Name: three-dimensional imaging of nociceptive intraepidermal nerve fibers in human skin biopsies
Uploaded: 2013-04-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Imaging of Nociceptive Intraepidermal Nerve Fibers in Human Skin Biopsies at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health sovvenzioni K08 NS061039-01A2, il Programma per Neurology Research &amp; Discovery, e The A. Alfred Taubman Medical Research Institute presso l&#39;Università del Michigan. Questo lavoro utilizza la Morfologia e Image Analysis Nucleo del Michigan Diabetes Research e centro di formazione, finanziato dal National Institutes of Health di Grant 5P90 DK-20572 presso l&#39;Istituto Nazionale del Diabete e Malattie Digestive e Renali. Gli autori desiderano ringraziare Robinson Singleton e Gordon Smith (University of Utah) per la generosa donazione di campioni di pelle umana per sostenere lo sviluppo iniziale della tecnica immunoistochimica biomarcatore nocicettivo.

Parte A: Immunoistochimica Preparazione della piastra a 96 pozzetti e la prevenzione di colorazione di fondo Punch biopsie cutanee sono raccolti da soggetti umani e incubato per 12-24 ore in una soluzione di fissativo (paraformaldeide al 2% con 0,75 M soluzione di L-lisina (pH 7.4) e 0,05 mm di sodio periodate) a 4 ° C, come descritto in precedenza 8. I campioni vengono poi crioprotetti in tampone fosfato (PBS) con il 20% di glicerolo a 4 ° C per un massimo di 1 settimana, incorpor...

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	<li>Lauria, G., Holland, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+innervation:+changes+with+aging,+topographic+location,+and+in+sensory+neuropathy.">Epidermal innervation: changes with aging, topographic location, and in sensory neuropathy.</a> J. Neurol. Sci. 164 (2), 172-178 (1999).</li><li>Sullivan, K. A., Hayes, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+diabetic+neuropathy.">Mouse models of diabetic neuropathy.</a> Neurobiol. Dis. 28 (3), 276-285 (2007).</li><li>McArthur, J. C., Stocks, E. A., Hauer, P., Cornblath, D. R., Griffin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+nerve+fiber+density:+normative+reference+range+and+diagnostic+efficiency.">Epidermal nerve fiber density: normative reference range and diagnostic efficiency.</a> Arch. Neurol. 55 (12), 1513-1520 (1998).</li><li>Griffin, J. W., McArthur, J. C., Polydefkis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+cutaneous+innervation+by+skin+biopsies.">Assessment of cutaneous innervation by skin biopsies.</a> Curr. Opin. Neurol. 14 (5), 655-659 (2001).</li><li>Cheng, H. T., Dauch, J. R., Hayes, J. M., Yanik, B. M., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+growth+factor/p38+signaling+increases+intraepidermal+nerve+fiber+densities+in+painful+neuropathy+of+type+2+diabetes.">Nerve growth factor/p38 signaling increases intraepidermal nerve fiber densities in painful neuropathy of type 2 diabetes.</a> Neurobiol. Dis. 45 (1), 280-287 (2012).</li><li>Lauria, G., Lombardi, R., Camozzi, F., Devigili, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+biopsy+for+the+diagnosis+of+peripheral+neuropathy.">Skin biopsy for the diagnosis of peripheral neuropathy.</a> Histopathology. 54 (3), 273-285 (2009).</li><li>Vlckova-Moravcova, E., Bednarik, J., Dusek, L., Toyka, K. V., Sommer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+validity+of+epidermal+nerve+fiber+densities+in+painful+sensory+neuropathies.">Diagnostic validity of epidermal nerve fiber densities in painful sensory neuropathies.</a> Muscle Nerve. 37 (1), 50-60 (2008).</li><li>Casanova-Molla, J., Morales, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+fluorescence+quantitation+provides+a+new+approach+to+assess+cutaneous+innervation.">Axonal fluorescence quantitation provides a new approach to assess cutaneous innervation.</a> J. Neurosci. Methods. 200 (2), 190-198 (2011).</li><li>Wang, L., Hilliges, M., Jernberg, T., Wiegleb-Edstrom, D., Johansson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+gene+product+9.5-immunoreactive+nerve+fibres+and+cells+in+human+skin.">Protein gene product 9.5-immunoreactive nerve fibres and cells in human skin.</a> Cell Tissue Res. 261 (1), 25-33 (1990).</li><li>Lauria, G., Morbin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+capsaicin+receptor+immunoreactivity+in+human+peripheral+nervous+system+and+in+painful+neuropathies.">Expression of capsaicin receptor immunoreactivity in human peripheral nervous system and in painful neuropathies.</a> J. Peripher. Nerv. Syst. 11 (3), 262-271 (2006).</li><li>Penna, G., Fibbi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+benign+prostatic+hyperplasia+stromal+cells+as+inducers+and+targets+of+chronic+immuno-mediated+inflammation.">Human benign prostatic hyperplasia stromal cells as inducers and targets of chronic immuno-mediated inflammation.</a> J. Immunol. 182 (7), 4056-4064 (2009).</li><li>Lentz, S. I., Edwards, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+(mtDNA)+Biogenesis:+Visualization+and+Duel+Incorporation+of+BrdU+and+EdU+Into+Newly+Synthesized+mtDNA+In+Vitro.">Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In Vitro.</a> J. Histochem. Cytochem. 58 (2), 207-218 (2010).</li><li>Polydefkis, M., Hauer, P., Griffin, J. W., McArthur, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+biopsy+as+a+tool+to+assess+distal+small+fiber+innervation+in+diabetic+neuropathy.">Skin biopsy as a tool to assess distal small fiber innervation in diabetic neuropathy.</a> Diabetes Technol. Ther. 3 (1), 23-28 (2001).</li><li>Lauria, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+fibre+neuropathies.">Small fibre neuropathies.</a> Curr. Opin. Neurol. 18 (5), 591-597 (2005).</li><li>Sorensen, L., Molyneaux, L., Yue, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+among+pain,+sensory+loss,+and+small+nerve+fibers+in+diabetes.">The relationship among pain, sensory loss, and small nerve fibers in diabetes.</a> Diabetes Care. 29 (4), 883-887 (2006).</li><li>Lauria, G., Morbin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+swellings+predict+the+degeneration+of+epidermal+nerve+fibers+in+painful+neuropathies.">Axonal swellings predict the degeneration of epidermal nerve fibers in painful neuropathies.</a> Neurology. 61 (5), 631-636 (2003).</li><li>Herrmann, D. N., McDermott, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+nerve+fiber+density,+axonal+swellings+and+QST+as+predictors+of+HIV+distal+sensory+neuropathy.">Epidermal nerve fiber density, axonal swellings and QST as predictors of HIV distal sensory neuropathy.</a> Muscle Nerve. 29 (3), 420-427 (2004).</li><li>Navarro, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+27:+Neural+plasticity+after+nerve+injury+and+regeneration.">Chapter 27: Neural plasticity after nerve injury and regeneration.</a> Int. Rev. Neurobiol. 87, 483-505 (2009).</li></ol>

