Name: a comparative approach to characterize the landscape of host-pathogen protein-protein interactions
Uploaded: 2013-07-18T12:00:00
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Diese Arbeit wurde zum Teil durch Mittel aus dem Institut Pasteur und durch Zuschüsse aus dem Ligue nationale contre le Cancer (Zuschüsse R05/75-129 und RS07/75-75), der Vereinigung pour la Recherche sur le Cancer (Zuschüsse ARC A09 / unterstützt 1/5031 und 4867) und die Agence Nationale de la Recherche (ANR07 MIME 009 02 und 026 01 ANR09 MIEN). MM war ein Empfänger einer MENRT Gemeinschaft.

1. Hefe-Zwei-Hybrid-Screenings <ol><li> Nehmen Sie die folgenden erforderlichen Lösungen: <ol><li> Komplette Synthetic Drop Out (SD): Man löst 26,7 g minimal SD Basis mit Glucose in 1 l Wasser. 2 g der Aminosäure-Mischung wie folgt hergestellt: 2 g Adenin hemisulfate, 2 g Arginin HCl, 2 g Histidin HCl, 2 g Isoleucin, 4 g Leucin, 2 g Lysin HCl, 2 g Methionin, Phenylalanin 3 g, 2 g L -Serin, 2 g L-Threonin, 3 g Tryptophan, Tyrosin 2 g, 1,2 g Uracil, 9 g Valin. </li><...

<ol>
	<li>Davey, N. E., Trave, G., Gibson, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+viruses+hijack+cell+regulation.">How viruses hijack cell regulation.</a> Trends in Biochemical Sciences. 36, 159-169 (2011).</li><li>Calderwood, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epstein-Barr+virus+and+virus+human+protein+interaction+maps.">Epstein-Barr virus and virus human protein interaction maps.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 7606-7611 (2007).</li><li>de Chassey, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+C+virus+infection+protein+network.">Hepatitis C virus infection protein network.</a> Mol. Syst. Biol. 4, 230 (2008).</li><li>Simonis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-pathogen+interactome+mapping+for+HTLV-1+and+-2+retroviruses.">Host-pathogen interactome mapping for HTLV-1 and -2 retroviruses.</a> Retrovirology. 9, 26 (2012).</li><li>Dyer, M. D., Murali, T. M., Sobral, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+landscape+of+human+proteins+interacting+with+viruses+and+other+pathogens.">The landscape of human proteins interacting with viruses and other pathogens.</a> PLoS Pathog. 4, e32 (2008).</li><li>Rual, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+proteome-scale+map+of+the+human+protein-protein+interaction+network.">Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network.</a> Nature. 437, 1173-1178 (2005).</li><li>Venkatesan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+empirical+framework+for+binary+interactome+mapping.">An empirical framework for binary interactome mapping.</a> Nat. Methods. 6, 83-90 (2009).</li><li>Cassonnet, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benchmarking+a+luciferase+complementation+assay+for+detecting+protein+complexes.">Benchmarking a luciferase complementation assay for detecting protein complexes.</a> Nat. Methods. 8, 990-992 (2011).</li><li>Ito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+two-hybrid+analysis+to+explore+the+yeast+protein+interactome.">A comprehensive two-hybrid analysis to explore the yeast protein interactome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 4569-4574 (2001).</li><li>Saldanha, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Java+Treeview--extensible+visualization+of+microarray+data.">Java Treeview--extensible visualization of microarray data.</a> Bioinformatics. 20, 3246-3248 (2004).</li><li>Smoot, M. E., Ono, K., Ruscheinski, J., Wang, P. L., Ideker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoscape+2.8:+new+features+for+data+integration+and+network+visualization.">Cytoscape 2.8: new features for data integration and network visualization.</a> Bioinformatics. 27, 431-432 (2011).</li><li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+and+integrative+analysis+of+large+gene+lists+using+DAVID+bioinformatics+resources.">Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources.</a> Nat. Protoc. 4, 44-57 (2009).</li><li>Muller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+genotype+comparison+of+human+papillomavirus+E2-host+interaction+networks+provides+new+insights+for+e2+molecular+functions.">Large scale genotype comparison of human papillomavirus E2-host interaction networks provides new insights for e2 molecular functions.</a> PLoS Pathog. 8, e1002761 (2012).</li><li>Neveu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+virus-host+interactomes+with+a+mammalian+high-throughput+protein+complementation+assay+based+on+Gaussia+princeps+luciferase.">Comparative analysis of virus-host interactomes with a mammalian high-throughput protein complementation assay based on Gaussia princeps luciferase.</a> Methods. , (2012).</li><li>Braun, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimentally+derived+confidence+score+for+binary+protein-protein+interactions.">An experimentally derived confidence score for binary protein-protein interactions.</a> Nat. Methods. 6, 91-97 (2009).</li></ol>

