Name: in vivo neuronal calcium imaging in c. elegans
Uploaded: 2013-04-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans at JoVE.com

Verschillende mensen hebben bijgedragen aan het werk beschreven in dit document. CVG bouwde de experimentele opstelling, en LS, SHC, en CVG de uitgevoerde experimenten. CVG en SHC schreef het manuscript. Alle auteurs nam vervolgens deel aan het herzieningsproces en keurt de definitieve versie van het manuscript. Wij danken Paul Sternberg voor de GCaMP stam. Sommige nematoden stammen die in dit werk werden verstrekt door de Caenorhabditis Genetics Center (CGC), dat wordt gefinancierd door de NIH National Center for Research Resources (NCRR). De MATLAB beeldanalyse programma werd aangepast van die in 18. De auteurs werden ondersteund door Boston University en het Massachusetts Life Sciences Center.

1. Optische Setup <ol><li> Gebruik een standaard samengestelde microscoop met epifluorescentie imaging-mogelijkheden. We maken gebruik van een Nikon Eclipse Ti-U omgekeerde microscoop met een Intensilight HG Illuminator. </li><li> Voor de beste beeld-en signaalkwaliteit gebruik maken van een hoge vergroting, hoge numerieke apertuur doelstelling. Wij gebruiken meestal een Nikon X60 1,4 NA olie-immersie objectief. In sommige gevallen is het mogelijk om kleinere vergroting gebruiken (X40, X20) afhankelijk van het express...

