Name: genetic manipulation of the mouse developing hypothalamus through in utero electroporation
Uploaded: 2013-07-24T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) gefördert.

1. Herstellung von DNA und Glasmikropipetten zur Injektion <ol><li> Gute Qualität Glasmikropipetten sind unerlässlich, um anfängliche hohe Rate der Fehlgeburten durch den Verlust von Fruchtwasser zu reduzieren. Das Verfahren zur Glasmikropipetten ziehen ist gut 13,18,25 dokumentiert. Mit 1,2 mm Durchmesser gezogen Kapillaren in einem herkömmlichen Sutter P-97-Gerät mit den Einstellungen P = 500; Wärme = 300; Ziehen = 40; Velocity = 50; Zeit = 50. Den Abzieher mit 3 mm &quot;Trog&quot; Filamente (Sutte...

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	<li>Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shocking'+developments+in+chick+embryology:+electroporation+and+in+ovo+gene+expression.">Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression.</a> Nat. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neocortex+patterning+by+the+secreted+signaling+molecule+FGF8.">Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8.</a> Science. 294, 1071-1074 (2001).</li><li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons+tend+to+stop+migration+and+differentiate+along+the+cortical+internal+plexiform+zones+in+the+Reelin+signal-deficient+mice.">Neurons tend to stop migration and differentiate along the cortical internal plexiform zones in the Reelin signal-deficient mice.</a> J. Neurosci. Res. 69, 723-730 (2002).</li><li>Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emx2+patterns+the+neocortex+by+regulating+FGF+positional+signaling.">Emx2 patterns the neocortex by regulating FGF positional signaling.</a> Nat. Neurosci. 6, 825-831 (2003).</li><li>Shimogori, T., Banuchi, V., Ng, H. Y., Strauss, J. B., Grove, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+signaling+centers+expressing+BMP,+WNT+and+FGF+proteins+interact+to+pattern+the+cerebral+cortex.">Embryonic signaling centers expressing BMP, WNT and FGF proteins interact to pattern the cerebral cortex.</a> Development. 131, 5639-5647 (2004).</li><li>Shimogori, T., Grove, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+8+regulates+neocortical+guidance+of+area-specific+thalamic+innervation.">Fibroblast growth factor 8 regulates neocortical guidance of area-specific thalamic innervation.</a> J. Neurosci. 25, 6550-6560 (2005).</li><li>Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+electroporation+in+the+embryonic+mouse+central+nervous+system.">In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system.</a> Nat. 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Neurosci. 29, 4484-4497 (2009).</li><li>Tanaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+the+hypocretin/orexin+gene+by+NR6A1.">Transcriptional regulation of the hypocretin/orexin gene by NR6A1.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 403, 178-183 (2010).</li><li>Tsuchiya, R., Takahashi, K., Liu, F. C., Takahashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+axonal+projections+from+mammillary+bodies+in+Pax6+mutant+mice:+possible+roles+of+Netrin-1+and+Slit+2+in+mammillary+projections.">Aberrant axonal projections from mammillary bodies in Pax6 mutant mice: possible roles of Netrin-1 and Slit 2 in mammillary projections.</a> J. Neurosci. Res. 87, 1620-1633 (2009).</li><li>Canteras, N. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+promoters+for+driving+efficient+transgene+expression+in+neonatal+porcine+islets.">Evaluation of promoters for driving efficient transgene expression in neonatal porcine islets.</a> Xenotransplantation. 14, 119-125 (2007).</li></ol>

Über der Narkose: Da in utero Elektroporation in den Hypothalamus kann technisch schwierig und erfordern längere Narkose Zeiten bevorzugen wir zu induzieren und Aufrechterhaltung einer Narkose durch Verabreichung einer Mischung aus Sauerstoff und Isofluran. In unserer Erfahrung können Tiere bleiben entsprechend betäubt auf diese Weise für einen Zeitraum von bis zu einer Stunde mindestens, ist die Erholung der Mutter sehr schnell, und Embryo Überleben verbessert. Andere Ansätze zur Anästhesie zur Verfüg...

