Name: three-dimensional imaging of nociceptive intraepidermal nerve fibers in human skin biopsies
Uploaded: 2013-04-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Imaging of Nociceptive Intraepidermal Nerve Fibers in Human Skin Biopsies at JoVE.com

Detta arbete stöddes av National Institutes of Health bidrag K08 NS061039-01A2, Programmet för Neurology Research &amp; Discovery, och A. Alfred Taubman Medical Research Institute vid University of Michigan. Detta arbete använde morfologi och bildanalys Kärna av Michigan Diabetes Research and Training Center, som finansieras av National Institutes of Health Grant 5P90 DK-20572 från National Institute of Diabetes and Digestive och njursjukdomar. Författarna vill tacka Robinson Singleton och Gordon Smith (University of Utah) för deras generösa donation av mänsklig hud prover för att stödja den inledande utvecklingen av nociceptiv biomarkör immunohistokemi teknik.

Del A: Immunohistochemistry Framställning av 96-brunnars platta och förebyggande av Punch bakgrundsfärgning hudbiopsier samlas från människa och inkuberades under 12-24 h i fixeringslösningen (2% paraformaldehyd med 0,75 M L-lysin-lösning (pH 7,4) och 0,05 mM natriumperjodat) vid 4 ° C såsom beskrivits tidigare 8. Prover sedan cryoprotected i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med 20% glycerol vid 4 ° C i upp till 1 vecka, inbäddade i montering media optimal kapning temperat...