Unabhängig, Hefe-Zwei-Hybrid-und Säugetierzellen Interaktionsassays wie GST-Pulldown, LUMIER oder Mappit, haben sich als effektive Werkzeuge, um Protein-Protein-Wechselwirkungen zu erkennen sein, aber durch die hohe Rate der falsch-positiven und falsch-negativen beschränkt Wechselwirkungen mit diesen Techniken 15 verbunden. Darüber hinaus ist Beweis wächst, dass die Kombination von orthogonal Verfahren erhöht die Zuverlässigkeit der erhaltenen Wechselwirkung Datensatz 7. Die jüngste Entwick...

Die zunehmende Menge an Daten gesammelt, um Protein-Protein-Wechselwirkung Karten erzeugen öffnet Perspektiven weiter zu verstehen Erreger Infektionen. Als globales Verständnis von pathogenen Infektionen beginnt sich abzuzeichnen, bietet es Zugriff auf den Bereich von Störungen durch Erreger Proteine ​​induziert beim Anschließen des menschlichen Proteoms 1. Es bietet damit einen Weg zu verstehen, wie Krankheitserreger die Wirtszelle Maschinen manipulieren. Insbesondere ergab die Zuordnung von mehreren viralen-Wirt-Interaktion Netzwerke dass virale Proteine ​​bevorzugt Zielrechner Proteine, die stark in das Mobilfunknetz angeschlossen sind (Hubs), oder die von zentraler Bedeutung für viele Pfade in einem Netzwerk (Engpässe Proteine) 2-4 sind. Diese Wechselwirkungen können Viren auf wichtige zelluläre Prozesse zu manipulieren, was instrumental zu replizieren und infektiöse Nachkommen. Vergleichende Wechselwirkungen Mapping wurden kürzlich auf verwandten Viren mit dem Ziel, Informationen bezüglich extrahieren durchgeführtPathogenese 4. Darüber hinaus haben Studien der Wirt-Erreger-Interaktionen Landschaft zu viele Krankheitserreger 5 erweitert. Die gezielte Zellfaktoren Identifizierung bietet Einblicke in die Strategien, die von Pathogenen verwendet, um Zellen zu infizieren und ermöglicht den Nachweis von pathogenen Potential Marker. Die Hefe-Zwei-Hybrid-System ist die beliebteste Methode, um binäre Interaktionen zu identifizieren, da genetisches Screening ist eine effiziente und empfindliches Werkzeug für High-Throughput-Mapping von Protein-Protein-Interaktionen. Der hier vorgeschlagene Ansatz weiter verbessert einzelnen Y2H Screenings durch die Beurteilung ein Protein aus mehreren Krankheitserregern Stammvarianten, um so den Zugang zu einem vergleichenden Überblick über Pathogen-Wirt-Protein-Protein-Interaktionen. Darüber hinaus liegt eine große Einschränkung der Hefe-Zwei-Hybrid-Screening in einem hohen falsch-negative Rate, da sie etwa 20% der gesamten Wechselwirkungen 6 erholt. Dies bedeutet, dass Interaktionen mit nur einer Teilmenge von patho erkanntgens Varianten könnten Erkennung mit den anderen entgangen sein. Daher werden die einzelnen Partner, die aus allen Zwei-Hybrid-Screenings weiter für die Interaktion mit dem kompletten Sortiment der untersuchten Stämme herausgefordert, vergleichende Interaktion Datensätzen. Da wurde gezeigt, dass die Kombination verschiedener Methoden stark erhöht die Robustheit von Protein-Protein-Wechselwirkung Datensätze 7 wird diese Validierung in Säugetierzellen durch ein neu entwickeltes Protein-Fragment Komplementierung Assay genannt HT-GPCA 8 durchgeführt. Diese Zell-basierte System ermöglicht die Detektion von Protein-Interaktionen durch Komplementierung des Gaussia princeps aufgeteilt Luciferase und wurde entwickelt, um die Kompatibilität mit einem Hochdurchsatz-Format. Dank seiner Lumineszenz-basierten Technologie und deren geringem Hintergrundrauschen mit anderen Fluoreszenz-basierten Assay verglichen, zeigt HT-GPCA eine auffallend hohe Empfindlichkeit. Insgesamt stellt dieser Ansatz eine effizienteWerkzeug, um eine umfassende Kartierung von Wirt-Pathogen-Zwischenspiele, die den ersten Schritt in Richtung einer globalen Verständnis der Wirtszelle Entführung repräsentiert.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast strains</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimal SD base</td>
			<td>US biological</td>
			<td>D9500</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amino acids</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-amino-1,2,4-Triazole (3-AT)</td>
			<td>Acros organics</td>
			<td>264571000</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymolase</td>
			<td>Seikagaku</td>
			<td>120491</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>31966</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>BioWest</td>
			<td>S1810</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>14190</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>15140</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>25300</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Renilla luciferase assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2820</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White culture plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655083</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-wellPCR plates</td>
			<td>4titude</td>
			<td>4t-i0730/C</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (30 &deg;C)</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (37 &deg;C)</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer</td>
			<td>Berthold</td>
			<td>Centro XS-LB 960</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a comparative approach to characterize the landscape of host-pathogen protein-protein interactions

