Name: three-dimensional imaging of nociceptive intraepidermal nerve fibers in human skin biopsies
Uploaded: 2013-04-29T13:00:00
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この作品は、健康補助K08 NS061039-01A2の国立研究所、ミシガン大学の神経学研究·ディスカバリー、およびA.アルフレッド·トーブマン医学研究所のためのプログラムによってサポートされていました。この作品は、形態と糖尿病および消化器腎臓病研究所から健康グラント5P90 DK-20572の国立研究所によって資金を供給ミシガン糖尿病研究研修センター、の画像解析コアを使用していました。著者らは、侵害受容性バイオマーカーの免疫組織化学技術の初期開発をサポートするために、人間の皮膚のサンプルの彼らの寛大な寄付のためにロビンソンシングルトンとゴードン·スミス（ユタ大学）に感謝したいと思います。

パート：免疫組織化学バックグラウンド染色パンチ皮膚生検の96ウェルプレートおよび予防の作製は、ヒト被験体から採取し、固定液中で12〜24時間（2％113 M L-リジン溶液（pH7.4）中でホルムアルデヒドおよび0.05 mMの過ヨウ素酸ナトリウムなど）とインキュベートする。 4℃で前述したように8。次いで、試料を取り付け、その後メディア最適な切削温度（OCT）、クラ?...

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	<li>Lauria, G., Holland, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+innervation:+changes+with+aging,+topographic+location,+and+in+sensory+neuropathy.">Epidermal innervation: changes with aging, topographic location, and in sensory neuropathy.</a> J. Neurol. Sci. 164 (2), 172-178 (1999).</li><li>Sullivan, K. A., Hayes, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+diabetic+neuropathy.">Mouse models of diabetic neuropathy.</a> Neurobiol. Dis. 28 (3), 276-285 (2007).</li><li>McArthur, J. C., Stocks, E. A., Hauer, P., Cornblath, D. R., Griffin, J. 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Syst. 11 (3), 262-271 (2006).</li><li>Penna, G., Fibbi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+benign+prostatic+hyperplasia+stromal+cells+as+inducers+and+targets+of+chronic+immuno-mediated+inflammation.">Human benign prostatic hyperplasia stromal cells as inducers and targets of chronic immuno-mediated inflammation.</a> J. Immunol. 182 (7), 4056-4064 (2009).</li><li>Lentz, S. I., Edwards, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+(mtDNA)+Biogenesis:+Visualization+and+Duel+Incorporation+of+BrdU+and+EdU+Into+Newly+Synthesized+mtDNA+In+Vitro.">Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In Vitro.</a> J. Histochem. Cytochem. 58 (2), 207-218 (2010).</li><li>Polydefkis, M., Hauer, P., Griffin, J. W., McArthur, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+biopsy+as+a+tool+to+assess+distal+small+fiber+innervation+in+diabetic+neuropathy.">Skin biopsy as a tool to assess distal small fiber innervation in diabetic neuropathy.</a> Diabetes Technol. Ther. 3 (1), 23-28 (2001).</li><li>Lauria, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+fibre+neuropathies.">Small fibre neuropathies.</a> Curr. Opin. Neurol. 18 (5), 591-597 (2005).</li><li>Sorensen, L., Molyneaux, L., Yue, D. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+nerve+fiber+density,+axonal+swellings+and+QST+as+predictors+of+HIV+distal+sensory+neuropathy.">Epidermal nerve fiber density, axonal swellings and QST as predictors of HIV distal sensory neuropathy.</a> Muscle Nerve. 29 (3), 420-427 (2004).</li><li>Navarro, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+27:+Neural+plasticity+after+nerve+injury+and+regeneration.">Chapter 27: Neural plasticity after nerve injury and regeneration.</a> Int. Rev. Neurobiol. 87, 483-505 (2009).</li></ol>

IENFDの測定は広く末梢神経障害13,14の程度を決定するために使用されている。現時点では、最も一般的に使用されるプロトコルは、表皮の基底膜を貫通する神経線維の密度を測定し、それは考慮に軸索の分岐および/または神経の形態学的変化を取ることはありません。また、電流IENFD分析はPN 15の痛みの存在とIENFD相関することが示されていない。 我々は?...

