Name: in vivo modeling of the morbid human genome using danio rerio
Uploaded: 2013-08-24T14:00:00
Duration: 12 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio at JoVE.com

ونحن نعترف الدعم من الصيف بحوث زمالة جامعة ديوك العميد (AN)، جمعية القلب الأمريكية (AHA) زمالة 11POST7160006 (CG)، المعاهد الوطنية للصحة (NIH) منح R01-EY021872 من المعهد الوطني للعيون (EED)، R01HD04260 من المعهد الوطني لصحة الطفل والتنمية (NK)، R01DK072301 وR01DK075972 من المعهد الوطني للسكري والجهاز الهضمي واضطرابات في الكلى (NK)، والاتحاد الأوروبي (بتمويل من الاتحاد الأوروبي ال 7 FP تحت GA NR 241955، مشروع SYSCILIA؛. EED، NK) NK هو جان الكرام وجورج BRUMLEY أستاذ.

1. المعلوماتية الحيوية تحليل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد ما إذا كانت الجينات البشرية من الفائدة لديها ortholog الزرد، وإذا كان الأمر كذلك، كم من النسخ. نوصي انفجار متبادلة ( <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/" target="_blank">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/</a> ) من البروتين البشري ضد الجينوم الزرد، وانفجار لاحق من أفضل الزرد ضرب ضد الجينوم البشري. الإرادة الحقيقية orthologs يكون أفضل ضرب في كل حالة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد حجم الإطار القراءة المفتوحة (ORF) من الجينات البشرية. إذا كان أطول من 6 كيلو بايت، هذا النموذج هو مستعصية على الحل في الوقت الحاضر بسبب القيود المفروضة على جودة عالية في النسخ المختبر من القوالب طويلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على أو إنشاء بناء يحتوي على ORF الإنسان في pCS2 + العمود الفقري النواقل (أو ما يعادلها ناقلات مع 5 &#39;SP6 موقع النسخ و3&#39; بوليا إشارة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصميم MO لمنع الربط أو الترجمة من الجين الزرد المستهدفة. في حالة وجود نسخ متعددة في الجينوم الزرد، ذره خياران: أ) تصميم من المنظمات الأعضاء إضافية، أو ب) تحديد موقع لصق حفظها تماما بين النسخ التي ضد مو واحد يمكن أن تكون فعالة. تتوفر في بعض متواليات MO نشرت <a href="http://www.zfin.org" target="_blank">www.zfin.org</a> . </li></ol> 2. تحليل التعبير في البلدان النامية الأجنة الزرد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد ما إذا كان يتم التعبير عن ortholog الزرد في سياق الزمانية المكانية ذات الصلة قراءات المظهري. إذا توجد بيانات متاحة للتعبير الجينات في المصالح، وإجراء النسخ العكسي (RT)-PCR باستخدام [كدنا] من الأجنة الزرد كليا أو التهجين في الموقع. (راجع 2،3). </li></ol> 3. الطفرات موقع الموجه <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصميم الاشعال الطفرات 25-45 قواعد في الطول، مع الطفرة المرجوة في المركز. يجب أن تكون درجة حرارة انصهار التمهيدي أكبر من أو يساوي 78 درجة مئوية. تصميم التمهيدي إلى الأمام وعكس الطفرات ليصلب لالمعاكسخيوط من البلازميد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول الاشعال لتأكيد تسلسل ORF بعد الطفرات، وهذه ينبغي البلاط عبر ~ 300 أقسام قاعدة بين زوج لتغطية ORF كامل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميع رد فعل الطفرات مع البلمرة عالية الدقة ودورة على النحو التالي (1: 95 ° C 30 ثانية، 2: 95 ° C 30 ثانية، 3: 55 ° C 1 دقيقة، 4: 68 ° C 6 دقائق، 5: الذهاب إلى 2 18X، 6: 4 ° C إلى الأبد، 7: نهاية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 ميكرولتر DpnI تقييد نوكلياز داخلية في رد الفعل لإزالة