Erhebliche Anstrengungen wurden versammelt, um groß angelegte umfassende Protein-Protein-Interaktion Netzwerk Karten zu erzeugen. Dies ist maßgeblich auf die Erreger-Wirt-Beziehungen verstehen und wurde im Wesentlichen durch genetische Screenings in Hefe-Zwei-Hybrid-Systemen durchgeführt. Die jüngste Verbesserung der Protein-Protein-Wechselwirkung Erfassung durch einen Gaussia Luciferase-basierte Fragment Komplementierung Assay bietet nun die Möglichkeit, integrative Ansätze notwendig vergleichende interactomic entwickeln konsequent vergleichen Interaktion Profile von Proteinen aus verschiedenen Erreger Stammvarianten gegen einen gemeinsamen Satz von zellulären Faktoren. Dieses Dokument konzentriert sich insbesondere auf die Nützlichkeit der Kombination von zwei orthogonalen Methoden zur Protein-Protein-Wechselwirkung Datensätzen zu generieren: Hefe Zwei-Hybrid (Y2H) und eine neue Assays mit hohem Durchsatz Gaussia princeps Protein Komplementations-Assay (HT-GPCA) in Säugetierzellen durchgeführt. nt &quot;&gt; Eine groß angelegte Identifizierung zellulärer Partner eines Erregers Protein wird durch Kreuzen-basierten Hefe-Zwei-Hybrid-Screenings von cDNA-Bibliotheken mit mehreren Erreger Stammvarianten durchgeführt. Eine Teilmenge der interagierenden Partner auf einem High-Vertrauen statistischen Scoring ausgewählt ist weiter validiert in Säugerzellen für paarweisen Interaktionen mit dem ganze Reihe von Varianten Erreger Proteine ​​mit HT-GPCA. Diese Kombination aus zwei komplementären Methoden verbessert die Robustheit der Interaktion Datenmenge und ermöglicht die Durchführung einer strengen vergleichende Analyse Interaktion. Solche vergleichende Interactomics bilden eine zuverlässige und leistungsstarke Strategie zu entziffern irgendwelche Erreger-Wirt-Wechselspiel.

Eine große Stärke von HT-GPCA liegt in seiner hohen Empfindlichkeit, durch die Bewertung der falsch-positiven und falsch negativen Ergebnisse für die HPV E2-Protein in Abbildung 2 (nach Lit. 13) dargestellt. Um die falsch-negative Rate zu bestimmen, wurden von bekannten Wechselwirkungen von HPV16 E2 von HT-GPCA (2A) beurteilt. Vier von 18 Wechselwirkungen wurden nicht wiederhergestellt (entspricht einer 22% falsch-negative Rate). Die falsch positive Interaktionen wurden gemessen, um ...

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A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Dieser Artikel konzentriert sich auf die Identifizierung von High-Interaktion zuversichtlich Datensätze zwischen Wirt und Pathogen-Proteine ​​mit einer Kombination aus zwei orthogonal Methoden: Hefe-Zwei-Hybrid von einem High-Throughput-Assay Interaktion in Säugerzellen namens HT-GPCA gefolgt.

Komparativen Ansatz, um die Landschaft von Wirt-Pathogen-Protein-Protein-Wechselwirkungen charakterisieren

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

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We have developed in the amphibian Xenopus laevis a unique non-mammalian model to study the ability of certain heat shock proteins (hsps) such as gp96 to ...

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