<ol>
	<li>Lauria, G., Holland, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+innervation:+changes+with+aging,+topographic+location,+and+in+sensory+neuropathy.">Epidermal innervation: changes with aging, topographic location, and in sensory neuropathy.</a> J. Neurol. Sci. 164 (2), 172-178 (1999).</li><li>Sullivan, K. A., Hayes, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+diabetic+neuropathy.">Mouse models of diabetic neuropathy.</a> Neurobiol. Dis. 28 (3), 276-285 (2007).</li><li>McArthur, J. C., Stocks, E. A., Hauer, P., Cornblath, D. R., Griffin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+nerve+fiber+density:+normative+reference+range+and+diagnostic+efficiency.">Epidermal nerve fiber density: normative reference range and diagnostic efficiency.</a> Arch. Neurol. 55 (12), 1513-1520 (1998).</li><li>Griffin, J. W., McArthur, J. C., Polydefkis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+cutaneous+innervation+by+skin+biopsies.">Assessment of cutaneous innervation by skin biopsies.</a> Curr. Opin. Neurol. 14 (5), 655-659 (2001).</li><li>Cheng, H. T., Dauch, J. R., Hayes, J. M., Yanik, B. M., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+growth+factor/p38+signaling+increases+intraepidermal+nerve+fiber+densities+in+painful+neuropathy+of+type+2+diabetes.">Nerve growth factor/p38 signaling increases intraepidermal nerve fiber densities in painful neuropathy of type 2 diabetes.</a> Neurobiol. Dis. 45 (1), 280-287 (2012).</li><li>Lauria, G., Lombardi, R., Camozzi, F., Devigili, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+biopsy+for+the+diagnosis+of+peripheral+neuropathy.">Skin biopsy for the diagnosis of peripheral neuropathy.</a> Histopathology. 54 (3), 273-285 (2009).</li><li>Vlckova-Moravcova, E., Bednarik, J., Dusek, L., Toyka, K. V., Sommer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+validity+of+epidermal+nerve+fiber+densities+in+painful+sensory+neuropathies.">Diagnostic validity of epidermal nerve fiber densities in painful sensory neuropathies.</a> Muscle Nerve. 37 (1), 50-60 (2008).</li><li>Casanova-Molla, J., Morales, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+fluorescence+quantitation+provides+a+new+approach+to+assess+cutaneous+innervation.">Axonal fluorescence quantitation provides a new approach to assess cutaneous innervation.</a> J. Neurosci. Methods. 200 (2), 190-198 (2011).</li><li>Wang, L., Hilliges, M., Jernberg, T., Wiegleb-Edstrom, D., Johansson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+gene+product+9.5-immunoreactive+nerve+fibres+and+cells+in+human+skin.">Protein gene product 9.5-immunoreactive nerve fibres and cells in human skin.</a> Cell Tissue Res. 261 (1), 25-33 (1990).</li><li>Lauria, G., Morbin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+capsaicin+receptor+immunoreactivity+in+human+peripheral+nervous+system+and+in+painful+neuropathies.">Expression of capsaicin receptor immunoreactivity in human peripheral nervous system and in painful neuropathies.</a> J. Peripher. Nerv. Syst. 11 (3), 262-271 (2006).</li><li>Penna, G., Fibbi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+benign+prostatic+hyperplasia+stromal+cells+as+inducers+and+targets+of+chronic+immuno-mediated+inflammation.">Human benign prostatic hyperplasia stromal cells as inducers and targets of chronic immuno-mediated inflammation.</a> J. Immunol. 182 (7), 4056-4064 (2009).</li><li>Lentz, S. I., Edwards, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+(mtDNA)+Biogenesis:+Visualization+and+Duel+Incorporation+of+BrdU+and+EdU+Into+Newly+Synthesized+mtDNA+In+Vitro.">Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In Vitro.</a> J. Histochem. Cytochem. 58 (2), 207-218 (2010).</li><li>Polydefkis, M., Hauer, P., Griffin, J. W., McArthur, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+biopsy+as+a+tool+to+assess+distal+small+fiber+innervation+in+diabetic+neuropathy.">Skin biopsy as a tool to assess distal small fiber innervation in diabetic neuropathy.</a> Diabetes Technol. Ther. 3 (1), 23-28 (2001).</li><li>Lauria, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+fibre+neuropathies.">Small fibre neuropathies.</a> Curr. Opin. Neurol. 18 (5), 591-597 (2005).</li><li>Sorensen, L., Molyneaux, L., Yue, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+among+pain,+sensory+loss,+and+small+nerve+fibers+in+diabetes.">The relationship among pain, sensory loss, and small nerve fibers in diabetes.</a> Diabetes Care. 29 (4), 883-887 (2006).</li><li>Lauria, G., Morbin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+swellings+predict+the+degeneration+of+epidermal+nerve+fibers+in+painful+neuropathies.">Axonal swellings predict the degeneration of epidermal nerve fibers in painful neuropathies.</a> Neurology. 61 (5), 631-636 (2003).</li><li>Herrmann, D. N., McDermott, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+nerve+fiber+density,+axonal+swellings+and+QST+as+predictors+of+HIV+distal+sensory+neuropathy.">Epidermal nerve fiber density, axonal swellings and QST as predictors of HIV distal sensory neuropathy.</a> Muscle Nerve. 29 (3), 420-427 (2004).</li><li>Navarro, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+27:+Neural+plasticity+after+nerve+injury+and+regeneration.">Chapter 27: Neural plasticity after nerve injury and regeneration.</a> Int. Rev. Neurobiol. 87, 483-505 (2009).</li></ol>

Mätning av IENFD har i stor utsträckning använts för att fastställa graden av perifera neuropatier 13,14. För närvarande mäter den vanligaste protokoll som endast tätheter av nervfibrer som penetrerar basalmembranet av överhuden, det tar inte hänsyn till axonal förgrening och / eller morfologiska förändringar i nerver. Dessutom har nuvarande IENFD analysen inte visats korrelera IENFD med förekomsten av smärta i PN 15. Vi har tidigare rapporterat att ett ...