قالب ميثليته السد؛ احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل 2 ميكرولتر من رد فعل الطفرات في الخلايا المختصة 20 ميكرولتر وفقا لبروتوكولات القياسية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار 3-4 المستعمرات وتطعيم 5 مل من وسائل الاعلام LB التي تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة. يهز عند 37 درجة مئوية خلال الليل في 225 دورة في الدقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Miniprep الحمض النووي وتحديد تركيز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسلسل موقع تحور لتأكيد وجود طفرة في المصالح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسلسل كامل ORF لتأكيد سلامة تسلسل. </li></ol> 4. النسخ في المختبر مرنا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام خطي pCS2 + قالب، وتوليد مرنا توج باستخدام mMessage mMachine SP6 مجموعة (AMBION). ونحن نوصي باستخدام نصف كميات عنصر رد الفعل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنقية عينة الحمض النووي الريبي مع هطول LiCl أو كلوروفورم الفينول كما هو موضح في تعليمات عدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد تركيز مرنا باستخدام الامتصاصية، وضمان سلامة مرنا باستخدام الكهربائي للهلام، وتخزين العينة في ثلاثة أو أكثر من aliquots في -80 درجة مئوية لتصبح جاهزة للاستخدام. نحن لا ننصح متعددة تجميد أذاب دورات من مأخوذة مرنا. </li></ol> 5. في الفحص الجسم الحي من فقدان البديل من وظيفة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على الأجنة الزرد من التزاوج الزرد الطبيعية، والمحافظة عليها عند 28 درجة مئوية في الماء الجنين في 6 أو 10 أطباق سم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء جرعة منحنى استجابة morpholino لتقييم خصوصية النمط الظاهري، والكفاءة MO MO وسمية. حقن جرعة منحنى فيلا يقل عن ثلاثة تركيزات مختلفة بين 1-10 نانوغرام MO إلى 50-100 (1-4 مرحلة الخلية) الأجنة الزرد / دفعة. يجب المنظمات الأعضاء فعالة تؤدي إلى زيادة الجرعة التي تعتمد على نسبة من الأجنة المصابة في دفعة واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأجنة النمط الظاهري في المرحلة التنموية المناسبة على أساس التعبير عن الجينات الزرد المستهدفة من الفائدة والمرحلة التي وسيراعى في النمط الظاهري ذات الصلة. قد يكون هذا إما كميا (مثل قياس بين الهياكل التشريحية) أو النوعية (على أساس معايير موحدة المظهري). سجل لجميع الحقن&gt; 24 HPF: ينبغي أن يعامل الأجنة مع PTU (0.003٪ 1-فينيل-2-ثيوريا في وسائل الإعلام الجنين) في 24 HPF إلى الحد الأقصى من تشكيل الخلايا الصباغية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للصق تسد المنظمات الأعضاء، واختبار كفاءة MO عن طريق استخراج الحمض النووي الريبي مجموع من الجنين كله لست] في نقطة زمنية من التهديف المظهري، وتوليد [كدنا] وإجراء RT-PCR من الجين المستهدف باستخدام بادئات المرافقة الموقع المستهدف MO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للتحقق من effic قمعiency من TB-MO، الحصاد كله لست] بروتين الجنين وإجراء immunoblotting لمقارنة مستويات البروتين المستهدفة مقابل السيطرة. ومع ذلك، فإن هذا النهج لا يستجيب للجميع الجينات المستهدفة لأن هناك محدودة عبر التفاعل لكثير من الأجسام المضادة للبروتينات التجارية الزرد. طريقتين غير المباشرة لإظهار MO خصوصية، ما يلي: أ) مما يدل على أن هناك تأثير تعتمد على الجرعة على النمط الظاهري؛ وب) تبين أن شارك في حقن مرنا wildtype مع TB-MO إنقاذ النمط الظاهري بكفاءة. لهذه الأسباب، فإننا نوصي مانع لصق عندما يكون ذلك ممكنا لأن كفاءة يمكن رصدها مباشرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا لوحظ النمط الظاهري انتقل إلى الخطوة 5.7، إذا لوحظ أي النمط الظاهري انتقل إلى الخطوة 6.