करके, यह 130 मिनट में 6 चूहों की जीएफआर मापने के लिए संभव है. यह प्रति दिन 4 बार इस प्रवाह चार्ट प्रोटोकॉल को दोहराने और 24 चूहों में जीएफआर मापने के लिए संभव है. यह तेज और जांचकर्ताओं पूंछ नस पंचर की तुलना में प्रदर्शन करने के लिए आसान है, जो एक छोटे पूंछ कटाव बजाय पूंछ नस पंचर, से रक्त एकत्रित करने के लिए संभव है कि इसलिए हम इस पद्धति को संशोधित किया. 10 μl हेमाटोक्रिट केशिकाओं और एक 1:10 कमजोर पड़ने का उपयोग करके, यह &lt;100 μl के लिए आवश्यक रक्त की कुल मात्रा को कम करने के लिए संभव है. अंत में, प्रतिदीप्ति पतला नमूना 1-2 μl में प्रतिदीप्ति के निर्धारण की अनुमति देता है जो एक NanoDrop 3300 fluorospectrometer, का उपयोग कर मापा जाता है. इस विधि दिलचस्पी investigato दे देंगेआर ए सच जीएफआर मूल्य. इसके विपरीत, चूहों में क्रिएटिनिन माप &quot;क्रिएटिनिन अंधा रेंज&quot; और विशिष्ट और संवेदनशील दृढ़ संकल्प से संबंधित कठिनाइयों सहित कई कमजोरियों है. गुर्दे समारोह के 50% से 19 खो दिया है जब तक सीरम क्रिएटिनिन सामान्य श्रेणी में रहता है क्योंकि &quot;क्रिएटिनिन अंधा श्रृंखला&quot; जीएफआर के लिए एक मार्कर के रूप में अपने कार्य को सीमित करता है. जीन एक्स के एक पीटकर माउस संभालने के एक जंगली प्रकार माउस की तुलना में काफी कम जीएफआर (40%), एक होता है: कई जांचकर्ताओं गुर्दे शरीर विज्ञान और pathophysiology के अध्ययन के लिए अपने अनुसंधान में आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों का उपयोग करने के बाद, यह निम्न समस्या भालू प्लाज्मा क्रिएटिनिन की तुलना द्वारा सरल स्क्रीनिंग इस अंतर का पता नहीं लगा होगा. जीएफआर दृढ़ संकल्प का एक अच्छा सही विधि के लिए की जरूरत GFR में मतभेद बनने के छोटे और अधिक महत्वपूर्ण हो जाता है. चूहे व्यावसायिक रूप से हस्तक्षेप कि उनके प्लाज्मा और मूत्र में गैर क्रिएटिनिन chromagens की उच्च सांद्रताउपलब्ध क्रिएटिनिन assays है. एक परिणाम के रूप में, प्लाज्मा में क्षारीय picrate Jaffe प्रतिक्रिया अत्यधिक क्रिएटिनिन एकाग्रता पर आधारित हैं जो assays के उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) दृढ़ संकल्प 6, 13 के साथ तुलना. एक और सीमा है कि सीरम क्रिएटिनिन HPLC के दृढ़ संकल्प की तुलना में नीचे कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध assays की सीमा का पता लगाने है. हालांकि, एंजाइमी प्रतिक्रियाओं जांचकर्ताओं का उपयोग करके चूहों 10, 22 में प्लाज्मा क्रिएटिनिन का निर्धारण करने में सक्षम थे. इसी तरह की एक रेंज में जीएफआर एक तुलनीय एकल सांस में इंजेक्शन विधि के साथ ही मूत्र FITC-inulin निकासी 14 का उपयोग कर जागरूक चूहों में पाए गए. उनके प्रोटोकॉल के विपरीत, पूंछ कटाव का उपयोग कर हमारे प्रोटोकॉल विशेष सावधानियों पूंछ नस या saphenous नस पंचर की तुलना पोत अखंडता की रक्षा करने की आवश्यकता नहीं है. FITC-inulin के आधार पर मूत्र / प्लाज्मा निकासी के लिए यह शल्य चिकित्सा द्वारा दो आसमाटिक मील प्रत्यारोपण करने के लिए आवश्यक हैnipumps. दो पंपों पृष्ठभूमि से स्पष्ट रूप से अलग पहचाना जाता है जो उच्च पर्याप्त स्थिर राज्य प्लाज्मा FITC-inulin सांद्रता को प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं. यह भी एक पूर्ण और समय पर मूत्र संग्रह के लिए चयापचय पिंजरों के उपयोग की आवश्यकता है. पिंजरों अन्यथा rinsing के बिना होता है, जो FITC-inulin के 25-37% की एक हानि के लिए खाते में rinsed करने की आवश्यकता है. इस FITC-inulin विधि का उपयोग कर के नुकसान सीमित हैं. जांचकर्ता निम्नलिखित के बारे में पता होना चाहिए: (I) FITC के समाधान के इंजेक्शन के लिए इस्तेमाल सिरिंज में कोई हवाई बुलबुले हैं विश्वास दिलाता हूं कि, (ख) पूरा पश्चनेत्रगोलकीय इंजेक्शन इंजेक्शन राशि की गणना जीएफआर निर्धारित करता है क्योंकि हासिल की है, और किया जाना चाहिए ( ग) चूहों, तो गुर्दे एकाग्रता की क्षमता का एक परिणाम के रूप में एक बहुत ही उच्च FITC-inulin एकाग्रता होगा जो मूत्र के साथ रक्त के नमूने संदूषित 75 मिनट जीएफआर प्रयोग के दौरान सबसे अधिक संभावना पेशाब से बचना होगा. जनरल फायदे ओच इस FITC-inulin विधि निम्नलिखित शामिल हैं: (क) यह (ii) यह (तीन) परख, होश में चूहों में किया जा सकता है, एक ही माउस में माप कई बार दोहराने के लिए संभव है, एक गैर रेडियोधर्मी तकनीक है ( iv) कोई मूत्र संग्रह की आवश्यकता है, और (v) एक उच्च throughput विकल्प का उपयोग किया जा सकता है. एक सांस में इंजेक्शन के लिए नुकसान अब उपलब्ध है और एक विशेष छोटी डिवाइस 18 का उपयोग कर transcutaneously मापा जा सकता है जो एक बेहतर FITC के मार्कर, FITC-sinistrin, का उपयोग करके दूर किया जा सकता है जो FITC-inulin के डायलिसिस की जरूरत है, शामिल हैं. जीएफआर मापा जाता है, भले ही यह इस विधि के साथ तरल पदार्थ या आयनों का आंशिक उत्सर्जन को मापने के लिए संभव नहीं है. साथ में ले ली, इस विधि जागरूक चूहों में जीएफआर को मापने के लिए एक उच्च throughput विधि की व्यवहार्यता प्रदान करता है. इस प्रकार, इस तकनीक चूहों में गुर्दे समारोह का निर्धारण करने में रुचि रखते हैं, जो अन्य जांचकर्ताओं के लिए ब्याज की हो सकती है.

