Name: three-dimensional imaging of nociceptive intraepidermal nerve fibers in human skin biopsies
Uploaded: 2013-04-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Imaging of Nociceptive Intraepidermal Nerve Fibers in Human Skin Biopsies at JoVE.com

Ce travail a été financé par les Instituts de subventions de la Santé nationale K08 NS061039-01A2, le Programme de recherche en neurologie et Discovery, et l&#39;Institut Alfred Taubman Medical Research de l&#39;Université du Michigan. Ce travail utilise la morphologie et l&#39;analyse des images de base de la recherche sur le diabète Michigan et centre de formation, financée par les National Institutes of Health subvention 5P90 DK-20572 de l&#39;Institut national du diabète et des maladies digestives et rénales. Les auteurs tiennent à remercier Robinson Singleton et Gordon Smith (Université de l&#39;Utah) pour leur généreux don d&#39;échantillons de peau humaine pour soutenir le développement initial de la technique d&#39;immunohistochimie de biomarqueurs nociceptive.

Partie A: immunohistochimie Préparation de la plaque de 96 puits et la prévention de fond coloration biopsies de peau sont recueillies auprès de sujets humains et incubé pendant 12-24 heures dans la solution de fixation (paraformaldéhyde à 2% avec une solution de L-lysine 0,75 M (pH 7,4) et 0,05 mM periodate de sodium) à 4 ° C comme précédemment décrit 8. Les échantillons sont ensuite cryoprotégés en phosphate salin (PBS) tamponné avec 20% de glycérol à 4 ° C pendan...

