Name: development, expansion, and in vivo monitoring of human nk cells from human embryonic stem cells (hescs) and induced pluripotent stem cells (ipscs)
Uploaded: 2013-04-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs at JoVE.com

लेखकों हमारी प्रयोगशाला के भीतर स्पिन ईबी प्रोटोकॉल की दीक्षा के लिए मेलिंडा Hexum धन्यवाद देना चाहूंगा. हम लौरा ई. Bendzick, माइकल Lepley, और इस काम के साथ उनकी तकनीकी सहायता के लिए Zhenya नी सहित प्रयोगशाला के अन्य सदस्यों को धन्यवाद देना चाहूंगा. लेखकों को भी अपने विशेषज्ञ तकनीकी सलाह के लिए कैलिपर लाइफ साइंसेज में ब्रैड टेलर को धन्यवाद देना चाहूंगा.

1. स्पिन ईबी संस्कृति के लिए TrypLE में hESCs या iPSCs आदत डाल <ol><li> collagenase-passaged संस्कृतियों से ते / आईपीएस कालोनियों अपेक्षाकृत छोटे हैं तो TrypLE साथ प्रारंभिक हदबंदी सबसे अच्छा काम करता है. / आईपीएस आबादी कोशिकाओं होना चाह...

<ol>
	<li>Keller, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+embryonic+stem+cells.">In vitro differentiation of embryonic stem cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 7, 862-869 (1995).</li><li>Kaufman, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+colony-forming+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells.">Hematopoietic colony-forming cells derived from human embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 98, 10716-10721 (2001).</li><li>Kaufman, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+clinical+therapies+using+hematopoietic+cells+derived+from+human+pluripotent+stem+cells.">Toward clinical therapies using hematopoietic cells derived from human pluripotent stem cells.</a> Blood. 114, 3513-3523 (2009).</li><li>Ng, E. S., Davis, R., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+describing+the+use+of+a+recombinant+protein-based,+animal+product-free+medium+(APEL)+for+human+embryonic+stem+cell+differentiation+as+spin+embryoid+bodies.">A protocol describing the use of a recombinant protein-based, animal product-free medium (APEL) for human embryonic stem cell differentiation as spin embryoid bodies.</a> Nature Protocols. 3, 768-776 (2008).</li><li>Ng, E. S., Davis, R. P., Azzola, L., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forced+aggregation+of+defined+numbers+of+human+embryonic+stem+cells+into+embryoid+bodies+fosters+robust,+reproducible+hematopoietic+differentiation.">Forced aggregation of defined numbers of human embryonic stem cells into embryoid bodies fosters robust, reproducible hematopoietic differentiation.</a> Blood. 106, 1601-1603 (2005).</li><li>Vodyanik, M. A., Bork, J. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cell-derived+CD34++cells:+efficient+production+in+the+coculture+with+OP9+stromal+cells+and+analysis+of+lymphohematopoietic+potential.">Human embryonic stem cell-derived CD34+ cells: efficient production in the coculture with OP9 stromal cells and analysis of lymphohematopoietic potential.</a> Blood. 105, 617-626 (2005).</li><li>Woll, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cells+differentiate+into+a+homogeneous+population+of+natural+killer+cells+with+potent+in+vivo+antitumor+activity.">Human embryonic stem cells differentiate into a homogeneous population of natural killer cells with potent in vivo antitumor activity.</a> Blood. 113, 6094-6101 (2009).</li><li>Woll, P. S., Martin, C. H., Miller, J. S., Kaufman, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cell-derived+NK+cells+acquire+functional+receptors+and+cytolytic+activity.">Human embryonic stem cell-derived NK cells acquire functional receptors and cytolytic activity.</a> Journal of Immunology. 175, 5095-5103 (2005).</li><li>Ni, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Pluripotent+Stem+Cells+Produce+Natural+Killer+Cells+That+Mediate+Anti-HIV-1+Activity+by+Utilizing+Diverse+Cellular+Mechanisms.">Human Pluripotent Stem Cells Produce Natural Killer Cells That Mediate Anti-HIV-1 Activity by Utilizing Diverse Cellular Mechanisms.</a> Journal of Virology. 85, 43-50 (2011).</li><li>Ng, E. S., Davis, R. P., Hatzistavrou, T., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+as+spin+embryoid+bodies+and+a+description+of+the+hematopoietic+blast+colony+forming+assay.">Directed differentiation of human embryonic stem cells as spin embryoid bodies and a description of the hematopoietic blast colony forming assay.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. Chapter 1, Unit 1D.3 (2008).</li><li>Denman, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-Bound+IL-21+Promotes+Sustained+Ex+Vivo+Proliferation+of+Human+Natural+Killer+Cells.">Membrane-Bound IL-21 Promotes Sustained Ex Vivo Proliferation of Human Natural Killer Cells.</a> PLoS ONE. 7, e30264 (2012).</li><li>Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion,+Purification,+and+Functional+Assessment+of+Human+Peripheral+Blood+NK+Cells.">Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells.</a> J. Vis. Exp. (48), e2540 (2011).</li><li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescent+imaging+demonstrates+that+transplanted+human+embryonic+stem+cell-derived+CD34++cells+preferentially+develop+into+endothelial+cells.">Bioluminescent imaging demonstrates that transplanted human embryonic stem cell-derived CD34+ cells preferentially develop into endothelial cells.</a> Stem Cells. 27, 2675-2685 (2009).</li><li>Wilber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+stable+transgene+expression+in+human+embryonic+stem+cells+using+transposon-mediated+gene+transfer.">Efficient and stable transgene expression in human embryonic stem cells using transposon-mediated gene transfer.</a> Stem Cells. 25, 2919-2927 (2007).</li><li>Shcherbo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-infrared+fluorescent+proteins.">Near-infrared fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 7, 827-829 (2010).</li><li>Nguyen, V. T., Morange, M., Bensaude, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+luciferase+luminescence+assays+using+scintillation+counters+for+quantitation+in+transfected+mammalian+cells.">Firefly luciferase luminescence assays using scintillation counters for quantitation in transfected mammalian cells.</a> Analytical Biochemistry. 171, 404-408 (1988).</li><li>Sadikot, R. T., Blackwell, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+Imaging.">Bioluminescence Imaging.</a> Proceedings of the American Thoracic Society. 2, 537-540 (2005).</li><li>Santos, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+in+vivo+imaging+of+T+cells+using+a+membrane-bound+Gaussia+princeps+luciferase.">Sensitive in vivo imaging of T cells using a membrane-bound Gaussia princeps luciferase.</a> Nature Medicine. 15, 338-344 (2009).</li><li>Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Proteins+and+Their+Applications+in+Imaging+Living+Cells+and+Tissues.">Fluorescent Proteins and Their Applications in Imaging Living Cells and Tissues.</a> Physiological Reviews. 90, 1103-1163 (2010).</li><li>Knorr, D. A., Bock, A., Brentjens, R. J., Kaufman, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+Human+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Lymphocytes+to+Study+In+Vivo+Trafficking+and+Immunotherapy.">Engineered Human Embryonic Stem Cell-Derived Lymphocytes to Study In Vivo Trafficking and Immunotherapy.</a> Stem Cells Dev. 28, 28 (2013).</li><li>Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Decade+of+Imaging+Cellular+Motility+and+Interaction+Dynamics+in+the+Immune+System.">A Decade of Imaging Cellular Motility and Interaction Dynamics in the Immune System.</a> Science. 336, 1676-1681 (2012).</li></ol>

hESCs के विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं का अध्ययन और नैदानिक ​​अनुवाद के लिए उल्लेखनीय संभावित पकड़ के लिए एक आदर्श मंच है. हम hematopoietic पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं को hESC / iPSCs अंतर करने के लिए एक परिभाषित, स्पिन ईबी दृष्ट?...

मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESCs) और प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSCs) असीमित आत्म नवीकरण और बहु ​​- वंश भेदभाव करने में सक्षम अविभाजित, pluripotent कोशिकाओं हैं. hESCs के सफलतापूर्वक 1-3 hematopoietic प्रणाली की कोशिकाओं सहित प्रत्येक रोगाणु परत की परिपक्व और कार्यात्मक कैंपेन्स, में भेदभाव किया गया है. प्राकृतिक हत्यारा (एन.के. सेल) stromal सेल लाइनों 1,2,6-8 साथ embryoid निकायों के गठन (ईबीएस) 4,5 या सह संस्कृति से hESCs से प्राप्त किया जा सकता है कि सहज प्रतिरक्षा प्रणाली की लिम्फोसाइटों हैं. एन.के. कोशिकाओं विरोधी वायरल और विरोधी ट्यूमर क्षमताओं के अधिकारी और वे पहले प्रतिजन उत्तेजना उनके प्रेरक कार्यों का निष्पादन करने की आवश्यकता नहीं है, के रूप में दुर्दमताओं का एक व्यापक रेंज के खिलाफ प्रभावी होने की संभावना है. इस प्रकार, hESC व्युत्पन्न एन.के. कोशिकाओं immunotherapy के लिए कोशिकाओं का एक आकर्षक स्रोत हैं. इसके अतिरिक्त, hESCs से एन.के. कोशिकाओं की व्युत्पत्ति सामान्य विकास का अध्ययन करने के लिए एक आनुवंशिक रूप से उत्तरदायी प्रणाली प्रदान करता है &lt;उन्हें&gt; इन विट्रो में. वे एक आनुवंशिक विनयशील प्रणाली प्रदान करते हैं, hESC व्युत्पन्न एन.के. कोशिकाओं प्रयोगात्मक इन विट्रो और इन विवो में एन.के. सेल प्रेरक कार्यों का अध्ययन करने के लिए एक इष्टतम मॉडल उपलब्ध कराने फ्लोरोसेंट और bioluminescent पत्रकारों को व्यक्त करने के लिए संशोधित किया जा सकता है. hESC व्युत्पन्न एन.के. कोशिकाओं को एचआईवी 9, ल्यूकेमिया (K562) और अन्य प्रकार के कैंसर 7,8 सहित लक्ष्यों की एक श्रृंखला के खिलाफ गतिविधि के अधिकारी. हालांकि, क्षमता कुशलता से एक डिग्री कम है, एन.के. सेल विकास और कैंसर विरोधी कार्यों के vivo अध्ययन में व्यापक पूर्व नैदानिक ​​के लिए एक सीमा तक, इलाज के रोगियों में सक्षम पर्याप्त एन.के. कोशिकाओं नैदानिक ​​अनुवाद के लिए एक महत्वपूर्ण बाधा बनी हुई है और प्राप्त करने के लिए. यहाँ, हम hESCs 4,5,10 से hematopoietic पूर्वज प्राप्त करने के लिए एक स्पिन ईबी दृष्टिकोण का उपयोग करें. 11 दिनों के बाद स्पिन ईबीएस 28 दिनों के लिए फीडरों के साथ या बिना एन.के. सेल संस्कृति के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं. एन.के. सेल संस्कृति माध्यम में 4 हफ्तों के बाद, एन.के. कोशिकाओं ट्रॅन हैंकृत्रिम प्रतिजन कोशिकाओं (aAPCs) के रूप में सेवा करते हैं जो झिल्ली ही सीमित इंटरल्यूकिन 21 (आईएल -21), व्यक्त करने के लिए संशोधित K562 कोशिकाओं के साथ सह संस्कृति को sferred. इन कृत्रिम APCs 11,12 उपयोग कर परिधीय रक्त एन.के. कोशिकाओं के विस्तार के लिए एक प्रोटोकॉल आदत डाल, हम एक परिपक्व phenotype और साइटोटोक्सिक क्षमताओं को बनाए रखते हुए एन.के. कोशिकाओं 2 लॉग का विस्तार करने में सक्षम हैं. विकास और विस्तार की यह प्रक्रिया विवो लक्षण वर्णन में व्यापक लिए पर्याप्त hESC व्युत्पन्न एन.के. कोशिकाओं प्रदान करता है. Vivo अध्ययन में, हम व्यक्त गैर invasively इंजेक्शन जुगनू luciferase की दीर्घकालिक engraftment और कैनेटीक्स निगरानी करने में सक्षम हैं (Fluc +) bioluminescence इमेजिंग का उपयोग कर hESC व्युत्पन्न एन.के. कोशिकाओं. इसके अलावा, हम एक दोहरी, bioluminescent या फ्लोरोसेंट इमेजिंग योजना का उपयोग कर ट्यूमर कोशिकाओं के साथ एन.के. सेल बातचीत का पालन करने में सक्षम हैं. हमारे समूह से पहले के एक अध्ययन ट्यूमर प्रगति और cle के पालन करने के लिए एक विरोधी ट्यूमर मॉडल में bioluminescence इमेजिंग का इस्तेमाल कियाविवो 7 में Fluc + K562 कोशिकाओं की Arance. अब, एक्सप्रेस जुगनू luciferase 13,14 को हमारे hESCs के इंजीनियरिंग द्वारा हम हाल ही में विशेषता फ्लोरोसेंट प्रोटीन, turboFP650 15 व्यक्त कि K562 ट्यूमर कोशिकाओं को एन.