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لالظواهر النوعية، حدد جرعة MO التي تتأثر 50-75٪ من الأجنة؛ للالظواهر الكمية، حدد جرعة MO في التدبير الذي المظهري يختلف كثيرا عن البرية من نوع (P &lt;0.001). حقن دفعات جديدة من الزرد الإدارة الانتخابيةryos (1-4 مرحلة الخلية، ن = 50-100/batch) مع كوكتيل يحتوي على &quot;الفحص&quot; جرعة من MO ومنحنى الجرعة من مرنا WT الإنسان (تتراوح 10-200 مرنا خريج، وهذه جرعة كبيرة من overexpression ضمان أعلاه خط الأساس من أي نص واحد، وهو ما يمثل 0.25-0.5٪ من إجمالي مرنا بوليا في الجنين الزرد). 4 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء التهديف ملثمين من دفعات الحقن؛ اختيار جرعة مرنا WT مع الانقاذ الأكثر أهمية في المقارنة إلى MO وحده، وهذا هو &quot;الاختبار&quot; جرعة من مرنا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن دفعات جديدة (1-4 مرحلة الخلية، ن = 50-100/batch) مع جرعة من فحص MO وجرعة مقايسة من مرنا الإنسان متحولة. الأجنة النمط الظاهري في المرحلة المناسبة، ومقارنة النتائج إلى WT الانقاذ مرنا الإنسان باستخدام اختبار الإحصائية المناسبة (اختبار t أو خي مربع). انظر الشكل 1 لنتائج وانتقل إلى الخطوة 7. حقن جرعات من فحص WT ومتحولة مرنا وحدها للسيطرة على الآثار السمية مرنا. </li></ol> 6. في الفحص الجسم الحي من البديل دومinant سلبي أو كسب وظيفة الآثار <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا لوحظ عدم فقدان وظيفة النمط الظاهري (الخطوة 5.5) أو إذا مرنا متحولة يثير الظواهر لا تختلف كثيرا عن MO وحده (الخطوة 5.7)، وضخ منحنى الجرعة تتراوح 10-200 خريج WT مرنا الإنسان (ونحن نوصي 25، 50 ، و 100 خريج واختبار أولي) إلى دفعات الجنين (1-4 مرحلة الخلية؛ 50-100 الأجنة / دفعة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في المرحلة المناسبة (انظر 5.3 أعلاه)، وإجراء التهديف المظهري، وتحديد أعلى جرعة التي لم يكن هناك عدد كبير من الأجنة الميتة إحصائيا و / أو المتأثرة بالمقارنة مع الضوابط uninjected. هذه هي الجرعة &quot;فحص&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن جرعة مقايسة من مرنا الإنسان متحولة (1-4 مرحلة الخلية؛ 50-100 الأجنة / دفعة). الأجنة النمط الظاهري ومقارنة النتائج إلى التهديف من الجرعة مقايسة من WT حقن مرنا الإنسان أو MO تركيز مقايسة. انظر الشكل 1 لنتائج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كانت النتائج لا يمكن تمييزها عن MO، عاير مرنا متحولة الإنسان مرنا مع WTومقارنة WT الإنسان وحقن مرنا متحولة. تحسين الظواهر مع متحولة زائد WT دفعات مرنا حقن يشير إلى السلبية المهيمنة. أي تحسن يشير إلى وجود مكاسب من وظيفة. </li></ol> 7. تتكاثر في الجسم الحي اختبار النتائج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكرار في المقايسات فيفو ما لا يقل عن ثلاث مرات. </li></ol> 8. دمج الزرد في البيانات الإمراضية الجسم الحي مع خطوط أخرى من الأدلة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مقارنة البيانات التي تم الحصول عليها من التجارب المرضية الزرد إلى: البيانات الجينية ضمن النسب (إن وجد)، وبيانات السكان تردد السيطرة، في الدراسات المختبرية (المقايسات خلية مقرها الاستقرار البروتين، وتوطين الخلوية، مما يشير إلى الإخراج، أو النشاط الأنزيمي). </li></ol>