För närvarande är det vanligt att läkare att kvantifiera intraepidermal densiteter nervfibrer, (IENFD) från huden stansbiopsier, som kan användas för att diagnostisera små fibrer neuropati 3, 6-8. Biopsier tas från den distala benet (DL), 10 cm ovanför laterala fotknölen, och den proximala låret (PT), 20 cm under främre iliaca ryggraden 9. Alla IENF är märkta med proteingenprodukt 9,5 (PGP), en pan neuronal markör 10-12. I dagsläget är det praxis att diagnostisera små fibrer neuropati använder IENFD bestäms av PGP färgning med brightfield mikroskopi 6. Dessutom har flera forskargrupper använde immunofluorescerande protokoll för PGP immunohistokemi 7-9. Små fibrer neuropati är ofta förknippad med neuropatisk smärta. För att ytterligare förstå rollen av IENF viktigt för smärta bearbetning, utvecklade vi en teknik för att co-label total IENF med fibrer som genererar smärta. Nociceptiv IENF, särskilt Aδ och C-fibrer, kan studeras genom co-märkning av IENF med PGP och nociceptiv markör, tropomyosin-receptor-kinas A (Trk A) 5. Trk A är den högaffinitetsreceptor för nervtillväxtfaktor som är väsentlig för utvecklingen av nociception. TRK A-positiva nociceptiva nervfibrer är peptiderga fibrer som uttrycker substans P (SP) och kalcitoningenrelaterad peptid (CGRP). Tidigare gällde Lauria och kollegor dubbel-märkning teknik för att studera PN, co-märkning PGP-positiv IENF med en nociceptiv markör 10. I vår tidigare studie visade vi att Trk A-positiv IENF, men inte Trk A-negativ IENF var uppreglerad vid en djurmodell av smärtsam diabetesneuropati 5. Detta samarbete märkning teknik ger möjlighet att jämföra kvantifiering av nociceptiv IENFD till total IENFD och förmågan att studera morfologiska förändringar i samband med PN. Förmågan att visualisera nociceptiv IENF och bolagenre kvantifiering av total IENFD till nociceptiv IENFD kunde ge objektiva belägg för förekomst av smärta, och möjligen inblick i svårighetsgraden av smärta i samband med PN. Denna teknik är också tillämplig på hud av djurmodeller. I jämförelse med tidigare studier, beskriver det nuvarande protokollet metoder för 3D bildanalys, skapar möjlighet att undvika fel som kan uppstå i 2D bildanalys.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399-4</td>
			<td>To make up 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image-IT FX Signal</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>I36933</td>
			<td>Image-IT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Gene Product 9.5 (Polyclonal rabbit)</td>
			<td>AbD Serotec</td>
			<td>7863-0504</td>
			<td>PGP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tropomyosin Related-Kinase A (Polyclonal goat)</td>
			<td>R&amp;D Systems</td>
			<td>AF1056</td>
			<td>Trk A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey &alpha;-rabbit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21206</td>
			<td>AF488 donkey &alpha;-goat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 donkey &alpha;-goat</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21447</td>
			<td>AF647 donkey &alpha;-goat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin, from Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906-100</td>
			<td>BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X- 100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td>TX-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-calibrated Loop</td>
			<td>LeLoop</td>
			<td>MP 199025</td>
			<td>inoculating Loop</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well assay plate</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3603</td>
			<td>Well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36931</td>
			<td>DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass 22x22 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-541-B</td>
			<td>Coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td>Microscope Slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Fluoview Laser Scanning Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV500</td>
			<td>Confocal Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimum Cutting Temperature</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td>OCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1850</td>
			<td>Cryostat</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional imaging of nociceptive intraepidermal nerve fibers in human skin biopsies

En stansbiopsi av huden används ofta för att kvantifiera intraepidermal densiteter nervfiber (IENFD) för diagnos av perifer polyneuropati 1,2. För närvarande är det vanligt att samla in 3 biopsier mm hud från den distala benet (DL) och den proximala låret (PT) för utvärdering av längd-beroende polyneuropatier 3. Men på grund av den månginriktat natur IENFs, är det svårt att undersöka överlappande nervstrukturer genom analys av tvådimensionella (2D) avbildning. Alternativt kunde tredimensionella (3D) avbildning ge en bättre lösning på detta dilemma. I den aktuella rapporten presenterar vi metoder för att tillämpa 3D-avbildning för att studera smärtsam neuropati (PN). För att identifiera IENFs är hudprover behandlas för immunofluorescerande analys av protein-genprodukten 9,5 (PGP), en pan neuronal markör. I dagsläget är det praxis att diagnostisera små fibrer neuropati använder IENFD avskräckabryts av PGP immunohistokemi med brightfield mikroskopi 4. I den aktuella studien, tillämpade vi dubbel immunofluorescens analys för att identifiera total IENFD, använder PGP, och nociceptiv IENF, genom användning av antikroppar som känner igen tropomyosin-receptor-kinas A (Trk A), högaffinitetsreceptorn för nervtillväxtfaktor 5. Fördelarna med co-färgning IENF med PGP och Trk A antikroppar gynnar studie av PN genom att tydligt färgning PGP-positiva, nociceptiva fibrer. Dessa fluorescerande signaler kan kvantifieras för att bestämma nociceptiva IENFD och morfologiska förändringar i IENF förknippas med PN. De fluorescerande bilder förvärvas genom konfokalmikroskopi och bearbetas för 3D-analys. 3D-bildbehandling ger roterande förmåga att ytterligare analysera morfologiska förändringar i samband med PN. Sammantaget fluorescerande co-färgning, konfokal avbildning och 3D analys drar bevisligen studiet av PN.