Genetische Manipulation des embryonalen Gehirn der Maus ist eine bevorzugte Ansatz über Entwicklungsregulation lernen. Die Erzeugung von mutierten Maus Linien ist jedoch langsam und teuer. Eine leistungsfähige Methode, um spezifische genetische Veränderungen in sich entwickelnden Neuronen des Gehirns von Säugetieren einzuführen, ist in utero Elektroporation. Im Wesentlichen besteht die Technik der DNA-Transfektion in die embryonalen Gehirn neuroepithelium mittels elektrischer Impulse, dann ermöglicht der Embryo für eine bestimmte Zeit überleben, sammeln das Gehirn und prüft sie auf mögliche neue, informative Phänotypen. Auf diese Weise kann der Experimentator Hypothesen fast sofort zu testen, ohne die langen Wartezeiten, die für die Produktion von Maus-Mutanten. Transfektion von DNA in sich entwickelnden Embryonen begann mit in ovo Elektroporation auf Hühnerembryonen 1. Der wesentliche Proof-of-Concept für die Maus wurde in Kultur durchgeführt <sup&gt; 2. Dies wurde bald von den ersten Beschreibungen der Technik auf der Maus in utero 3,4 gefolgt. Das Hauptproblem ist, das Gehirn des Embryos in der Gebärmutter entwickeln ohne sie zu töten oder die Mutter transfektieren. Lernen, um die notwendige Operation durchführen (Laparotomie, Injektion, die Elektroporation) erfordert eine lange Einarbeitungszeit. Sobald die Operation bis zu dem Punkt, wo der Embryo Überlebensverhältnis akzeptabel ist gemeistert, ist der nächste entscheidende Frage: Welche Hirnstrukturen zugänglich sind? Nicht überraschend, die ersten veröffentlichten Arbeiten zeigt erhaltenen Ergebnisse mit in utero Elektroporation auf die kortikale Entwicklung 5-9 konzentriert. Dies ist immer noch für die meisten Veröffentlichungen mit dieser Technik gilt, da der Bereich der Entwicklung Gehirn der Maus am besten zugänglichen chirurgischen Eingriffen ist der Kortex (Abbildung 1). Das Verfahren für die in utero Elektroporation in der Hirnrinde wurde beschriebenprint 10 und in Video 11-14. Eine Modifikation der Technik kann verwendet werden, um einen ventralen Teil des telencephalon, die Basalganglien 15 abzuzielen. Jenseits der telencephalon ist das Zwischenhirn (klassisch in Thalamus und Hypothalamus geteilt) eine Region des Vorderhirns mehr schwer zu erreichen. Eine kleine Anzahl von Papieren Berichte Targeting seiner Rückenflosse und am leichtesten zugängliche Teil, der Thalamus 16-19. Der Hypothalamus ist die ventralen Teil des Vorderhirns, damit die einen lokalisierten am tiefsten von der dorsalen Fläche (cortex) (Abbildung 1). Diese Region bleibt eine schwierige Herausforderung für die Forscher verpflichtet genetisch zu manipulieren das Gehirn der Maus in der Gebärmutter. Nach unserem Wissen, berichten nur sehr wenige Artikel über die Ergebnisse der in utero Transfektion in der Maus Hypothalamus 20,21. Allerdings ist die funktionelle Bedeutung des Hypothalamus cannot überbewertet werden, da sie Verhaltensweisen wie Essen und Trinken, Paarung, Aufzucht und Erziehung 22 regelt. Darüber hinaus tragen Veränderungen in Hypothalamus Entwicklung im späteren Leben Erkrankungen wie Übergewicht, Bluthochdruck, Diabetes und vorzeitige Pubertät 23 stammen. Die Möglichkeit, genetisch verändern die Hypothalamus während der Entwicklung würde ein sehr mächtiges Werkzeug, um es zu verstehen. Die grundlegende chirurgische Protokoll für die Laparotomie von schwangeren Mäusen, die wir verwenden hier ist ähnlich wie in anderen Protokollen 11,13,14,24 verwendet. Wir werden sie hier kurz beschreiben auf Vollständigkeit. Der Schlüssel zu unserem Verfahren, auf der anderen Seite, sind die Art der Anästhesie, der Ort der Injektion, die Art der Elektroden und das Einsetzen und Position der positiven Elektrode in bezug auf die Embryos Kopf. Wir bevorzugen zu induzieren und Aufrechterhaltung einer Narkose durch Einatmen Gas über einfache intraperitoneale Anästhesie, seit der ehemalige ermöglicht dieetwas längere Narkose für eine schwierige Operation erforderlich. Isofluran Einatmen führt zu einer schnelleren Erholung von der Narkose, da in der Regel die Mutter zeigt ein normales Verhalten bereits Minuten nach der Operation. Die einfachste Punkt der Injektion der DNA-Lösung mit dem Glas-Mikropipette ist die laterale Ventrikel, was jedoch völlig ungeeignet Hypothalamus Elektroporation. Injektion direkt in den dritten Ventrikel ist in der Tat wichtig, tief Zwischenhirn Strukturen zielen. Es ist möglich, den Hypothalamus von E12.0 oder E12.5 mit Standard-, off-the-shelf Elektroden transfektieren. Wir haben einige der Elektroden durch Nepa Gene (Chiba, Japan) besonders zu diesem Zweck geeignet hergestellt gefunden. Mit unserem Verfahren erhalten wir Transfektion des gesamten Hypothalamus Neuroepithel oder teilweise, je nach regionalen Transfektion Elektrode Orientierung. Hier zeigen wir die Technik, durch Transfektion der mammillary Körper, wohldie tiefste und Einbau aller Hypothalamus Kerne. Darüber hinaus zeigen wir detaillierte histologische Analyse der transfizierten Zellen auf der zellulären Ebene der Auflösung. Ein Vergleich der in utero Elektroporation mit anderen Ansätzen zur Transfektion der Maus entwickelnde Gehirn in utero kann in der Diskussion Abschnitt gefunden werden.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acepromazine</td>
			<td>Sanofi GmbH</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>HDG9623</td>
			<td>anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamin</td>
			<td>Pharma GmbH</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>44715</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rimadyl</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>non-steroidal anti-inflammatory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Braunoderm</td>
			<td>Braun</td>
			<td>3887138</td>
			<td>povidone-iodine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temgesic (buprenorphine)</td>
			<td>Essex Pharma</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>opioid analgesic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye Ointment</td>
			<td>Pan-Ophtal</td>
			<td>7136926</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaesthetic Device Komesaroff Mark-5</td>
			<td>Medical Developments Australia</td>
			<td>ACN 004 903 682</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary puller P-97</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>P-97</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compresstome</td>
			<td>Precisionary Instr.</td>
			<td>VF-300</td>
			<td>Vibratome-type device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM700</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM3050S</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>Nepa Gene Co. Ltd.</td>
			<td>CUY21EDIT</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode 1</td>
			<td>Nepa Gene Co. Ltd.</td>
			<td>CUY550-10</td>
			<td>Stainless Steel Needle Electrode, 10 mm-Tip, 0. 5 mm diam.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode 2</td>
			<td>Nepa Gene Co. Ltd.</td>
			<td>CUY700P4L</td>
			<td>Cover Round Platinum Plate 4 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiberoptic cold light source</td>
			<td>Leica</td>
			<td>KL2500 LCD</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>GC120T-15</td>
			<td>1. 2 mm O.D. x 0. 94 mm I.D.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bead sterilizer</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>FST250</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>py872-5272</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection device</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>Pneumatic Pico Pump PV820</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture Thread Coated Vicryl</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>V4914</td>
			<td>Peritoneal Suture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture Thr. Supramid</td>
			<td>Serag Wiessner</td>
			<td>TO07171L</td>
			<td>Skin Suture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic manipulation of the mouse developing hypothalamus through in utero electroporation