ग्लोमेर्युल्स में प्लाज्मा अल्ट्राफिल्ट्रेट के गठन की दर गुर्दे समारोह (glomerular निस्पंदन दर, जीएफआर) के मूल्यांकन के लिए आधार बन गया है. जीएफआर निर्धारित करने के लिए आदर्श मार्कर आज़ादी, फ़िल्टर स्रावित या reabsorbed न तो और metabolized नहीं किया जाना चाहिए. इस तरह एक व्यवहार inulin के लिए सच हो पाया था, और inulin निकासी जीएफआर 3 के निर्धारण के लिए एक सोने का मानक बन गया है. क्रिएटिनिन की निकासी बड़े पैमाने पर मानव और जानवरों में जीएफआर के एक उपाय के रूप में प्रयोग किया जाता है जबकि, क्रिएटिनिन एक आदर्श जीएफआर मार्कर की आवश्यकताओं को पूरा नहीं करता है. लगभग 10 - मनुष्य में क्रिएटिनिन की मंजूरी के 40% सक्रिय ट्यूबलर स्राव 1, 11 का परिणाम है, और क्रिएटिनिन का गुर्दे स्राव भी चूहों और चूहों 4, 7, 9, 22 में प्रमुख है. वृक्क रोग जीएफआर 1, 2 के एक मार्कर के रूप में अपने मूल्य सीमा है, जो क्रिएटिनिन की ट्यूबलर स्राव बढ़ जाता है. हम पहले कि जैविक आयनों ट्रांसपोर्टर isoform से पता चला है3 (OAT3) murine गुर्दे क्रिएटिनिन स्राव 22 के लिए योगदान देता है. हालांकि, inulin मंजूरी आम तौर पर रेडियोधर्मी लेबल inulin (3 एच या 14 सी) के उपयोग की आवश्यकता है. inulin के रेडियोधर्मी दृढ़ संकल्प anesthetized और होश दोनों चूहों में प्रयोग किया जाता है, लेकिन कई सुरक्षा नियमों और रेडियोधर्मी आइसोटोप के उपयोग के साथ निहित सख्त से निपटने के मुद्दों का नुकसान बंदरगाहों किया जा सकता है. उन पंक्तियों के साथ, जीएफआर के निर्धारण के लिए शल्य चिकित्सा की निकासी की तैयारियाँ समय लेने के साथ ही प्रकृति में टर्मिनल हैं. 1999 में लोरेन्ज एट अल. 12 anesthetized चूहों में एक नेफ्रॉन जीएफआर के एक मार्कर के रूप FITC-inulin की शुरुआत की. पांच साल बाद क्यूई एट अल. 15 FITC-inulin का उपयोग करके जागरूक चूहों में पूरे गुर्दे जीएफआर निर्धारित की. वैकल्पिक प्रोटोकॉल अब जागरूक और anesthetized चूहों में जीएफआर को मापने के लिए एक exogenous मार्कर के रूप FITC-inulin के प्रयोग कर रहे हैं. इन प्रोटोकॉल प्रतिदीप्ति detecti का उपयोग करके रेडियोधर्मी inulin के संवेदनशीलता को बनाए रखनेपर और एक रेडियोधर्मी लेबल मार्कर के साथ काम करने का नुकसान circumventing. FITC-inulin परख NanoDrop 3300 fluorospectrometer की microvolume क्षमता का लाभ लेने के लिए दूसरों 7, 8 और हमें 22, 23 के द्वारा संशोधित किया गया था. इस जीएफआर माप प्रति &lt;100 μl रक्त की जरूरत के लिए कुल नमूना मात्रा को कम करने की अनुमति देता है. विधि और इस प्रकाशन में प्रदान की उच्च throughput प्रोटोकॉल के साथ, हम प्रति दिन 24 सचेत चूहों में मापने जीएफआर की व्यवहार्यता का प्रदर्शन. इस तकनीक murine जीएफआर का अध्ययन अन्य जांचकर्ताओं के लिए उपयोगी हो सकता है और हम इसे ऐसे क्रिएटिनिन और रक्त यूरिया नाइट्रोजन के रूप में गुर्दे समारोह के लिए सूचकांक के रूप में कम सटीक तरीकों को बदल देगा उम्मीद है.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-inulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3272</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7706</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Webster Veterinary</td>
			<td>78366551</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis membrane (MWCO 1000)</td>
			<td>Spectrum Laboratories</td>
			<td>132636</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane closure</td>
			<td>Spectrum Laboratories</td>
			<td>132736</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80 &mu;l Hematocrit capillaries</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>22362566</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematocrit centrifuge</td>
			<td>IEC</td>
			<td>Micro-MB</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &mu;l Na+-Heparin minicaps</td>
			<td>Hirschmann</td>
			<td>9000210</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (100 &mu;l)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80601</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorospectrometer</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>NanoDrop 3300</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter (0.22 &mu;m)</td>
			<td>Spectrum Laboratories</td>
			<td>880-26464-UE</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealant</td>
			<td>Ch&acirc;-seal</td>
			<td>510</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles (G26 &frac12; and G30 &frac12;)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305111 &amp; 305106</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput method for measurement of glomerular filtration rate in conscious mice