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	<li>Lauria, G., Holland, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+innervation:+changes+with+aging,+topographic+location,+and+in+sensory+neuropathy.">Epidermal innervation: changes with aging, topographic location, and in sensory neuropathy.</a> J. Neurol. Sci. 164 (2), 172-178 (1999).</li><li>Sullivan, K. A., Hayes, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+diabetic+neuropathy.">Mouse models of diabetic neuropathy.</a> Neurobiol. Dis. 28 (3), 276-285 (2007).</li><li>McArthur, J. C., Stocks, E. A., Hauer, P., Cornblath, D. R., Griffin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+nerve+fiber+density:+normative+reference+range+and+diagnostic+efficiency.">Epidermal nerve fiber density: normative reference range and diagnostic efficiency.</a> Arch. Neurol. 55 (12), 1513-1520 (1998).</li><li>Griffin, J. W., McArthur, J. C., Polydefkis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+cutaneous+innervation+by+skin+biopsies.">Assessment of cutaneous innervation by skin biopsies.</a> Curr. Opin. Neurol. 14 (5), 655-659 (2001).</li><li>Cheng, H. T., Dauch, J. R., Hayes, J. M., Yanik, B. M., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+growth+factor/p38+signaling+increases+intraepidermal+nerve+fiber+densities+in+painful+neuropathy+of+type+2+diabetes.">Nerve growth factor/p38 signaling increases intraepidermal nerve fiber densities in painful neuropathy of type 2 diabetes.</a> Neurobiol. Dis. 45 (1), 280-287 (2012).</li><li>Lauria, G., Lombardi, R., Camozzi, F., Devigili, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+biopsy+for+the+diagnosis+of+peripheral+neuropathy.">Skin biopsy for the diagnosis of peripheral neuropathy.</a> Histopathology. 54 (3), 273-285 (2009).</li><li>Vlckova-Moravcova, E., Bednarik, J., Dusek, L., Toyka, K. V., Sommer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+validity+of+epidermal+nerve+fiber+densities+in+painful+sensory+neuropathies.">Diagnostic validity of epidermal nerve fiber densities in painful sensory neuropathies.</a> Muscle Nerve. 37 (1), 50-60 (2008).</li><li>Casanova-Molla, J., Morales, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+fluorescence+quantitation+provides+a+new+approach+to+assess+cutaneous+innervation.">Axonal fluorescence quantitation provides a new approach to assess cutaneous innervation.</a> J. Neurosci. Methods. 200 (2), 190-198 (2011).</li><li>Wang, L., Hilliges, M., Jernberg, T., Wiegleb-Edstrom, D., Johansson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+gene+product+9.5-immunoreactive+nerve+fibres+and+cells+in+human+skin.">Protein gene product 9.5-immunoreactive nerve fibres and cells in human skin.</a> Cell Tissue Res. 261 (1), 25-33 (1990).</li><li>Lauria, G., Morbin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+capsaicin+receptor+immunoreactivity+in+human+peripheral+nervous+system+and+in+painful+neuropathies.">Expression of capsaicin receptor immunoreactivity in human peripheral nervous system and in painful neuropathies.</a> J. Peripher. Nerv. Syst. 11 (3), 262-271 (2006).</li><li>Penna, G., Fibbi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+benign+prostatic+hyperplasia+stromal+cells+as+inducers+and+targets+of+chronic+immuno-mediated+inflammation.">Human benign prostatic hyperplasia stromal cells as inducers and targets of chronic immuno-mediated inflammation.</a> J. Immunol. 182 (7), 4056-4064 (2009).</li><li>Lentz, S. I., Edwards, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+(mtDNA)+Biogenesis:+Visualization+and+Duel+Incorporation+of+BrdU+and+EdU+Into+Newly+Synthesized+mtDNA+In+Vitro.">Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In Vitro.</a> J. Histochem. Cytochem. 58 (2), 207-218 (2010).</li><li>Polydefkis, M., Hauer, P., Griffin, J. W., McArthur, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+biopsy+as+a+tool+to+assess+distal+small+fiber+innervation+in+diabetic+neuropathy.">Skin biopsy as a tool to assess distal small fiber innervation in diabetic neuropathy.</a> Diabetes Technol. Ther. 3 (1), 23-28 (2001).</li><li>Lauria, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+fibre+neuropathies.">Small fibre neuropathies.</a> Curr. Opin. Neurol. 18 (5), 591-597 (2005).</li><li>Sorensen, L., Molyneaux, L., Yue, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+among+pain,+sensory+loss,+and+small+nerve+fibers+in+diabetes.">The relationship among pain, sensory loss, and small nerve fibers in diabetes.</a> Diabetes Care. 29 (4), 883-887 (2006).</li><li>Lauria, G., Morbin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+swellings+predict+the+degeneration+of+epidermal+nerve+fibers+in+painful+neuropathies.">Axonal swellings predict the degeneration of epidermal nerve fibers in painful neuropathies.</a> Neurology. 61 (5), 631-636 (2003).</li><li>Herrmann, D. N., McDermott, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+nerve+fiber+density,+axonal+swellings+and+QST+as+predictors+of+HIV+distal+sensory+neuropathy.">Epidermal nerve fiber density, axonal swellings and QST as predictors of HIV distal sensory neuropathy.</a> Muscle Nerve. 29 (3), 420-427 (2004).</li><li>Navarro, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+27:+Neural+plasticity+after+nerve+injury+and+regeneration.">Chapter 27: Neural plasticity after nerve injury and regeneration.</a> Int. Rev. Neurobiol. 87, 483-505 (2009).</li></ol>

Mesure de IENFD a été largement utilisé pour déterminer le degré de neuropathies périphériques 13,14. À l&#39;heure actuelle, le protocole le plus couramment utilisé ne mesure que les densités de fibres nerveuses qui traversent la membrane basale de l&#39;épiderme, elle ne tient pas compte de branchement axonal et / ou les modifications morphologiques des nerfs. En outre, l&#39;analyse IENFD actuelle n&#39;a pas été montré une corrélation IENFD avec la présence de la douleur chez PN 15.</...