<ol>
	<li>Miyawaki, A., Llopis, J., Heim, R., McCaffery, J. M., Adams, J. A., Ikura, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+Ca2++based+on+green+fluorescent+proteins+and+calmodulin.">Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin.</a> Nature. 388, 882-887 (1997).</li><li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+signal-to-noise+Ca(2+)+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein.">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nat. Biotechnol. 19, 137-141 (2001).</li><li>Kerr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+activity+of+neurons+and+muscles.">Imaging the activity of neurons and muscles.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Tian, L., Hires, S. A., Mao, T., Huber, D., Chiappe, M. E., Chalasani, S. H., Petreanu, L., Akerboom, J., McKinney, S. A., Schreiter, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6, 875 (2009).</li><li>Reiff, D. F., Ihring, A., Guerrero, G., Isacoff, E. Y., Joesch, M., Nakai, J., Borst, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+performance+of+genetically+encoded+indicators+of+neural+activity+in+flies.">In vivo performance of genetically encoded indicators of neural activity in flies.</a> J. Neurosci. 25, 4766-4778 (2005).</li><li>Rand, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylcholine.">Acetylcholine.</a> WormBook. , (2005).</li><li>Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+imaging+of+Caenorhabditis+elegans+using+nanoparticle-mediated+immobilization.">Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization.</a> PLoS ONE. 8 (1), e53419 (2013).</li><li>Byrne, A. B., Edwards, T. J., Hammarlund, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Laser+Axotomy+in+C.+elegans.">In vivo Laser Axotomy in C. elegans.</a> J. Vis. Exp. (51), e2707 (2011).</li><li>Kerr, R., Lev-Ram, V., Baird, G., Vincent, P., Tsien, R. Y., Schafer, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+calcium+transients+in+neurons+and+pharyngeal+muscle+of+C.+elegans.">Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans.</a> Neuron. 26, 583-594 (2000).</li><li>Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+in+vivo+imaging+of+neuronal+and+behavioral+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans.</a> Nat. Methods. 4, 727-731 (2007).</li><li>Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfabricated+array+of+clamps+for+immobilizing+and+imaging+C.+elegans.">A microfabricated array of clamps for immobilizing and imaging C. elegans.</a> Lab. Chip. 7, 1515-1523 (2007).</li><li>Gabel, C. V., Gabel, H., Pavlichin, D., Kao, A., Clark, D. A., Samuel, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+circuits+mediate+electrosensory+behavior+in+Caenorhabditis+elegans.">Neural circuits mediate electrosensory behavior in Caenorhabditis elegans.</a> J. Neurosci. 27, 7586-7596 (2007).</li><li>Pinan-Lucarre, B., Gabel, C. V., Reina, C. P., Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Slone, R. D., Xue, J., Qiao, Y., Weisberg, S., Roodhouse, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Core+Apoptotic+Executioner+Proteins+CED-3+and+CED-4+Promote+Initiation+of+Neuronal+Regeneration+in+Caenorhabditis+elegans.">The Core Apoptotic Executioner Proteins CED-3 and CED-4 Promote Initiation of Neuronal Regeneration in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Biol. 10, e1001331 (2012).</li><li>Chung, S. H., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mazur, E., Samuel, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+AFD+neuron+in+C.+elegans+thermotaxis+analyzed+using+femtosecond+laser+ablation.">The role of the AFD neuron in C. elegans thermotaxis analyzed using femtosecond laser ablation.</a> BMC Neurosci. 7, 30 (2006).</li><li>Nagai, T., Yamada, S., Tominaga, T., Ichikawa, M., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanded+dynamic+range+of+fluorescent+indicators+for+Ca(2+)+by+circularly+permuted+yellow+fluorescent+proteins.">Expanded dynamic range of fluorescent indicators for Ca(2+) by circularly permuted yellow fluorescent proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 10554-10559 (2004).</li><li>Kindt, K. S., Quast, K. B., Giles, A. C., De, S., Hendrey, D., Nicastro, I., Rankin, C. H., Schafer, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+mediates+context-dependent+modulation+of+sensory+plasticity+in+C.+elegans.">Dopamine mediates context-dependent modulation of sensory plasticity in C. elegans.</a> Neuron. 55, 662-676 (2007).</li><li>Chalasani, S. H., Chronis, N., Tsunozaki, M., Gray, J. M., Ramot, D., Goodman, M. B., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+a+circuit+for+olfactory+behaviour+in+Caenorhabditis+elegans.">Dissecting a circuit for olfactory behaviour in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 450, 63-70 (2007).</li><li>Clark, D. A., Gabel, C. V., Gabel, H., Samuel, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+activity+patterns+in+thermosensory+neurons+of+freely+moving+Caenorhabditis+elegans+encode+spatial+thermal+gradients.">Temporal activity patterns in thermosensory neurons of freely moving Caenorhabditis elegans encode spatial thermal gradients.</a> J. Neurosci. 27, 6083-6090 (2007).</li><li>Biron, D., Shibuya, M., Gabel, C., Wasserman, S. M., Clark, D. A., Brown, A., Sengupta, P., Samuel, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+diacylglycerol+kinase+modulates+long-term+thermotactic+behavioral+plasticity+in+C.+elegans.">A diacylglycerol kinase modulates long-term thermotactic behavioral plasticity in C. elegans.</a> Nat. Neurosci. 9, 1499-1505 (2006).</li><li>Ghosh-Roy, A., Wu, Z. L., Goncharov, A., Jin, Y. S., Chisholm, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+and+Cyclic+AMP+Promote+Axonal+Regeneration+in+Caenorhabditis+elegans+and+Require+DLK-1+Kinase.">Calcium and Cyclic AMP Promote Axonal Regeneration in Caenorhabditis elegans and Require DLK-1 Kinase.</a> Journal of Neuroscience. 30, 3175-3183 (2010).</li><li>Bianchi, L., Gerstbrein, B., Frokjaer-Jensen, C., Royal, D. C., Mukherjee, G., Royal, M. A., Xue, J., Schafer, W. R., Driscoll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neurotoxic+MEC-4(d)+DEG/ENaC+sodium+channel+conducts+calcium:+implications+for+necrosis+initiation.">The neurotoxic MEC-4(d) DEG/ENaC sodium channel conducts calcium: implications for necrosis initiation.</a> Nat. Neurosci. 7, 1337-1344 (2004).</li></ol>

Genetisch gecodeerd calcium indicatoren zijn op grote schaal gebruikt in C. elegans neurobiologie. Talrijke groepen gebruikt deze technieken reactie van primaire sensorische neuronen externe stimuli bestuderen zoals hier aangetoond met ASJ reactie op een elektrisch veld. Prominente voorbeelden zijn gevoel van mechanische druk, specifieke chemicaliën, temperatuur en een elektrisch veld 12, 16-19. Activiteit van interneuron en spiercellen zijn ook gecontroleerd als respons op stimuli en controle van d...