के. कोशिकाओं के biodistribution और तस्करी का पालन कर सकते हैं. हम एक साथ vivo में दो सेल आबादी (चित्रा 1) का पालन करने के लिए इस दोहरी संवाददाता प्रणाली को चुना है. हाल दोहरी इमेजिंग मॉडल दोहरे luciferase सिस्टम दिया गया है, लेकिन इन प्रणालियों के तकनीकी कारण coelenterazine का वितरण आवश्यकताओं के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है, सब्सट्रेट सबसे Renilla और Gaussia luciferase पत्रकारों 16-18 की अभिव्यक्ति के लिए आवश्यक है. फ्लोरोसेंट संवाददाताओं कई सेल लाइनों और इन विट्रो में निर्माणों की आसान निगरानी की अनुमति दी है, लेकिन कारण ऊतक और फर autofluorescence और कई सह के उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के बीच ओवरलैप करने के लिए vivo इमेजिंग में सीमित सफलता मिली हैmmonly GFP, dsRed, और tdTomato 15,19 सहित फ्लोरोसेंट संवाददाताओं से इस्तेमाल किया. यह चिंता का विषय है बेहतर ऊतक अंतर्वेधन और पृष्ठभूमि 15,19 की तुलना में अधिक विशिष्ट संकेत के लिए अनुमति देते हैं जो दूर तक लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन के विकास को प्रोत्साहित किया है. TurboFP650, इस प्रणाली में दिखाया फ्लोरोसेंट प्रोटीन, दूर लाल स्थानांतरित कर दिया है और रहने वाले जानवरों में इमेजिंग फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ जुड़े मुद्दों के कई काबू. HESCs से व्युत्पन्न एन.के. कोशिकाओं के विकास और विस्तार के लिए इस विधि हमें आगे इन विट्रो में और बेहतर मौजूदा एन.के. सेल दत्तक उपचार में सुधार के एन.के. सेल समारोह और नैदानिक ​​महत्वपूर्ण समझ लेना जरूरी है, जो इन विवो में hESC व्युत्पन्न एन.के. कोशिकाओं को चिह्नित करने के लिए अनुमति दी गई है. यह भी व्युत्पत्ति और iPSC व्युत्पन्न एन.के. कोशिकाओं का विस्तार करने के लिए उत्तरदायी है. दोहरी फ्लोरोसेंट और bioluminescent इमेजिंग योजना हम यहाँ से पता चला है विरोधी ट्यूमर मॉडल की तुलना में अन्य प्रणालियों के लिए मोटे तौर पर लागू है.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>BPEL media for Spin EB generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH3022801</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-12 Nutrient Mixture w/ Glutamax I</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31765035</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3311</td>
			<td>Commercially available BSA can be cytotoxic to ES cells. Deionizing the solution can reduce the potential for cytotoxicity.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(vinyl alcohol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8136</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linoleic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L1012</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linolenic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2376</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthechol 500X solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5442</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>a-monothioglycerol (a-MTG)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5442</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein-free hybridoma mix II</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12040077</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic Acid 2-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8960</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax I</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050061</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin, Transferrin, Selenium 100X solution (ITS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>41400-045</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140122</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>NK Differentiation Media </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dubecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11965-118</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-12 Media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>CX30315</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15% Human AB serum</td>
			<td>Valley Biomed</td>
			<td>HP1022HI</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ng/ml Sodium Selenite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5261</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 uM ethanolamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9508</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ng/ml ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8960</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 uM 2-mercaptoethanol (BME)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mM L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>CX30310</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% Pen-Strep</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140122</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Cytokines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>(all cytokines used fresh from frozen aliquots)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCF</td>