glomerular निस्पंदन दर (GFR) की माप के गुर्दे समारोह के मूल्यांकन में स्वर्ण मानक है. वर्तमान में, जांचकर्ताओं अंतर्जात biomarker के क्रिएटिनिन या exogenously लागू रेडियोधर्मी लेबल inulin (3 एच या 14 सी) के स्तर को मापने के द्वारा जीएफआर निर्धारित करते हैं. क्रिएटिनिन ~ 50 कुल गुर्दे क्रिएटिनिन उत्सर्जन का% और इसलिए क्रिएटिनिन के लिए समीपस्थ ट्यूबलर स्राव खातों एक विश्वसनीय जीएफआर मार्कर नहीं है कि पर्याप्त कमी है. प्रदर्शन प्रयोग पर निर्भर करता है, inulin निकासी एक अंतःशिरा ही सांस में इंजेक्शन या निरंतर प्रेरणा (नसों या आसमाटिक minipump) द्वारा निर्धारित किया जा सकता है. दोनों दृष्टिकोण क्रमशः, प्लाज्मा या प्लाज्मा और मूत्र के संग्रह की आवश्यकता होती है. रेडियोधर्मी लेबल inulin के अन्य कमियां आइसोटोप का उपयोग, पशुओं का समय लेने वाली शल्य चिकित्सा की तैयारी, और एक टर्मिनल प्रयोग की आवश्यकता शामिल हैं. यहाँ हम का एक ही सांस में इंजेक्शन का उपयोग करता है जो एक विधि का वर्णनfluorescein आइसोथियोसाइनेट-(FITC) लेबल inulin और पतला प्लाज्मा 1-2 μl में अपनी प्रतिदीप्ति की माप. माउस प्रति 8 रक्त संग्रह के साथ, एक दो डिब्बे मॉडल को लागू करके, यह एक विशेष कार्य प्रवाह प्रोटोकॉल का उपयोग कर प्रति दिन 24 चूहों में जीएफआर के लिए उपाय करने के लिए संभव है. यह पद्धति केवल एक गैर रोका और जाग माउस में एकत्र की जा रही सभी रक्त के नमूनों के साथ संक्षिप्त isoflurane संज्ञाहरण की आवश्यकता है. एक और लाभ यह है कि यह कई महीनों और उपचार (यानी आहार में परिवर्तन या दवा अनुप्रयोगों के साथ रखा प्रयोग कर) की अवधि में चूहों का पालन करने के लिए संभव है. हम माप जीएफआर की इस तकनीक माउस गुर्दे समारोह के अध्ययन के अन्य जांचकर्ताओं के लिए उपयोगी है और ऐसे प्लाज्मा क्रिएटिनिन और रक्त यूरिया नाइट्रोजन के रूप में गुर्दे समारोह, आकलन से कम सही तरीके बदल देगा उम्मीद है.