Hier presenteren we praktische methoden voor in vivo calcium beeldvorming in C. elegans neuronen. De ontwikkeling van genetisch gecodeerde calcium-gevoelige fluoroforen met een hoge signaal-ruisverhouding wordt C. elegans een relatief eenvoudig en kostenbesparend systeem voor het meten van de neurofysiologie en activiteit. Onze beeldvorming wordt gedaan met een standaard samengestelde microscoop met behulp van wide-field fluorescentie beeldvorming van de algemeen beschikbare fluoroforen. We presenteren verschillende technieken inzet van verschillende fluoroforen en verschillende monster voorbereiding, het bespreken van de sterke en zwakke punten van elk. Gegevens worden gepresenteerd op twee voorbeeldexperimenten. Een uitstekende extra bron op de hier beschreven technieken zijn te vinden in WormBook, &quot;Beeldvorming van de activiteit van neuronen en spieren&quot; door R. Kerr, ( <a href="http://www.wormbook.org" target="_blank">http://www.wormbook.org</a> ) 3. Twee belangrijke klassen van genetischautomatisch gecodeerd fluorescerende calcium reporters worden vaak gebruikt in C. elegans: een kanaal GCaMP en FRET-gebaseerde cameleon. Beschrijven we methoden en tonen voorbeelden voor gegevens die zijn gegenereerd door elk. GCaMP is gebaseerd op een gemodificeerd Green Fluorescent Protein (GFP) die gevoelig is voor de omringende calciumconcentratie. Dit wordt bereikt door fusie van GFP en de hoge affiniteit calcium eiwit calmoduline, zodat de binding van calcium door calmodulin de GFP molecuul brengt in een efficiënte fluorescerende bevestiging 2. De recente ontwikkelingen in deze fluoroforen genereren uitzonderlijke signaal formaat met tot 500% toename van de fluorescentie-intensiteit over een fysiologische bereik van calcium niveaus en redelijk snel kinetiek van ~ 95 msec stijgtijd en ~ 650 msec decay tijd 4. Over relatief korte perioden (minuten), kan deze grote signalen zorgen voor lagere resolutie imaging (lagere vergroting) en, gegeven een goed opgevoede initial nulmeting, ontkennen de noodzaak van permanente basislijn of vergelijkende metingen. Cameleon heeft het voordeel dat een FRET-gebaseerde fluorofoor die een ratiometrische meting vergelijken van twee onafhankelijke kanalen of golflengten 1 genereert. Het bestaat uit twee fluoroforen (cyaan-en gele-emitterende fluorescerende eiwitten, CFP en YFP) verbonden door een calmoduline eiwit. Het complex is verlicht met blauw licht (440 nm) dat het GVB prikkelt. Binding van calcium brengt de fluoroforen dichter bij elkaar, waardoor fluorescentie resonantie energie overdracht (FRET) van de CFP (donor) de YFP (acceptor) en waardoor de emissie CFP (480 nm) en neemt de emissie YFP (535 nm) om het . Relatieve calciumgehalte gemeten als de verhouding van de YFP / CFP intensiteit. Cameleon kinetiek langzamer dan GCaMP, gemeten in vivo een stijgtijd van ~ 1 sec en een vervaltijd van 3 sec 5 hebben. Echterde verhouding van tegengesteld bewegende signalen verhoogt de signaalgrootte en compenseert een aantal mogelijke artefacten als gevolg van veranderingen in fluorofoor concentratie beweging of aandacht drift en bleken. Genetisch gecodeerd fluorescerende verslaggevers ontkennen veel van de monstervoorbereiding vereist met exogeen toegediende sondes en C. elegans kleine transparant lichaam maakt beeldvorming binnen de intacte dier met behulp van eenvoudige brede veld fluorescentie. De belangrijkste technische uitdaging in monstervoorbereiding is dan ook om veilig te immobiliseren de dieren. Er zijn een aantal verschillende algemeen gebruikte technieken elk met voor-en nadelen. Met een farmacologisch middel om de dieren verlammen is eenvoudig te implementeren, de bevestiging van meerdere dieren een preparaat (Levamisol, een cholinerge agonist die spierweefsel veroorzaakt grijpen om wordt meestal gebruikt 6). C. elegans kan ook fysiek inactief worden gemaakt door ze aan te koppelenop stijve 10% agarose 7, 8. Dit minimaliseert impact op de dierlijke fysiologie, laat de lange termijn beeldvorming (uur) en het herstel van meerdere dieren, maar is meer technisch moeilijk. Beide technieken de fysieke toegang tot de dieren (die onder een dekglas) en kan daarom alleen worden gebruikt met bepaalde experimentele stimuli (zoals licht, temperatuur, elektrisch veld of laser schade). Voor stimuli waar fysieke toegang nodig