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

الطرق الموضحة هنا تمثل بروتوكول عام ينطبق على فحص التغيرات nonsynonymous يرتبط مع مجموعة متنوعة من الظواهر مرض وراثي الإنسان (الجدول 2، الشكل 3). وقد أثبتت نهجنا مفيدة لتقييم التأثير المحتمل للتغير في الظواهر المرض، والمساعدة في تشريح آليات المرض (مثل مساهمة الطفرات السلبية المهيمنة لمتلازمة بارديه-بيدل، وهو اضطراب وراثي جسمي مقهور في المقام الأول 17). حتى الآن، من خلال وضع شجرة القرارات المقدمة، قمنا غرار بتكلفة معقولة والوقت ما يزيد على 200 الجينات المرتبطة سببيا مع اضطرابات وراثية، إلى وجود فائض من 1،000 الأليلات. على الرغم من أن لم تناقش بالتفصيل هنا، لقد أظهرنا أيضا أن هذه الأساليب هي المناسبة لنمذجة أنواع أخرى من الآفات الجينية، مثل التنوع في عدد النسخ (التنوعات في عدد النسخ)، وكذلك والوراثية التفاعلات. التحليلات لمثل هذه الأحداث هي خارجة عن نطاقوصف الطريقة الحالية، على الرغم من أنها تعتمد بشكل أساسي على نفس مبدأ الاختبار المنهجي للجينات مرشحة (بما في ذلك زوج من الجينات في وقت واحد حقن) لتحديد الاستقراء أو تفاقم الظواهر مناسبة سريريا. على سبيل المثال، لتوضيح أي من الجينات 29 في 16p11.2 CNV قد تكون ذات صلة إلى صغر الرأس الملحوظة لوحظ في المرضى الذين يعانون من الازدواجية من 660 قطعة الجيني كيلوبايت، mRNAs والمقابلة لكل من الجينات 29 ضمن القطعة تم حقن ورئيس أجريت قياسات حجم في 2 و 5 DPF DPF، وكشف عن مساهمة كبيرة من نسخة واحدة، KCTD13 21 بالإضافة إلى ذلك، وقد استخدمنا هذا النموذج للتفاعلات وراثية فحص الآفات الجيني في المرضى الذين يعانون من متلازمة بارديه على حد سواء-بيدل والمرض هيرشسبرونغ 22 من خلال المقارنة بين MO قمع الجينات المسببة للاثنين هويات السريرية بشكل منفصل في وقت واحد، وكنا قادرين على تحديد النمط الظاهري الناتج كما باينانوغرام تفاعل التآزر بدلا من مجرد شدة المضافة. على الرغم من قيامه بإنشاء حساسية عالية (98٪) والنوعية (&gt; 82٪) عن المتغيرات التي تسهم في ciliopathies 17، ليس لدينا حتى الآن بيانات كافية لتحديد ما إذا كانت هذه قابلة للتعميم لجميع قراءات المظهري في نماذج الزرد. وتوقع عدد كبير من الأليلات، أن تفعل ذلك وراثيا لتكون إما حميدة أو المسببة للأمراض، يجب أن يتم اختبار داخل كل فئة المظهري. وسوف يكون هذا أهمية خاصة لتنفيذ مثل هذه المقايسات في إعداد سريرية، حيث تفسير وظيفي من VUSs يمكن إبلاغ التشخيص والتدبير العلاجي فقط إذا فهم قوية من ايجابيات كاذبة والسلبيات كاذبة يمكن أن تصاحب تقديم هذه النتائج إلى الأطباء والمرضى. ومع ذلك، يمكن لهذه الأساليب تسهم إسهاما كبيرا نحو فهم أفضل لطبيعة المرض الوراثية البشرية. ونحن نتوقع أن هذه النماذج لا إلا أن تكون بمثابة founكما سيتم توظيف dation لتحسين تفسير المعلومات الجينية السريرية، ولكن كنماذج المفيد إجراء شاشات العلاجية. في البيانات الجسم الحي كما يمكن مقارنة في سيليكون والتوقعات الحسابية من مصادر مثل PolyPhen 23، فرزت 24، تعدد الأشكال وGO 25، أو MutPred 26 لإظهار التوافق. لاحظ أنه تم العثور عليها في دراسة سابقة للتنبؤ قواعد البيانات النيوكلوتايد &amp; GO وMutPred ليكون أكثر دقة، مع دقة تصل إلى 0.82 و 0.81 فقط، على التوالي. 