जीएफआर निम्न सूत्र का उपयोग कर की गणना की जाएगी: जीएफआर n = / (A/K1 + B/K2), जहां एन = इंजेक्शन राशि (एन = ग • वी, जहां ग = FITC-inulin एकाग्रता, वी = इंजेक्शन मात्रा) एक = Span1, उन्मूलन के y-अवरोधन उन्मूलन के लिए लगातार K1 के = क्षय बी = Span2, y अवरोधन वितरण की वितरण के लिए K2 = क्षय स्थिर नोट: एक, K1, बी और K2 GraphPad चश्मे, दो चरण घातीय क्षय विश्लेषण करने में सक्षम हर सॉफ्टवेयर द्वारा दिए गए संक्षिप्त रूपों कर रहे हैं इस्तेमाल किया जा सकता है, तथापि, अन्य वैज्ञानिक सॉफ्टवेयर विभिन्न रूपों का उपयोग कर सकते हैं. प्लाज्मा FITC-inulin सांद्रता पर आधारित है जो एक दो चरण घातीय क्षय वक्र फिट, काम करके, चित्र 1 में दिखाया गया है एक के लिए तुलनीय एक वक्र प्राप्त किया जाना चाहिए. ऊपर दिखाए सूत्र (द्वारा जीएफआर गिना जा रहा है और यहाँ के रूप में वर्णित &lt;)&gt; 20 समर्थन टाइप 1 मधुमेह (चित्रा 2) के साथ चूहों में पाए जाने के रूप में गुर्दे समारोह 15 या केशिकागुच्छीय hyperfiltration 8, 23 की हानि का पता लगाने के लिए अनुमति देता है. <img alt="चित्रा 1" src="/files/ftp_upload/50330/50330fig1.jpg" /> चित्रा 1. होश में चूहों में जीएफआर मापने के लिए, एक एकल खुराक नसों में इंजेक्शन के बाद FITC-inulin के प्लाज्मा कैनेटीक्स प्रयोग किया जाता है. जीएफआर की गणना के लिए, एक दो डिब्बे मॉडल कार्यरत है. दो डिब्बे मॉडल में, प्रारंभिक तेजी से क्षय चरण कोशिकी द्रव को intravascular डिब्बे से FITC-inulin के पुनर्वितरण का प्रतिनिधित्व करता है. FITC-inulin एकाग्रता में धीमी क्षय के साथ बाद में चरण,, मुख्य रूप से प्लाज्मा से प्रणालीगत निकासी को दर्शाता है. <img alt="चित्रा 2" src="/files/ftp_upload/50330/50330fig2.jpg" /> चित्रा 2. Detectioएन जंगली प्रकार चूहों में मधुमेह hyperfiltration की. मधुमेह (STZ, लगातार 5 दिनों के लिए 50 मिलीग्राम / किग्रा) streptozotocin की intraperitoneal आवेदन द्वारा प्रेरित किया गया था मैं टाइप करें. जीएफआर पहले (बेसल) और 5 हफ्तों मधुमेह के शामिल होने के बाद निर्धारित किया गया था. Tubuloglomerular प्रतिक्रिया के कारण, समीपस्थ पुनःअवशोषण में एक प्राथमिक वृद्धि जल्दी मधुमेह hyperfiltration 21 जंगली प्रकार चूहों में प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है कि एक खोज का कारण बनता है (एन = 10, पी &lt;0.01 बनाम बेसल ही माउस). <img alt="चित्रा 3" src="/files/ftp_upload/50330/50330fig3.jpg"/> चित्रा 3. 6 चूहों का एक सेट में जीएफआर की माप. एक सांस में इंजेक्शन विधि द्वारा पूरे गुर्दे जीएफआर मापने के लिए फ्लो चार्ट, 8 रक्त के नमूने 10, 15, 35, 56 और 75 मिनट के बाद, 7, 3, 5 में एकत्र किया जाना चाहिए FITC-inulin इंजेक्शन. नंबर समय अंक से संकेत मिलता है. कोष्ठक में संख्या नमूना संख्या से संकेत मिलता है. खड़ी लाल रेखा का समय बचा अंक इंजेक्शन का संकेतसमय अंक (0, 11, 22, 33, 44 और 55 मिनट). प्रत्येक माउस एक अलग रंग से चिह्नित किया गया है. अनुक्रमिक रक्त संग्रह प्राप्त करने के लिए तीर का पालन करें. ग्रे बक्से अगले माउस इंजेक्शन के लिए पहले isoflurane संज्ञाहरण के लिए तैयार रहना चाहिए जब संकेत मिलता है. इस प्रोटोकॉल का उपयोग विभिन्न चूहों से 2 रक्त संग्रह के बीच न्यूनतम समय 1 मिनट है.