is, zoals aanraking of toediening van chemicaliën, hebben vele studies met succes geplakt C. elegans op zijn plaats (met behulp van veterinaire graad lijm) 9. Dit is technisch meer uitdagende, is een enkel dier voorbereiding en staat niet toe dat dierlijke herstel. Ten slotte hebben talloze microfluïdische apparaten in dienst die fysiek C. beperken elegans, kan het behoud van dierfysiologie, waardoor de blootstelling aan de meeste soorten stimuli (afhankelijk van het apparaat ontwerp) en maken een snelle uitwisseling en herstel van de dieren <sup&gt; 10, 11. Maar microfluidics extra technische vaardigheden en mogelijkheden in ontwerp, fabricage en uitvoering. In geïmmobiliseerd dieren activiteit en stimulus respons kan over het algemeen worden gemeten in sensorische en interneuronen. De activiteit van de motorneuronen vereist meer geavanceerde technieken voor beeldvorming bij bewegende dieren. Hier presenteren we gedetailleerde methoden gebruik van de twee meest eenvoudige technieken van farmacologische paralyzation en immobilisatie met stijve agarose. De hier gepresenteerde methoden kunnen worden gebruikt om neuronale activiteit en celfysiologie in C. meten elegans. We geven een voorbeeld van elk: GCaMP met de sensorische respons van de ASJ neuron een extern elektrisch veld meten, en het gebruik Cameleon de fysiologische reactie op calcium laser schade van neuron meten. Deze voorbeelden tonen de voordelen en nadelen van de twee soorten fluoroforen en illustreren wat mogelijk is met het systeem.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Eclipse Ti-U inverted 
 microscope</td>
 <td>Nikon</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Intensilight HG Illuminator</td>
 <td>Nikon</td>
 <td>C-HGFI</td>
 <td>Fluorescent light source</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CFI Plan Apo VC 60X Oil</td>
 <td>Nikon</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optical table or 3'X3' optical 
 grade breadboard</td>
 <td>Thor Labs</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>If an optical table is not used an 
 optical grade breadboard on a 
 solid laboratory bench should 
 suffice.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Clara Interline Camera</td>
 <td>Andor 
 Technology</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>High-sensitivity CCD camera</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>wtGFP Longpass Emission</td>
 <td>Chroma Technology 
 Corp.</td>
 <td>41015</td>
 <td>GFP filter set for imaging GCaMP</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Filter 440 +/- 10 nm</td>
 <td>Chroma</td>
 <td>D440/20x EX</td>
 <td>excitation filter for cameleon</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dichroic mirror &gt; 455 nm 
 longpass</td>
 <td>Chroma</td>
 <td>455DCLP BS</td>
 <td>microscope dichroic for cameleon 
 imaging</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dichroic mirror &gt; 515 nm 
 longpass</td>
 <td>Chroma</td>
 <td>515DCLP BS</td>
 <td>dichroic mirror for cameleon 
 imaging</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Filter 535 +/- 15 nm</td>
 <td>Chroma</td>
 <td>D535/30m EM</td>
 <td>YFP emission filter</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Filter 480 +/- 20 nm</td>
 <td>Chroma</td>
 <td>D485/40m EM</td>
 <td>CFP emission filter</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Lens, 200 mm, Achromat</td>
 <td>Thor Labs</td>
 <td>AC508-200-A1</td>
 <td>Relay lens for FRET optics (3)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Silver broadband mirror</td>
 <td>Thor Labs</td>
 <td>ME2S-P01</td>
 <td>FRET optics (2)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NGM buffer</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Levamisole</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Polybead Microspheres</td>
 <td>Polysciences, Inc.</td>
 <td>08691-10, 2.5% by 
 volume, 50 nm 
 diameter</td>
 <td>polystyrene nanoparticles for C. 
 elegans immobilization</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Transgenic strain, Strain 
 gpa-9::GCaMP3(in pha-1; 
 him-5 bkg) </td>
 <td>Sternberg Lab</td>
 <td>Strain PS6388</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Transgenic strain, mec- 
 4::YC3.60</td>
 <td>Gabel Lab</td>
 <td>Strain CG1B</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