Genetische Modifikation von bestimmten Regionen des sich entwickelnden Gehirn von Säugetieren ist ein sehr mächtiges experimentellen Ansatz. Die Erzeugung neuartiger Mausmutanten ist oft frustrierend langsam. Es wurde gezeigt, dass der Zugang zum Gehirn der Maus zu entwickeln in der Gebärmutter mit hinreichender Post-OP-Überleben möglich ist. Dennoch Ergebnisse mit diesem Verfahren wurden fast ausschließlich für die meisten oberflächlich und leicht zugänglichen Teil des sich entwickelnden Gehirns gemeldet, dh die Rinde. Der Thalamus, ein schmaler und medialen Bereich, hat sich mehr schwer vorbei. Transfektion in tiefere Kerne, insbesondere diejenigen des Hypothalamus, ist vielleicht die größte Herausforderung und daher nur sehr wenige Ergebnisse gemeldet wurden. Hier zeigen wir ein Verfahren, um die gesamte Hypothalamus neuroepithelium oder ein Teil davon (Hypothalamus Regionen) für die Transfektion durch Elektroporation Ziel. Der Schlüssel zu unserem Ansatz sind länger Narkose mal, Injektion in den third Ventrikel und geeignete Art und die Positionierung der Elektroden. Darüber hinaus zeigen wir Ergebnisse von Targeting und anschließende histologische Analyse der meisten vertieften Hypothalamus Kern, die mammillary Körper.