Watch this Scientific Journal Video about A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice at JoVE.com

A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

Glomerular निस्पंदन दर (GFR) का मापन गुर्दे समारोह के मूल्यांकन के लिए स्वर्ण मानक है. यहाँ हम एक दो चरण घातीय क्षय मॉडल के आधार पर प्लाज्मा और जीएफआर की गणना में एक ही सांस में इंजेक्शन, fluorescein आइसोथियोसाइनेट के निर्धारण (FITC) inulin का उपयोग करके जागरूक चूहों में जीएफआर के निर्धारण की अनुमति देता है जो एक उच्च throughput विधि का वर्णन है.

यह जानते हुए चूहे में glomerular निस्पंदन दर के मापन के लिए एक उच्च throughput विधि

The measurement of  glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function  assessment. Currently, investigators determine GFR by ...

Research

JoVE Journal

Biology

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

एक उच्च throughput के लिए विश्व स्तर पर एस cerevisiae में organelle आकारिकी अध्ययन विधि

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

Zebrafish शुक्राणु cryopreservation के लिए एक उच्च throughput और विधि इन विट्रो में निषेचन

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

मानचित्रण Ribonucleoproteins के लिए एक रैपिड मानव पूर्व mRNA पर उच्च throughput विधि (RNPs)

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

High-Throughput Measurement and Classification of Organic P in Environmental Samples

उच्च throughput मापन एवं पर्यावरण नमूने में कार्बनिक पी के वर्गीकरण

Many types of organic phosphorus (P) molecules exist in environmental samples1.  Traditional P measurements do not detect these organic P compounds since ...

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

आइस कैप: बढ़ते के लिए एक विधि Arabidopsis और उच्च throughput जीनोटाइपिंग के लिए 96 अच्छी तरह से प्लेट्स में टमाटर संयंत्रों

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Lipídic Bicelle विधि का प्रयोग झिल्ली प्रोटीन की उच्च throughput Crystallization

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

समुद्री साही युग्मनजों के उच्च throughput microinjections

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

मेटाबोलिक दर के मापन में<em&gt; ड्रोसोफिला</em&gt; Respirometry का उपयोग

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Physiology Lab Demonstration: Glomerular Filtration Rate in a Rat

फिजियोलॉजी लैब प्रदर्शन: एक चूहा में glomerular निस्पंदन दर

Measurements of glomerular filtration rate (GFR), and the fractional excretion of sodium (Na) and potassium (K) are critical in assessing renal function ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

पोस्ट-transcriptionally विनियमित जीन का रासायनिक Modulators के लिए उच्च throughput स्क्रीनिंग

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...