in vivo neuronal calcium imaging in c. elegans

De nematode worm C. elegans is een ideaal modelorganisme voor relatief eenvoudige, goedkope neuronale imaging in vivo. Zijn kleine transparante lichaam en eenvoudig, goed gekarakteriseerde zenuwstelsel maakt de identificatie en fluorescentie beeldvorming van een neuron in het intacte dier. Eenvoudige immobilisatie technieken met minimale impact op de fysiologie van het dier kunnen langere time-lapse imaging. De ontwikkeling van genetisch gecodeerde calcium gevoelige fluoroforen zoals cameleon 1 en 2 laten GCaMP in vivo beeldvorming van neuronale calcium worden zowel celfysiologie en neuronale activiteit. Talrijke transgene stammen die deze specifieke fluoroforen in neuronen gemakkelijk verkrijgbaar of kunnen worden geconstrueerd met gevestigde technieken. We beschrijven gedetailleerde procedures voor het meten van calcium dynamiek van een neuron in vivo in zowel GCaMP en cameleon. We bespreken voordelen en disadvantleeftijd waarop en verschillende werkwijzen van monstervoorbereiding (dier immobilisatie) en beeldanalyse. Tenslotte presenteren we de resultaten van twee experimenten: 1) Gebruik GCaMP de sensorische respons van een bepaald neuron aan een extern elektrisch veld en 2) Met Cameleon de fysiologische reactie van een calcium neuron traumatische beschadiging laser meten. Calcium beeldvormingstechnieken zoals deze worden veel gebruikt in C. elegans en zijn uitgebreid tot metingen in vrij bewegende dieren, meerdere neuronen tegelijk en vergelijking tussen genetische achtergronden. C. elegans presenteert een robuust en flexibel systeem voor in vivo neuronale beeldvorming met voordelen ten opzichte van andere modelsystemen in technische eenvoud en kosten.

Wij presenteren resultaten van twee afzonderlijke experimenten. De eerste werk GCaMP de reactie van een specifieke sensorische neuron naar een gedefinieerde externe stimulus te meten, wat een goed voorbeeld van hoe fluorescente calcium reporters kan worden gebruikt om optisch monitoren neuronale activiteit intact C. elegans. De tweede dienst cameleon het meten van de intracellulaire calcium voorbijgaande geactiveerd bij een neuron in antwoord op specifieke laser schade Dit illustreert hoe calcium fysiologie kan...

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans at JoVE.com

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

Met zijn kleine transparante lichaam, goed gedocumenteerde neuroanatomie en een groot aantal vatbaar genetische technieken en reagentia,<em&gt; C. elegans</em&gt; Is een ideale modelorganisme voor<em&gt; In vivo</em&gt; Neuronale beeldvorming met relatief eenvoudige, goedkope technieken. Hier beschrijven we enkel neuron imaging binnen intacte volwassen dieren met behulp van genetisch gecodeerd fluorescerende calcium indicatoren.

In vivo neuronale calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfectie van Mouse retinale ganglioncellen door In vivo Elektroporatie

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

In vivo Laser axotomy in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

Imaging neuronale responsen bij Slice Bereidingen van Vomeronasal Het uiten van een genetisch gecodeerd Calcium Sensor

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

Super-resolution Imaging van Neuronal Dense-core Blaasjes

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

In vivo beeldvorming van Dauer-specifieke neuronale Verbouwing in C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In vivo Functional Brain Imaging aanpak op basis van Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorine

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

Using an Adapted Microfluidic Olfactory Chip for the Imaging of Neuronal Activity in Response to Pheromones in Male C. Elegans Head Neurons

Using an Adapted Microfluidic Olfactory Chip for the Imaging of Neuronal Activity in Response to Pheromones in Male C. Elegans Head Neurons

Met behulp van een aangepast Microfluidic olfactorische Chip voor de beeldvorming van neuronale activiteit in reactie op de feromonen in mannelijke C. Elegans hoofd neuronen

The use of calcium indicators has greatly enhanced our understanding of neural dynamics and regulation. The nematode Caenorhabditis elegans, with its ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Twee-foton Calcium Imaging in neuronale Dendrites in hersenen plakjes

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

Ratiometric Calcium beeldvorming van individuele neuronen in gedragen Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Quantitative Approaches for Scoring in vivo Neuronal Aggregate and Organelle Extrusion in Large Exopher Vesicles in C. elegans

Quantitative Approaches for Scoring in vivo Neuronal Aggregate and Organelle Extrusion in Large Exopher Vesicles in C. elegans

Kwantitatieve benaderingen voor scoren in vivo Neuronal Aggregaat en Organelle Extrusie in Large Exopher Vesicles in C. elegans

Toxicity of misfolded proteins and mitochondrial dysfunction are pivotal factors that promote age-associated functional neuronal decline and ...