27 على الرغم من أننا قد أوجز متانة هذه الأساليب لمجموعة فرعية من العيوب التشريحية للأطفال (الجدول 2، الشكل 3)، وبعض الظواهر هي أقل لين العريكة بواسطة هذه الأساليب. على الرغم من وجود بعض الاستثناءات، وهناك ثلاث فئات رئيسية من اضطرابات غير قابلة للبروتوكول لدينا. اضطرابات يظهر في مرحلة الكهولة (مثل مرض باركنسون) تمثل تحديا لنموذج في نظام الجنينية. بطء بروغression الظواهر التنكسية (مثل الخرف الجبهي) قد تتطلب وقتا أكثر مما النافذة DPF سبعة من النشاط MO لإنتاج النمط الظاهري. تكنولوجيات ضربة قاضية الجينات الأخرى مثل رني وسيرنا متاحة لتتداخل مع أو تحط من الجين المستهدف، ولكن ثبت أن لا شيء غير محددة ومستقرة، وغير سامة، أو طويلة الأمد كما المنظمات الأعضاء 28، مما يحد أيضا الإطار الزمني لphenotyping. ثالثا، بعض الهياكل الفقارية، مثل الرئة الثدييات، لا يكون لها هيكل orthologous بما فيه الكفاية في الجنين الزرد. قدمنا ​​أيضا خطة طوارئ اقترح للتحقيق في تلك الحالات التي WT حقن مرنا الإنسان يؤدي إلى النمط الظاهري، على الرغم من أننا نحذر هذه حالة غير عادية وغير مرغوب فيه. قد بعض الظواهر المرض ثم تتطلب درجة أكبر من التجريد وتأجير الأرحام. فمن الممكن أن وظيفة الجين قد تباعدت بما فيه الكفاية لإضعاف التشابه المظهري بين نموذج و TRUE النمط الظاهري، أو أن الزرد علم وظائف الأعضاء يعقد بطبيعتها آثار المرض التي يسببها. في مثل هذه الحالات، فإننا نقترح مزيد من تشريح النمط الظاهري أنتجت قبل الفصل. لقد أنتجنا بعض الأمثلة الناجحة التي تم غرار الظواهر الإشكالية لهذا الاختبار في الأجنة الزرد. على سبيل المثال، والطفرات في TCF8، ويعاير الجين المرتبط فوكس ضمور القرنية (FCD)، وذلك باستخدام بروتوكول لدينا باستخدام العيوب تكون المعيدة باعتبارها قراءات المظهري بديلة استنادا إلى الأدوار المعروفة لهذا النص في التنمية في وقت مبكر. 29 وفي حالات أخرى، مثل كما الحثل العضلي الذي يصيب البالغين التي تسببها طفرات في DNAJB6، كنا قادرين على توليد الظواهر ليف عضلي في الأجنة 5dpf على الرغم من حقيقة أن البشر هم مجردة من العضلات ملموس في علم الأمراض من العقود الثلاثة أو الأربعة الأولى من الحياة. 19 بالإضافة إلى نماذج متحولة عابر المعروضة هنا، اتخذت الآخرين أيضا ADVANTAجنرال الكتريك لهذا النظام عابرة إلى نموذج المرض الإنسان في مجموعة متنوعة من أجهزة الجسم. في مثال واحد، كان على غرار التهاب الشبكية الصباغي في الزرد من قبل ضربة قاضية للRP2 الجينات، مما يؤدي إلى موت الخلايا في شبكية العين وانخفاض التصفيح الشبكية. أدى الانقاذ مع الإنسان مرنا من النوع البري في التنمية من جميع الطبقات الثلاث من التصفيح في شبكية العين، في حين أن أربعة من أصل خمسة mRNAs ومتحولة فشلت في إنقاذ 30 على الرغم من أن هذا النموذج من اضطراب الحواس البشرية يستند إلى النمط الظاهري المورفولوجية، فمن الممكن أيضا أن استجابة مقايسة للمؤثرات مثل جفل الصوتية أو prepulse تثبيط 47 مؤخرا، تم استخدام نموذج الزرد للتحقيق الزهايمر المرضية المرض من خلال بروتين اميلويد السلائف. أظهرت 31 المؤلفان أن تسبب ضربة قاضية الجينات ضعاف ثمرة محواري الخلايا العصبية الحركية، والتي يمكن انقاذ مع مرنا الإنسان. وقد أثبت هذا النموذج لتكون خاصة بالمعلومات، كما عرض نماذج الماوس فقط phenot خفيةypes (ضربة قاضية واحدة) أو الفتك بعد الولادة (ضربة قاضية مزدوجة). ساعدت القدرة على تقييم الأجنة الزرد في الجسم الحي خلال مراحل تطوره لتبين تأثير المسببة للأمراض انخفاض بروتين اميلويد السلائف، وكذلك أدلة مباشرة على أن يكون البروتين يتطلب مجال خارج الخلية وبين الخلايا من أجل وظيفة مناسبة. وتشمل نماذج بارزة أخرى من ضمور العضلات إضافية 32، الماس Blackfan فقر الدم 33، آكسينفيلد-Reiger متلازمة (تطوير العين والجمجمة) 34، مرض التهاب الأمعاء 35 (نشاط مضاد للجراثيم)، مرض باركنسون 36 (الخلايا العصبية وفقدان تحرك)، ومصادرة 37 (استسقاء الرأس وفرط النشاط). أكثر شيوعا هي خطوط الزرد متحولة التي ثبت أيضا أن ألخص النمط الظاهري الأمراض التي تصيب البشر. استعرضت في 1،38، وتشمل نماذج سرطان الدم، سرطان الجلد، بعضلة القلب المتوسعة، ضمور العضلات دوشين،وغيرها الكثير.