Vi tillämpade det nuvarande protokollet för att studera morfologi IENF i PT och DL hudbiopsier från patienter med PN. Huden, från tre individer, samlades vid University of Utah för att demonstrera pathomorphology förknippas med PN. Ämnena är: Mål 1: a 51-årig man med en historia av PN av typ 2-diabetes (varaktighet: 14 månader, smärtan: 51), mål 2: a 56-årig man med en historia av PN av typ 2-diabetes (längd: 108 månader, smärtan: 47), och i mål 3: a 66-årig man med en historia av PN av typ 2-diabetes...

Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Imaging of Nociceptive Intraepidermal Nerve Fibers in Human Skin Biopsies at JoVE.com

Three-dimensional Imaging of Nociceptive Intraepidermal Nerve Fibers in Human Skin Biopsies

För att studera de förändringar av nociceptiva intraepidermal nervfibrer (IENFs) i smärtsamma neuropatier (PN), utvecklade vi protokoll som direkt skulle kunna undersöka tredimensionella morfologiska förändringar som observerats i nociceptiva IENFs. Tredimensionell analys av IENFs har potential att utvärdera de morfologiska förändringarna av IENF i PN.

Tredimensionell avbildning av Nociceptiva Intraepidermal nervfibrer i human hud Biopsier

A punch biopsy of the skin is commonly used to quantify intraepidermal nerve fiber densities (IENFD) for the diagnosis of peripheral polyneuropathy 1,2. ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Mänskliga neuroendokrin tumör cellinjer som en tredimensionell modell för studiet av mänskliga neuroendokrin tumör Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

En Tredimensionell Tissue Culture modell för att studera Primary humana benmärg och dess Maligniteter

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Tredimensionell (3D) Tumör Spheroid invasionsanalys

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

Tredimensionell alginat-pärla Culture of Human hypofysadenom Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

Kvantitativ visualisering av leukocytinfiltrat i en murinmodell av Fulminant-myokardit genom ljusarkmikroskopi

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

Objective Nociceptive Assessment in Ventilated ICU Patients: A Feasibility Study Using Pupillometry and the Nociceptive Flexion Reflex

Objektiva nociceptiva bedömning i ventilerade IVA patienter: en förstudie med hjälp av Pupillometri och den nociceptiva Flexion reflexen

The concept of objective nociceptive assessment and optimal pain management have gained increasing attention. Despite the known negative short- and ...

Three-Dimensional Printing of a Complex Aortic Anomaly

Tredimensionella utskrift av en komplex aorta anomali

Complex congenital aortic anomalies include diverse types of malformations that may be clinically asymptomatic or present with respiratory or esophageal ...

Refined CLARITY-Based Tissue Clearing for Three-Dimensional Fibroblast Organization in Healthy and Injured Mouse Hearts

Förfinad KLARHET-baserad vävnadsrensning för tredimensionell fibroblastorganisation i friska och skadade mushjärtan

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of mortality worldwide and is often marked by heightened cardiac fibrosis that can lead to increased ...

High-Resolution Three-Dimensional Imaging of the Footpad Vasculature in a Murine Hindlimb Gangrene Model

Högupplöst tredimensionell avbildning av fotplattan Vasculature i en Murine Hindlimb Gangrene Modell

Peripheral arterial disease (PAD) is a significant cause of morbidity resulting from chronic exposure to atherosclerotic risk factors. Patients suffering ...

Guided Endodontics: Three-Dimensional Planning and Template-Aided Preparation of Endodontic Access Cavities

Guidad endodonti: Tredimensionell planering och mallstödd beredning av endodontiska åtkomsthåligheter

Pulp canal obliterations (PCO) are often a consequence of dental trauma, such as luxation injuries. Even though dentin apposition is a sign of vital pulp, ...