Die meisten Hypothalamus Neuronen zwischen E11.5 bis E15.2 geboren, nach der Geburt-dating-Analyse bei der Ratte 26 in die etwas kürzer Mausentwicklung 27,28 übersetzt. Der Gipfel des Hypothalamus Neurogenese bei E12.5 29-31 erreicht. Demgemäß wird zum Transfektion Alter für die vorliegende Studie (E12.5) gewählt wird, kann ein großer Teil der hypothalamischen Neuronen zu einem bestimmten rostro-kaudalen Niveau bezeichnet werden. Analyse bei E18.5 auf ...

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Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Trotz der funktionalen und medizinische Bedeutung des Hypothalamus,<em&gt; In utero</em&gt; Genetische Manipulation seiner Entwicklung hat selten versucht worden. Wir zeigen ein detailliertes Verfahren für<em&gt; In utero</em&gt; Elektroporation in die Maus Hypothalamus und zeigen repräsentative Ergebnisse der vollständigen und teilweisen (regionalen) Hypothalamus Transfektion.

Genetische Manipulation der Maus entwickeln Hypothalamus durch<em&gt; In utero</em&gt; Elektroporation

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Die Transfektion von Maus retinalen Ganglienzellen durch In vivo Elektroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Forschung

Neurowissenschaften

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

In-vivo-Elektroporation von Entwicklung Maus Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

Effiziente Gene Lieferung in mehrere ZNS Territories mit In Utero Elektroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

Maus in Utero Elektroporation: Kontrollierte Spatiotemporal Gene Transefection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

Gentransfer an sich entwickelnden Maus Innenohr<em&gt; In Vivo</em&gt; Die Elektroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualisierung und genetische Manipulation von Dendriten und Dornen in der Maus Hirnrinde und im Hippocampus mit<em&gt; In utero</em&gt; Die Elektroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetische Manipulation von Kleinhirnkörnerzellen<em&gt; In-vitro-</em&gt; Und<em&gt; In Vivo</em&gt;, Um neuronale Morphologie und Migration Studieren

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

Cortex, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus, Lateral Septal Nucleus- und Striatum spezifische<em&gt; In Utero</em&gt; Electroporation in der C57BL / 6-Maus,

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

In Utero Ansätze Elektroporation die Erregbarkeit neuronaler Subpopulationen und Einzelzell - Konnektivität zu studieren

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

Zeitraffer-konfokale Bildgebung der Migration von Neuronen in der organotypischen Scheibe Kultur der embryonalen Maus Gehirn mit<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...