تفسير وظيفي من المعلومات الوراثية والتنازل عن قيمة السريرية التنبؤية إلى التركيب الوراثي يمثل مشكلة كبيرة في مجال علم الوراثة الطبية وأصبحت مؤثرة على نحو متزايد مع الجدوى التقنية والاقتصادية المتسارعة من تسلسل الجينوم واسعة. ولذلك، فمن الضروري لتطوير وتنفيذ نماذج جديدة لاختبار الإمراضية من المتغيرات ذات الأهمية غير معروف (VUS) الكشف في المرضى. يجب أن تكون هذه المقايسات ثم دقيقة، والوقت وفعالة من حيث التكلفة، والميناء القدرة على تحفيز التحول إلى فائدة سريرية. بينما كان الماوس تقليديا أداة للاختيار في مجال النمذجة الأمراض التي تصيب البشر، الزرد آخذة في الظهور كبديل علميا ومواتية اقتصاديا. على عكس الفأر، الزرد البيولوجيا يتيح الوصول السهل والمناسب لجميع مراحل النمو، وساعد على وضوح بصري من الأجنة التي تسمح للتصوير في الوقت الحقيقي من الأمراض النامية. <sup&gt; 1 وقدمت جيل حديث نسبيا من خطوط الزرد متحولة إجراء اختبارات إضافية وخيارات النمذجة، والتي تستخدمها العديد من الدراسات في وظيفية، ولكن لا تزال هذه التكنولوجيا لتكون محدودة (تم استعراضها في 1،38). ليس فقط هي المسوخ الجينية مع المغلوب الإضافية من الطفرات محددة شاقة لتحقيق، بل هي أيضا غير قابلة للتحليل متوسطة أو عالية الإنتاجية لاختبار مجموعة من الطفرات في جين واحد. الأهم من ذلك، يمكن للجناح واحد من الاختبارات تقديم معلومات ليس فقط عن القدرة المسببة للأمراض من الأليلات، ولكن أيضا لاتجاه تأثير على المستوى الخلوي (مثل فقدان وظيفة مقابل مكاسب من وظيفة)، وهو أمر حاسم لوضع الميراث إعلام في الأسر، وخصوصا عندما تؤوي الأنساب بشرية صغيرة معلومات محدودة عن طريقة انتقال الوراثية. لمزيد من المقارنة لاستخدامات الماوس المتاحة والنماذج الزرد، انظر الجدول رقم 1. نلاحظ أيضا أنإعادة قيود متأصلة في النظام النموذجي الزرد. على الرغم من أن د. rerio يكون التطوير الأولي السريع للأجهزة الجسم، النضج الجنسي يتطلب ما يقرب من ثلاثة أشهر. وبسبب هذا، واضطرابات ما قبل الولادة والأطفال الظهور هي الأكثر قابلية لهذا النموذج التعبير عابر. في حين المثالي لإجراء شاشات كبيرة مركب كيميائي، واستخدام المسوخ الجينية ليست مجدية لاختبار منهجي الآلاف من المتغيرات التي تسهم في nonsynonymous، والاستمرار في الكشف عن الاضطرابات في طب الأطفال. الاختبارات تكامل وصفها هنا الاستفادة من هذا معرفة منشأ التجريبية، ودرجة عالية من التماثل، والحفاظ على وظيفة بين البروتينات البشرية والزرد، بشكل خاص بالنسبة لجزيئات اللازمة لعمليات الحفظ التنموية. الشكل 1 يبين الاختبار وتحديد استراتيجية للآثار أليل مختلف. كلا فقدان وظيفة (LOF) والمقايسات المهيمنة لا يمكن أن يؤديها. لLOF، تبدأ التجربة مع قمع الجينات في المصالح مع ضربة قاضية morpholino، ويعاير لالظواهر التي قد تكون ذات صلة إلى النمط الظاهري السريرية قيد التحقيق. لا يمكن أن يتحقق قمع إما عن طريق منع ترجمة من خلال استهداف MO في أو قرب بدء موقع متعدية من الزرد موضع (ترجمة مانع morpholino؛ tbMO) أو عن طريق التداخل مع الربط عن طريق وضع MO على تقاطع لصق، الأمر الذي أدى عادة إما إدراج إنترون اكسون أو الشاذة تخطي (لصق حجب morpholino؛ sbMO). وفي وقت لاحق، وقدم مرنا توج من نص الإنسان orthologous ويتم قياس الانقاذ قابلة للقياس الكمي من النمط الظاهري. وبمجرد إنشاء الفحص، ويمكن إدخال طفرات مرشح في رسالة الإنسان ويعاير لقدرتها على إنقاذ النمط الظاهري MO التي يسببها في نفس الكفاءة ومرنا الإنسان WT. وعلى العكس، لمرشح الأليلات السائدة، مرنا الإنسان (ولكن ليس MO) هي introducإد مع توقع بأن مرنا الإنسان WT لن يؤثر بشكل صارخ علم التشريح وعلم وظائف الزرد، في حين مقدمة من الطفرات اختبار أن يكون لها تأثير مهيمن من شأنها أن تحفز الظواهر مماثلة لتلك التي لوحظت في حالة اكلينيكية على البشر. هذه التجربة يمكن أن تكون كذلك غرامة الحبيبات لتشريح ما إذا كان الأثر المهيمن يحدث من قبل مكسب من وظيفة (GOF) أو آلية المهيمنة السلبية عن طريق مزج مرنا الإنسان WT ومتحولة؛ للأحداث GOF، إضافة مرنا الإنسان WT ومن المتوقع أن يكون غير ذي صلة، في حين لالأليلات السائدة السلبية، ومزج من مرنا WT ومتحولة وينبغي تغيير شدة النمط الظاهري الناجمة عن رسالة متحولة. في جميع الحالات، ونحن نوصي جميع مجموعات من حقن (MO مع مرنا الإنسان WT مقابل morpholino مع متحولة الإنسان الخ مرنا أن يؤديها، ويفضل في نفس القابض من الأجنة (انظر الشكل 1) التفسير هو على النحو التالي: لاختبارات LOF: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كانت ضربة قاضيةينتج النمط الظاهري الذي يمكن انقاذ مكافئ من قبل مرنا متحولة وWT، وأليل من المرجح حميدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان الإنقاذ متحولة من النمط الظاهري ضربة قاضية لا يمكن تمييزه عن النمط الظاهري ضربة قاضية نفسها، وأليل هو لاغ وظيفية احتمالا. التجربة لا تستطيع أن تميز بين القيم الخالية الحقيقية (أي بروتين وظيفي) ومستويات النشاط بروتين فائقة الانخفاض التي ليست لها القدرة الانقاذ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان الإنقاذ متحولة من النمط الظاهري ضربة قاضية هو أفضل إحصائيا من MO، لكن أسوأ من WT، وأليل من المحتمل أن يكون ناقص المفعول كما يوضح هذا نتيجة فقدان جزئي من وظيفة. </li></ul> لاختبارات السائدة: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا لم يكن هناك النمط الظاهري ضربة قاضية، ولكن حقن مرنا WT تنتج النمط الظاهري، خطة طوارئ يجب أن تستخدم إذا كانت التجربة هي في المضي قدما (انظر أدناه). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا لم يكن هناك النمط الظاهري ضربة قاضية وحقن مرنا WT لا ينتج النمط الظاهري، التجربة العائدات على النحو المعتاد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا حقنمن مرنا متحولة ما يعادل ذلك من البرية من نوع مرنا، قد يكون أليل إما حميدة أو فقدان وظيفة، أو الفحص قد فشلت. وهذا يتطلب مزيد من التجارب للتمييز بين هذه الخيارات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا حقن مرنا متحولة لا يمكن تمييزه من MO ضربة قاضية، من المحتمل تغيير وظيفة الجين المنتج في بعض الطريق. لتبين تغير في وظيفة، ينبغي إجراء المعايرة من مرنا متحولة مع من النوع البري مرنا بها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كانت نتيجة هذه المعايرة لا يمكن تمييزه إلى البرية من نوع مرنا وحده، فقد تبين أن المنتج بروتين متحولة يستخدم بروتين من النوع البري باعتباره الركيزة، كما وتتنوع تأثيره مع كمية من المعايرة. وهذا يدل على النمط الظاهري السلبية المهيمنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كانت نتيجة هذه المعايرة لا يمكن تمييزه إلى مرنا متحولة وحده، فقد تبين أن المنتج بروتين متحولة لم يعد لديه بنفس وظيفة من نوع البرية، وبالتالي لا يتأثر بمقدار البرية من نوع البروتين قبل المنتجأرسلت. هذا يدل على أن أليل هو مكسب الأرجح من وظيفة. </li></ul> خطة طوارئ: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا لم يعرض النمط الظاهري من MO ضربة قاضية، لكن لا الحاضر مع مرنا WT، يمكن أن يحدث مزيد من التجارب، على الرغم من أننا نؤكد أن هذا الوضع ليس وضعا مثاليا. وينبغي معاير مرنا الإنسان WT للحد من النمط الظاهري، ويمكن أيضا أن تستخدم كنقطة مجموعة جديدة. يمكن تقييم مزيد من WT ومرنا الإنسان متحولة coinjection يعتمد على قدرة إنقاذ من متحولة. </li></ul>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0530S, M0530L </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DpnI restriction endonuclease</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0176L, R0176S </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Max Efficiency DH5&alpha; competent cells</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18258-012 </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Big Dye Terminator</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4337455</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>mMESSAGE mMACHINE Kit </td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1340, AM1344, AM1348</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td >Morpholino</td>
			<td>Gene-Tools</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td >1-phenyl-2-thiourea (PTU) </td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P7629</td>
			<td>Prepare as 0.003% PTU in embryo media </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td >Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148 </td>
			<td>For embryos that must be fixed prior to phenotyping, prepare as 4%</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td >Tricaine methane sulfonate</td>
			<td>Western Chemical</td>
			<td>N/A </td>
			<td>For anesthetization and euthanasia </td>
		 </tr>
 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>PTC-225 Tetrad Thermal Cycler</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>Any equivalent thermal cycler</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Nano Drop 2000 spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>SMZ 745T Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>AZ100 Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DS Fi1 Digital Camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>For color/fluorescent imaging</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DS QiMC Digital Camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>For black/white imaging</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Advanced Resarch 3.2 Imaging Software</td>
			<td>NIS- Elements</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