現在のところ、それは小さなファイバ神経障害、3つ6-8を診断するために使用され得る皮膚パンチ生検から、表皮内神経線維密度、（IENFD）を定量化する医師にとって一般的である。生検は、遠位脚（DL）、外果より10センチメートル、および近位大腿（PT）、前腸骨棘9 20以下CMから取得されます。すべてIENFは、タンパク質遺伝子産物9.5（PGP）、パン神経マーカー10-12を使用してラベルが付いています。現在のところ、明視野顕微鏡6 PGP染色によって決定IENFD用いた小型光ファイバ神経障害を診断するための標準的な方法です。さらに、いくつかの研究グループは、PGP免疫組織化学7-9用免疫のプロトコルを使用している。小さな繊維神経障害は、一般的に神経因性疼痛に関連付けられています。さらに、痛みの処理のために不可欠IENFの役割を理解するために、我々は、痛みを生成繊維で共標識合計IENFに技術を開発した。 NocicepTIVE IENFは、特にAδおよびC線維、PGPでIENFの共同ラベリングと侵害受容性マーカー、トロポミオシン受容体キナーゼ（Trkは）5を通して研究することができる。ムーブ痛覚の開発に必須である神経成長因子に対する高親和性受容体である。 TrkはA陽性侵害受容神経線維はペプチド性繊維であることを明示サブスタンスP（SP）およびカルシトニン遺伝子関連ペプチド（CGRP）。以前は、ラウリアらはPN、侵害受容性マーカー10との共同標識PGP陽性IENFを研究する二重標識法を適用した。我々の以前の研究では、我々はTrkの陽性IENFを実証しなく、Trkの陰性IENF、痛みを伴う糖尿病性神経障害5の動物モデルにおいてアップレギュレートされた。この共同標識法はIENFDとPNに関連付けられている形態学的変化を研究する能力を合計する侵害受容IENFDの定量化を比較する機能を提供します。侵害受容IENFとコンパを可視化する機能侵害IENFDにIENFD合計の定量化を再度客観的疼痛の存在の証拠、そしておそらくPNに伴う痛みの重症度に関する洞察を提供することができます。また、この手法は、動物モデルの皮膚に適用可能である。以前の研究と比較して、現在のプロトコルは、2D画像解析で発生するエラーを回避する機会を作成し、3次元画像解析のための方法が記載されている。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399-4</td>
			<td>To make up 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image-IT FX Signal</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>I36933</td>
			<td>Image-IT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Gene Product 9.5 (Polyclonal rabbit)</td>
			<td>AbD Serotec</td>
			<td>7863-0504</td>
			<td>PGP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tropomyosin Related-Kinase A (Polyclonal goat)</td>
			<td>R&amp;D Systems</td>
			<td>AF1056</td>
			<td>Trk A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey &alpha;-rabbit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21206</td>
			<td>AF488 donkey &alpha;-goat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 donkey &alpha;-goat</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21447</td>
			<td>AF647 donkey &alpha;-goat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin, from Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906-100</td>
			<td>BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X- 100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td>TX-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-calibrated Loop</td>
			<td>LeLoop</td>
			<td>MP 199025</td>
			<td>inoculating Loop</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well assay plate</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3603</td>
			<td>Well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36931</td>
			<td>DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass 22x22 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-541-B</td>
			<td>Coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td>Microscope Slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Fluoview Laser Scanning Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV500</td>
			<td>Confocal Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimum Cutting Temperature</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td>OCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1850</td>
			<td>Cryostat</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional imaging of nociceptive intraepidermal nerve fibers in human skin biopsies