			<td>PeproTech, Inc.</td>
			<td>300-07</td>
			<td>40 ng/ml in BPEL media; 20 ng/ml in NK medium). As noted by the Elefanty protocol, and as we discovered with a bad lot of BMP4, there can be lot differences with cytokines in regards to hematopoietic differentiation.Especially if buying cytokines in bulk, obtain a sample of the lot to test prior to purchase. Compare head-to-head with old lot.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhBMP-4</td>
			<td>R &amp;D Systems</td>
			<td>314-BP</td>
			<td>20 ng/ml in BPEL media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhVEGF</td>
			<td>R&amp;D Systems</td>
			<td>293-VE</td>
			<td>20 ng/ml in BPEL media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-2</td>
			<td>PeproTech, Inc.</td>
			<td>200-02</td>
			<td>1 x 105 U/ml given to mice after NK cell injection; 50 U/ml used in NK cell expansion protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-15</td>
			<td>PeproTech, Inc.</td>
			<td>200-15</td>
			<td>10 ng/ml given to mice after NK cell injection (first 7 days only)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-3</td>
			<td>PeproTech, Inc.</td>
			<td>200-03</td>
			<td>5 ng/ml in NK media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-7</td>
			<td>PeproTech, Inc.</td>
			<td>200-07</td>
			<td>20 ng/ml in NK media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flt-3-Ligand</td>
			<td>PeproTech, Inc.</td>
			<td>300-19</td>
			<td>10 ng/ml in NK media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>In vivo Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin Sodium Salt</td>
			<td>Gold BioTechnology</td>
			<td>Lucna-500</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TurboFP650 plasmid</td>
			<td>Evrogen, Moscow, Russia</td>
			<td>FP731</td>
			<td>Subcloned into a Sleeping Beauty transposon based plasmid driven by the mCAGs promoter. Cells were then sorted on their expression of turboFP650 by FACS. Cells and plasmids can be obtained from our lab.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Spectrum Imaging System</td>
			<td>Caliper Life Sciences</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane bound IL-21 expressing artificial antigen presenting cells</td>
			<td>MD Anderson, Houston, TX</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>contact: Dean A. Lee. <a href="http://www.jove.com/video/2540/expansion-purification-functional-assessment-human-peripheral-blood" target="_blank">http://www.jove.com/video/2540/expansion-purification-functional-assessment-human-peripheral-blood</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Firefly luciferase expressing hESCs</td>
			<td>University of Minnesota, Minneapolis, MN</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>contact: Dan S. Kaufman . H9 cells modified with a Sleeping Beauty transposon based method (references 13 and 14). Expression of firefly luciferase is driven by the mCAGGS promoter. Following the firefly luciferase gene is an IRES element at the 5' end of a GFP:zeocin fusion construct.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TurboFP650 expressing K562 cells</td>
			<td>University of Minnesota, Minneapolis, MN</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>contact: Dan S. Kaufman. Description under plasmid comments section</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Materials Table.