in vivo modeling of the morbid human genome using danio rerio

هنا، فإننا نقدم طرق لتطوير المقايسات للاستعلام تغييرات nonsynonymous يحتمل أن تكون هامة سريريا باستخدام تكامل في الجسم الحي في الزرد. الزرد (دانيو rerio) هي نظام الحيوانية مفيدة بسبب معرفة منشأ بهم التجريبية؛ أجنة شفافة لتمكين عرض السطحية، والخضوع السريع فيفو السابقين التنمية، ويمكن التلاعب بها وراثيا 1 وقد سمحت هذه الجوانب لتحقيق تقدم كبير في تحليل التطور الجنيني،. العمليات الجزيئية، والتخلق الإشارة. أخذت معا، ومزايا هذا النموذج الفقاريات جعل الزرد قابلة للغاية لنمذجة العيوب التنموية في أمراض الأطفال، وفي بعض الحالات، واضطرابات يظهر في مرحلة الكهولة. لأن الجينوم الزرد يتم حفظها للغاية مع أن البشر (~ 70٪ orthologous)، فمن الممكن أن ألخص الحالات المرضية البشرية في الزرد. ويتم إنجاز هذا إما عن طريق الحقن من M الإنسان متحولةالحمض النووي الريبي للحث على زيادة المهيمنة سلبية أو الأليلات وظيفة، أو الاستفادة من morpholino (MO) أليغنوكليوتيد] العقاقير لقمع الجينات لتقليد فقدان المتغيرات وظيفة. من خلال تكامل من الظواهر MO التي يسببها الإنسان مرنا مع المغطاة، نهجنا تمكن تفسير تأثير ضار من الطفرات في تسلسل البروتين البشري يعتمد على قدرة مرنا متحولة لانقاذ قابلة للقياس، النمط الظاهري ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. النمذجة من الأليلات الأمراض التي تصيب البشر يحدث من خلال Microinjection من الأجنة الزرد مع MO و / أو مرنا البشري في مرحلة الخلية 1-4، وphenotyping تصل إلى سبعة أيام بعد الإخصاب (DPF). ويمكن تمديد هذه الاستراتيجية العامة لمجموعة واسعة من الظواهر المرض، كما هو موضح في بروتوكول التالية. نقدم نماذجنا التي أنشئت لالتخلق إشارات، القحفي، القلب، وسلامة الأوعية الدموية، وظيفة الكلى، والهيكل العظمي الظواهر اضطراب العضلات، فضلا عن غيرهم.

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio at JoVE.com

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

هنا، فإننا نقدم مقاربة منهجية لتطوير ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية وحساسة ومحددة<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; المقايسات لتفسير التباين في علم الأمراض البشرية. التلاعب الجيني عابرة عبر Microinjection من WT ومتحولة مرنا الإنسان وmorpholino (MO) أليغنوكليوتيد] العقاقير تسخير معرفة منشأ من البلدان النامية الجنين الزرد لفحص الطفرات المسببة للأمراض بسرعة، وخاصة، ولكن ليس على سبيل الحصر، في سياق اضطرابات النمو البشري.

في النمذجة فيفو من المهووسين الجينوم البشري باستخدام دانيو rerio

Here,  we present methods for the development of assays to query potentially clinically  significant nonsynonymous changes using in  vivo complementation ...

Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (Danio rerio)

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish Danio rerio

الجسيمة والجميلة تشريح الأذن الداخلية الظهارة الحسية في اسماك الزرد الكبار ( دانيو rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

تدفق تنقية الخلوي للخلايا الفأر الانتصافي

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

تشريح القلب في اليرقات ، اسماك الزرد الأحداث والكبار ، دانيو rerio</em

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work ...

Regular Care and Maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) Laboratory: An Introduction

Regular Care and Maintenance of a Zebrafish Danio rerio Laboratory: An Introduction

العناية والصيانة العادية من اسماك الزرد (<em&gt; دانيو rerio</em&gt;) المختبر: مقدمة

This protocol describes regular care and maintenance of a zebrafish laboratory. Zebrafish are now gaining popularity in genetics, pharmacological and ...

Mouse Genome Engineering Using Designer Nucleases

الماوس الجينوم الهندسية عن طريق Nucleases مصمم

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well ...

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

عالية الإنتاجية<em&gt; دانيو Rerio</em&gt; طاقة الإنفاق الفحص

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

على صعيد رسم الخرائط الجينوم من المخدرات-DNA التفاعلات في الخلايا مع COSMIC (يشابك من الجزيئات الصغيرة لعزل لونين)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

في دراسة فيفو من تفاعل الانسان غشائي-خلية حوطية باستخدام مصفوفة جل التوصيل الفحص في الماوس

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

قياس صلابة من<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; ماوس Aortas باستخدام مجهر القوة الذرية

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

في المختبر و في فيفو النهج لتحديد نفاذية الخلايا الظهارية المعوية

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and ...