À l&#39;heure actuelle, il est de pratique courante pour les médecins de quantifier la densité des fibres nerveuses intra-épidermique (IENFD) à partir de biopsies de peau poinçon, qui peuvent être utilisés pour diagnostiquer les petits neuropathies de fibres 3, 6-8. Les biopsies sont prises à partir de la jambe distale (DL), 10 cm au-dessus de la malléole externe, et la cuisse proximale (PT), 20 cm en dessous du épine iliaque antérieure 9. Tous IENF sont marquées d&#39;utiliser le produit de gène de la protéine 9.5 (PGP), un marqueur neuronal pan 10-12. À l&#39;heure actuelle, il est de pratique courante pour diagnostiquer petits neuropathies de fibres en utilisant IENFD déterminé par coloration avec PGP brightfield microscopie 6. En outre, plusieurs groupes de recherche ont utilisé des protocoles d&#39;immunofluorescence pour PGP immunohistochimie 7-9. Neuropathie des petites fibres est souvent associée à la douleur neuropathique. Afin de mieux comprendre le rôle de IENF indispensables pour le traitement de la douleur, nous avons développé une technique de co-label IENF totale avec des fibres qui génèrent des douleurs. Nociceptive IENF, spécifiquement Aδ et les fibres de carbone, peuvent être étudiés à travers le co-marquage de IENF avec PGP et le marqueur nociceptive, tropomyosin-récepteur-kinase A (Trk A) 5. Trk A est le récepteur de haute affinité pour le facteur de croissance du tissu nerveux qui est essentiel pour le développement de la nociception. Les fibres nerveuses nociceptives A-positifs sont des fibres Trk peptidergiques qui expriment la substance P (SP) et la calcitonine de peptide lié au gène de (CGRP). Auparavant, Lauria et ses collègues ont appliqué la technique du double étiquetage pour étudier PN, co-marquage IENF PGP-positif avec un marqueur nociceptive 10. Dans notre précédente étude, nous avons démontré que Trk IENF A-positif, mais pas Trk IENF A-négatif, ont été régulés à la hausse dans un modèle animal de la neuropathie diabétique douloureuse 5. Cette technique de co-marquage permet de comparer la quantification des IENFD nociceptive au total IENFD et la possibilité d&#39;étudier les changements morphologiques associés à PN. La capacité de visualiser nociceptive IENF et sociétésre quantification de IENFD total à IENFD nociceptive pourrait fournir une preuve objective de la présence de la douleur, et peut-être un aperçu de la gravité de la douleur associée à la PN. Cette technique est également applicable à la peau des modèles animaux. En comparaison avec les études précédentes, le protocole actuel décrit les méthodes d&#39;analyse d&#39;image 3D, créant la possibilité d&#39;éviter des erreurs qui pourraient se produire dans l&#39;analyse d&#39;images 2D.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399-4</td>
			<td>To make up 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image-IT FX Signal</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>I36933</td>
			<td>Image-IT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Gene Product 9.5 (Polyclonal rabbit)</td>
			<td>AbD Serotec</td>
			<td>7863-0504</td>
			<td>PGP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tropomyosin Related-Kinase A (Polyclonal goat)</td>
			<td>R&amp;D Systems</td>
			<td>AF1056</td>
			<td>Trk A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey &alpha;-rabbit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21206</td>
			<td>AF488 donkey &alpha;-goat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 donkey &alpha;-goat</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21447</td>
			<td>AF647 donkey &alpha;-goat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin, from Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906-100</td>
			<td>BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X- 100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td>TX-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-calibrated Loop</td>
			<td>LeLoop</td>
			<td>MP 199025</td>
			<td>inoculating Loop</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well assay plate</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3603</td>
			<td>Well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36931</td>
			<td>DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass 22x22 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-541-B</td>
			<td>Coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td>Microscope Slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Fluoview Laser Scanning Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV500</td>
			<td>Confocal Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimum Cutting Temperature</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td>OCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1850</td>
			<td>Cryostat</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional imaging of nociceptive intraepidermal nerve fibers in human skin biopsies