development, expansion, and in vivo monitoring of human nk cells from human embryonic stem cells (hescs) and induced pluripotent stem cells (ipscs)

हम एक फीडर से मुक्त दृष्टिकोण का उपयोग undifferentiated hESCs और iPSCs से प्राकृतिक हत्यारा (एन.के. सेल) पाने के लिए एक तरीका मौजूद है. इस विधि 4 सप्ताह संस्कृति के बाद एन.के. कोशिकाओं के उच्च स्तर को जन्म देता है और कृत्रिम प्रतिजन कोशिकाओं के साथ आगे 2 लॉग विस्तार से गुजरना कर सकते हैं. इस प्रणाली में विकसित hESC और iPSC व्युत्पन्न एन.के. कोशिकाओं को एक परिपक्व phenotype और समारोह है. आनुवंशिक रूप से परिवर्तनीय एन.के. कोशिकाओं की बड़ी संख्या का उत्पादन दोनों बुनियादी यंत्रवत के साथ ही विरोधी ट्यूमर के अध्ययन के लिए लागू है. HESC व्युत्पन्न एन.के. कोशिकाओं में जुगनू luciferase की अभिव्यक्ति एक गैर इनवेसिव दृष्टिकोण एन.के. सेल engraftment, वितरण, और समारोह का पालन करने की अनुमति देता है. हम भी दो अलग सेल आबादी के अलग निगरानी और अधिक स्पष्ट vivo में उनकी बातचीत को अनुमति देता है कि एक दोहरे इमेजिंग योजना का वर्णन है. Vivo इमेजिंग में व्युत्पत्ति, विस्तार, और दोहरे का यह तरीका एक विश्वसनीय एन.के. कोशिकाओं के उत्पादन के लिए दृष्टिकोण और उनके evalu प्रदान करता हैवर्तमान एन.के. सेल दत्तक उपचार में सुधार के लिए आवश्यक है जो समझना.