皮膚パンチ生検は、一般に周辺多発神経1,2の診断のための表皮内神経線維密度（IENFD）を定量化するために使用される。現在のところ、遠位脚部（DL）と長さに依存する多発3の評価のための近位大腿（PT）からの3mm皮膚生検を採取するのが一般的である。しかし、IENFsの多方向性質のために、2次元（2D）イメージングの分析を通して神経構造を重複検査する困難である。あるいは、三次元（3D）画像化は、このジレンマのためのより良い解決策を提供することができる。 現在のレポートでは、痛みを伴う神経障害（PN）を研究するために3D画像を適用するための方法を提示する。 IENFsを識別するために、皮膚サンプルをタンパク質遺伝子産物9.5（PGP）、パンニューロンマーカーの免疫蛍光分析のために処理される。現在のところ、それはIENFDが阻止用いた小型光ファイバ神経障害を診断するための標準的な方法です明視野顕微鏡4を使用してPGPの免疫組織化学によって採掘。現在の研究では、PGPを使用して、合計IENFDを識別するために二重免疫蛍光分析を適用し、侵害受容IENF、神経成長因子5（TrkのA）、高親和性受容体トロポミオシン受容体キナーゼを認識する抗体を使用することによって。 PGPとTrkの抗体との共染色IENFの利点は明らかにPGP陽性、侵害受容繊維を染色することによって、PNの研究に利益をもたらす。これらの蛍光信号はPNと関連付けIENFの侵害IENFD及び形態学的変化を決定するために定量することができる。蛍光画像は、共焦点顕微鏡で取得し、3次元解析のために処理されます。 3Dイメージングは​​さらにPNに関連付けられている形態学的変化を分析するために、回転力を提供します。まとめると、蛍光共染色、共焦点イメージング、3次元解析が明らかにPNの研究に利益をもたらす。

私たちは、PNの患者からPTとDL皮膚生検でIENFの形態を研究する現在のプロトコルを適用した。皮膚は、3名の被験者から、PNに関連付けられた病理形態を実証するためにユタ大学で集めた。被験者が含まれます：ケース1：2型糖尿病のPNの歴史（期間：14ヶ月、疼痛スコア：51）;と51歳の男性ケース2：PNの歴史を持つ56歳の男性をとケース3：2型糖尿病（期間：42ヶ月、疼痛スコア：46）のPNの歴史を...

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Three-dimensional Imaging of Nociceptive Intraepidermal Nerve Fibers in Human Skin Biopsies

痛みを伴う神経障害（PN）における侵害受容性表皮内神経線維（IENFs）の変化を調べるために、我々が直接侵害受容IENFsで観察された三次元形態学的変化を調べることができるプロトコルを開発した。 IENFsの三次元解析はPNでIENFの形態学的変化を評価するための可能性を秘めている。

人間の皮膚生検における侵害受容性表皮内神経線維の三次元イメージング

A punch biopsy of the skin is commonly used to quantify intraepidermal nerve fiber densities (IENFD) for the diagnosis of peripheral polyneuropathy 1,2. ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

人間の神経内分泌腫瘍療法の研究のための三次元モデルとしての人間の神経内分泌腫瘍細胞株

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

初代ヒト骨髄およびその悪性腫瘍を研究する三次元組織培養モデル

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

三次元（3D）腫瘍スフェロイド浸潤アッセイ

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

ヒト下垂体腺腫細胞の三次元アルギン酸ビーズ文化

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

光シート顕微鏡による劇症心筋炎のマウスモデルにおける白血球浸潤の定量的可視化

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

Objective Nociceptive Assessment in Ventilated ICU Patients: A Feasibility Study Using Pupillometry and the Nociceptive Flexion Reflex

換気の ICU 患者の客観的な受容評価: Pupillometry と侵害受容性屈曲反射を用いた可能性の検討

The concept of objective nociceptive assessment and optimal pain management have gained increasing attention. Despite the known negative short- and ...

Three-Dimensional Printing of a Complex Aortic Anomaly

複雑な大動脈の異常の三次元印刷

Complex congenital aortic anomalies include diverse types of malformations that may be clinically asymptomatic or present with respiratory or esophageal ...

Refined CLARITY-Based Tissue Clearing for Three-Dimensional Fibroblast Organization in Healthy and Injured Mouse Hearts

健康で負傷したマウス心臓における三次元線維芽細胞組織のための精製されたCLARITYベースの組織クリアリング

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of mortality worldwide and is often marked by heightened cardiac fibrosis that can lead to increased ...

High-Resolution Three-Dimensional Imaging of the Footpad Vasculature in a Murine Hindlimb Gangrene Model

マウス後肢壊疽モデルにおける足蹠血管系の高解像度3次元イメージング

Peripheral arterial disease (PAD) is a significant cause of morbidity resulting from chronic exposure to atherosclerotic risk factors. Patients suffering ...

Guided Endodontics: Three-Dimensional Planning and Template-Aided Preparation of Endodontic Access Cavities

ガイド付き歯内療法:歯内アクセス虫歯の3次元計画とテンプレート支援準備

Pulp canal obliterations (PCO) are often a consequence of dental trauma, such as luxation injuries. Even though dentin apposition is a sign of vital pulp, ...