Une biopsie de la peau est couramment utilisé pour quantifier la densité des fibres nerveuses intraépidermiques (IENFD) pour le diagnostic de neuropathie périphérique 1,2. À l&#39;heure actuelle, il est de pratique courante de collecter 3 biopsies cutanées mm de la jambe distale (DL) et la cuisse proximale (PT) pour l&#39;évaluation des polyneuropathies dépendant de la longueur 3. Toutefois, en raison de la nature multidirectionnelle de IENFs, il est difficile d&#39;examiner chevauchement structures nerveuses à travers l&#39;analyse de l&#39;imagerie en deux dimensions (2D). Alternativement, l&#39;imagerie en trois dimensions (3D) pourrait fournir une meilleure solution à ce dilemme. Dans le présent rapport, nous présentons les méthodes d&#39;application de l&#39;imagerie 3D pour étudier neuropathie douloureuse (PN). Afin d&#39;identifier IENFs, des échantillons de peau sont traités pour l&#39;analyse d&#39;immunofluorescence d&#39;un produit de gène de la protéine 9.5 (PGP), un marqueur neuronal casserole. À l&#39;heure actuelle, il est de pratique courante pour diagnostiquer petits neuropathies de fibres en utilisant IENFD dissuaderminées par PGP immunohistochimie en utilisant la microscopie en fond clair 4. Dans la présente étude, nous avons appliqué double analyse d&#39;immunofluorescence pour identifier IENFD totale, en utilisant PGP, et IENF nociceptive, grâce à l&#39;utilisation d&#39;anticorps qui reconnaissent la tropomyosine-récepteur-kinase A, le récepteur (Trk A) une forte affinité pour le facteur de croissance nerveuse 5. Les avantages de IENF co-marquage avec PGP et Trk anticorps de prestations de l&#39;étude des PN par coloration clairement fibres PGP-positives, nociceptifs. Ces signaux de fluorescence peuvent être quantifiés pour déterminer les changements IENFD et morphologiques nociceptifs de IENF associés à PN. Les images fluorescentes sont acquises par microscopie confocale et traitées pour l&#39;analyse 3D. 3D-imagerie fournit des capacités de rotation pour analyser plus avant les modifications morphologiques associées à PN. Pris dans leur ensemble, fluorescent co-marquage, l&#39;imagerie confocale et l&#39;analyse 3D bénéficient clairement de l&#39;étude des PN.

Nous avons appliqué le protocole actuel pour étudier la morphologie des IENF dans PT et DL biopsies cutanées de patients atteints de PN. La peau, à partir de trois sujets, ont été recueillis à l&#39;Université de l&#39;Utah pour démontrer la pathomorphologie associé avec PN. Les sujets suivants: Cas 1: un homme de 51 ans avec une histoire de PN du diabète de type 2 (durée: 14 mois; score de douleur: 51); Cas 2: un homme de 56 ans avec une histoire de PN du diabète de type 2 (durée: 108 mois; score de doule...

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Three-dimensional Imaging of Nociceptive Intraepidermal Nerve Fibers in Human Skin Biopsies

Afin d&#39;étudier les changements de fibres nerveuses nociceptives (intraépidermiques IENFs) dans les neuropathies douloureuses (PN), nous avons développé des protocoles qui pourraient examiner directement les modifications morphologiques tridimensionnels observés dans IENFs nociceptifs. Analyse tridimensionnelle de IENFs a le potentiel d&#39;évaluer les changements morphologiques des IENF en PN.

L&#39;imagerie tridimensionnelle de nociceptifs fibres nerveuses intra-épidermiques dans des biopsies de peau humaine

A punch biopsy of the skin is commonly used to quantify intraepidermal nerve fiber densities (IENFD) for the diagnosis of peripheral polyneuropathy 1,2. ...

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