स्पिन ईबी दृष्टिकोण का उपयोग hematopoietic पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं की पीढ़ी hESCs और iPSCs से इष्टतम एन.के. सेल के विकास के लिए अनुमति देता है. जैसा कि चित्र 2 में प्रदर्शन, दिन 11 स्पिन ईबीएस उच्च CD34 व्यक्त पूर्वज को?...

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Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

इस प्रोटोकॉल के विकास, विस्तार, और hESCs और iPSCs से व्युत्पन्न एन.के. कोशिकाओं के vivo इमेजिंग में वर्णन करता है.

विकास, विस्तार, और<em&gt; विवो में</em&gt; मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESCs) से मानव एन.के. कोशिकाओं की निगरानी और और प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

और मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESC) के प्रसार और भेदभाव के लिए एक 3 डी मंच के रूप में विभिन्न प्रजातियों के लिए alginate microcapsule

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

मांसपेशियों के उत्थान के माउस मॉडल में प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल-व्युत्पन्न मेसोंगियोब्लास्ट की तरह मायोजेनिक प्रोजेनिटर का प्रत्यारोपण

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

एकल कक्षों और 3 डी कारावास में एकल भ्रूण आदेश: उच्च सामग्री स्क्रीनिंग के लिए एक नई डिवाइस

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

कुशल पीढ़ी और फीडर का संपादन-CRISPR-Cas9 प्रणाली का उपयोग मानव अग्नाशय कोशिकाओं से मुक्त IPSCs

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method

पेट की त्वचा और प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल की पीढ़ी से वयस्क मानव डर्मल फाइब्रोब्लास्ट का अलगाव एक गैर एकीकृत विधि का उपयोग कर

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

ह्यूमन प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल और इम्यूनोस्टेनिंग द्वारा लक्षण वर्णन से परिपक्व सेरिबेलर ऑर्गेनॉइड की स्केलेबल जनरेशन

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions

रासायनिक रूप से परिभाषित परिस्थितियों में मानव प्रेरित Pluripotent स्टेम कोशिकाओं से परिपक्व गुर्दे Podocytes के निर्देशित भेदभाव

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

मानव प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स में एकल सेल ऑप्टिकल एक्शन संभावित माप

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

In vitro Induction of Human Dental Pulp Stem Cells Toward Pancreatic Lineages

In vitro Induction of Human Dental Pulp Stem Cells Toward Pancreatic Lineages

इन विट्रो अग्नाशय के वंश की ओर मानव दंत लुगदी स्टेम सेल का प्रेरण

As of 2000, the success of pancreatic islet transplantation using the Edmonton protocol to treat type I diabetes mellitus still faced some obstacles. ...

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

फाइब्रोब्लास्ट व्युत्पन्न मानव इंजीनियर संयोजी ऊतक स्क्रीनिंग अनुप्रयोगों के लिए

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...