Misurazione di IENFD è stato ampiamente utilizzato per determinare il grado di neuropatie periferiche 13,14. Attualmente, il protocollo più comunemente usato misura solamente le densità di fibre nervose che penetrano la membrana basale dell&#39;epidermide, ma non prende in considerazione ramificazione assonale e / o modifiche morfologiche dei nervi. Inoltre, l&#39;analisi IENFD corrente non ha mostrato di correlare IENFD con la presenza di dolore in PN 15. Abbiamo pr...

Allo stato attuale, è pratica comune per i medici di quantificare intraepidermiche densità delle fibre nervose, (IENFD) da biopsie cutanee, che possono essere utilizzati per diagnosticare piccole neuropatie fibra 3, 6-8. Le biopsie sono presi dalla gamba distale (DL), 10 cm sopra il malleolo laterale, e la coscia prossimale (PT), 20 cm al di sotto della spina iliaca anteriore 9. Tutto IENF vengono etichettati utilizzando prodotto gene della proteina 9.5 (PGP), un marker neuronale padella 10-12. Al momento, si tratta di una pratica standard per la diagnosi di piccole neuropatie in fibra con IENFD determinata colorando PGP con campo chiaro microscopia 6. Inoltre, diversi gruppi di ricerca hanno utilizzato protocolli di immunofluorescenza per PGP immunoistochimica 7-9. Neuropatia Piccolo fibra è comunemente associato con dolore neuropatico. Per comprendere ulteriormente il ruolo di IENF essenziale per l&#39;elaborazione del dolore, abbiamo sviluppato una tecnica di co-label IENF totale con fibre che generano dolore. Nociceptiva IENF, specificamente Aδ e fibre C, possono essere studiati attraverso la co-etichettatura dei IENF con PGP e il marcatore nocicettivo, tropomiosina-recettore-chinasi A (Trk A) 5. Trk A è il recettore ad alta affinità per il fattore di crescita nervoso che è essenziale per lo sviluppo della nocicezione. Le fibre nervose nocicettive A-positivi Trk sono fibre peptidergici che esprimono la sostanza P (SP) e la calcitonina peptide correlato al gene (CGRP). In precedenza, Lauria e colleghi hanno applicato la tecnica della doppia etichettatura per studiare PN, co-etichettatura IENF PGP-positivo con un pennarello nocicettivo 10. Nel nostro precedente studio, abbiamo dimostrato che Trk IENF A-positivo, ma non Trk IENF A-negativo, sono stati sovraregolati in un modello animale di neuropatia diabetica dolorosa 5. Questa tecnica di co-etichettatura offre la possibilità di confrontare la quantificazione di IENFD nocicettivo al totale IENFD e la capacità di studiare i cambiamenti morfologici associati a PN. La capacità di visualizzare nocicettivo IENF e compare quantificazione di IENFD totale a IENFD nocicettivo potrebbe fornire evidenza oggettiva per la presenza di dolore, e possibilmente comprensione della gravità del dolore associato a PN. Questa tecnica è applicabile alla pelle anche di modelli animali. Rispetto agli studi precedenti, l&#39;attuale protocollo descrive i metodi per l&#39;analisi delle immagini 3D, creando l&#39;opportunità di evitare errori che potrebbero verificarsi in analisi di immagini 2D.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399-4</td>
			<td>To make up 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image-IT FX Signal</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>I36933</td>
			<td>Image-IT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Gene Product 9.5 (Polyclonal rabbit)</td>
			<td>AbD Serotec</td>
			<td>7863-0504</td>
			<td>PGP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tropomyosin Related-Kinase A (Polyclonal goat)</td>
			<td>R&amp;D Systems</td>
			<td>AF1056</td>
			<td>Trk A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey &alpha;-rabbit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21206</td>
			<td>AF488 donkey &alpha;-goat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 donkey &alpha;-goat</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21447</td>
			<td>AF647 donkey &alpha;-goat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin, from Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906-100</td>
			<td>BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X- 100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td>TX-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-calibrated Loop</td>
			<td>LeLoop</td>
			<td>MP 199025</td>
			<td>inoculating Loop</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well assay plate</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3603</td>
			<td>Well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36931</td>
			<td>DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass 22x22 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-541-B</td>
			<td>Coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td>Microscope Slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Fluoview Laser Scanning Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV500</td>
			<td>Confocal Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimum Cutting Temperature</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td>OCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1850</td>
			<td>Cryostat</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional imaging of nociceptive intraepidermal nerve fibers in human skin biopsies

Una biopsia della pelle è comunemente utilizzato per quantificare intraepidermiche densità delle fibre nervose (IENFD) per la diagnosi di polineuropatia 1,2 periferico. Attualmente, è pratica comune per raccogliere 3 millimetri biopsie dalla gamba distale (DL) e la coscia prossimale (PT) per la valutazione di polyneuropathies lunghezza-dipendenti 3. Tuttavia, a causa della natura di IENFs multidirezionale, è impegnativo per esaminare sovrapposizione strutture nervose attraverso l&#39;analisi di formazione immagine bidimensionale (2D). Alternativamente, l&#39;imaging tridimensionale (3D) potrebbe fornire una soluzione migliore per questo dilemma. Nella presente relazione, presentiamo i metodi per applicare l&#39;imaging 3D per lo studio neuropatia dolorosa (PN). Per identificare IENFs, campioni di pelle vengono elaborati per l&#39;analisi di immunofluorescenza di proteine ​​prodotto genico 9.5 (PGP), un marcatore neuronale padella. Al momento, si tratta di una pratica standard per la diagnosi di piccole neuropatie in fibra con IENFD scoraggiareminato da PGP immunoistochimica utilizzando campo chiaro microscopia 4. In questo studio, abbiamo applicato all&#39;analisi doppia immunofluorescenza per identificare IENFD totale, utilizzando PGP, e IENF nocicettiva, attraverso l&#39;uso di anticorpi che riconoscono tropomiosina-recettore-chinasi A (Trk A), il recettore ad alta affinità per il fattore di crescita nervosa 5. I vantaggi di co-colorazione IENF con anticorpi A PGP e Trk avvantaggia lo studio del PN dalla colorazione chiaramente PGP-positivi, le fibre nocicettive. Questi segnali fluorescenti possono essere quantificati per determinare nocicettivi cambiamenti IENFD e morfologiche IENF associate a PN. Le immagini fluorescenti sono acquisite da microscopia confocale ed elaborati per l&#39;analisi 3D. 3D Imaging fornisce capacità di rotazione per analizzare ulteriormente i cambiamenti morfologici associati a PN. Nel loro insieme, fluorescente co-colorazione, confocale e analisi 3D chiaramente beneficiare studio della PN.

Abbiamo applicato l&#39;attuale protocollo per studiare la morfologia di IENF in PT e DL biopsie cutanee di pazienti con PN. La pelle, da tre soggetti, è stato raccolto presso l&#39;Università dello Utah per dimostrare la Pathomorphology associata a PN. I soggetti sono: Caso 1: un 51-anno-vecchio maschio con una storia di PN di diabete di tipo 2 (durata: 14 mesi; punteggio del dolore: 51); Caso 2: un 56-anno-vecchio maschio con una storia di PN di diabete di tipo 2 (durata: 108 mesi; punteggio del dolore: 47), e causa...

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Three-dimensional Imaging of Nociceptive Intraepidermal Nerve Fibers in Human Skin Biopsies

Per studiare i cambiamenti di fibre nervose nocicettive intraepidermiche (IENFs) nelle neuropatie dolorose (PN), abbiamo sviluppato protocolli che potrebbe esaminare direttamente le variazioni morfologiche tridimensionali osservati in IENFs nocicettivi. Analisi tridimensionale IENFs ha il potenziale di valutare le variazioni morfologiche del IENF in PN.

Imaging tridimensionale di fibre nervose nocicettive intraepidermiche in biopsie cutanee umane

A punch biopsy of the skin is commonly used to quantify intraepidermal nerve fiber densities (IENFD) for the diagnosis of peripheral polyneuropathy 1,2. ...

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