Name: micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides
Uploaded: 2013-05-23T17:00:00
Duration: 5 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 655) en de Europese Unie (Zf-Health).

1. Voorbereiding van de injectie Mixture <ol><li> Gebruik vivo morpholinos als cellen internaliseren hen efficiënter dan normale morpholino moleculen. Zie informatie van de fabrikant voor meer informatie (Tabel 1: Reagentia en materialen). </li><li> Gebruik een fluorescerende kleurstof volgen (bijv. CellTracker Red CMTPX, Invitrogen) om de nauwkeurigheid van de injectie te visualiseren. Deze kleurstof wordt gemetaboliseerd in de cel en wordt fluorescentie alleen in de cel na opname. Daarom is deze stap is essentieel voor de cellen die efficiënt worden gericht door de cerebroventricular microinjectie bepalen. </li><li> Bereid fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2PO 4, pH: 7.4) voor het verdunnen morfolino oplossing. Indien een verdunning van de morfolino oplossing nodig is, altijd gebruik maken van PBS. </li><li> Bereid 10 pi van het mengsel door toevoeging van injectie 9 ul van de oplossing morfolino en 1 pl van ee cel tracker kleurstof (verdund of onverdund De voorraad concentratie van de morfolino oplossing is 500 uM Onze eerdere resultaten 22 geven aan dat verschillende doseringen van het morfolino -.. variërend van 50 uM tot 500 uM - resulteren in verschillende niveaus van de knock-down van een efficiënte knockdown te hypomorphic fenotypes). 1 pi van de oplossing voldoende is voor injectie in een zebravis hersenen. </li><li> Meng goed en bewaar bij kamertemperatuur tot de injectie. </li></ol> 2. Bereiding van de injectie Apparatus <ol><li> Bereid de glazen capillairen injectie met een naald trekker. Gebruik de volgende parameters: Verwarming cycle waarde: 463, trekken cycle waarde: 230, snelheid: 1.5 sec, tijd: 75 msec. </li><li> Zet de druk van de bron en de druk aan te passen tot 50 psi of 3,5 bar. </li><li> Pas de microinjector instellingen als volgt: houd de druk 20 psi, eject druk 10 psi, periode waarde van 2,5 en 100 msec reeks gating. </li><li> Draaienop de ring illuminator en zoek de ring over de microscoop podium. </li><li> Plaats de capillaire houder op een geschikte positie naast de microscoop. </li><li> Plaats de glazen capillair in de houder. Pas de injectie hoek 45 graden. </li><li> Breek het uiteinde van de glazen capillair met een fijn-end pincet en IJk de uitvoer van de opening. Dit moet worden getest door onderdompeling van de punt van de naald in de vis water en met continu drukpuls. De luchtbellen ontstaat wanneer slechts een rij, die een indicatie van de optimale druk / spuitopening zijn. Zie de video voor de demonstratie van deze kalibratie. </li><li> Plaats het glazen capillair met de injectie-oplossing zonder luchtbellen. </li><li> Geef gelijkmatig lucht tussen het uiteinde van de glazen capillair en de beladen injectie oplossing te verwijderen. </li></ol> 3. Anesthesie <ol><li> Bereid de stockoplossing van de anesthesie (0,1% MESAB - ethyl-m-aminobenzoaat methaansulfonaat). </li><li> Verwijder gewenste aantal vissen uit hun tanks in plastic muis kooien of andere containertransport met voldoende hoeveelheid water. </li><li> Bereid de verdoving oplossing in een klein plastic doosje door het mengen van 200 ml vis water met 5 ml van anesthetica voorraad oplossing. De eindconcentratie van de anesthesie: 0,0025% (v / v). </li><li> Half-vullen van een plastic petrischaal met anesthetica. Gebruik dit gerecht voor injecties. </li><li> Incubeer de vis in de anesthesie tot de vis onderwerpt. </li></ol> 4. Incisie en Cerebroventricular Microinjection <ol><li> Haal de vis uit de doos met behulp van een visnet en plaats deze in de petrischaal. </li><li> Houd het vissen met de tang en oriënteren de kop op een manier dat het kantelt iets naar beneden. Hierdoor wordt de incisie te vergemakkelijken. </li><li> Genereer een kleine split aan de schedel met een 30 gauge prikkeldraad-end naald. Gebruik alleen de punt van de naald en niet meer dan dringengenoeg in de hersenen omdat dit schade aan het hersenweefsel veroorzaken en zal manifesteren als bloeden. </li><li> Houd de vis en plaats het uiteinde van de glazen capillair via de incisie. </li><li> Richt het uiteinde van de glazen capillair naar de grote hersenen. Raak het hersenweefsel als dit leidt tot weefselbeschadiging en voorkomt tevens het dispergeren van de geïnjecteerde oplossing. </li><li> Injecteer de oplossing. De vloeistof verspreidt onmiddellijk na injectie. </li></ol> 5. Herstel en analyseren van de Injectie Nauwkeurigheid <ol><li> Haal de vis uit de injectie setup en plaats in een plastic doos met verse vis water. </li><li> Terug te kunnen halen. </li><li> Opnieuw verdoven de vis met 0,0025% MESAB kort en controleer de vis onder de fluorescentiemicroscoop. Een grondige dispersie van rode fluorescentie is een indicatie van wijdverspreide verdeling van de geïnjecteerde vloeistof. </li><li> Leg de vis terug naar de plastic doos. </li><li> Sluit de plastic doos om tHij circulatie systeem om zuurstof de vissen en te onderhouden voor langere tijd. </li><li> Gebruik de vissen gewenste doeleinden zoals gedragsanalyses offeren of de dieren op gewenste tijdstippen na de injectie om weefselmonsters te bereiden voor verdere analyse (histologische kleuringen, immunohistochemie, enz.). De volgende referenties geven voorbeelden van hoe de volwassen zebravis hersenen te analyseren: 9,11,17-20,24-27. De snelste tijd een efficiënte knockdown acht (meer dan 50% knockdown) werd 12 uur in onze studies 22. </li></ol> 6. Stelde Wetenschappelijke Controls <ol><li> Gebruik een mismatch morfolino molecuul dat niet hoort elk fenotype als een negatieve controle veroorzaken. Gebruik een standaard morpholino molecuul of specifiek ontwerp morfolinogroep controles voor elk gen van belang. Daarnaast maken het oplosmiddel (hier PBS) als extra negatieve controle de niet-specifieke effecten of toxiciteit van de misme beoordelenatch / controle morfolino injecties. </li><li> Gebruik PCNA morpholinos eerder beschreven 22 als positieve controles. Dit morfolinogroep veroorzaakt efficiënte knock-down in de volwassen hersenen zebravis (75-95% knockdown efficiëntie binnen 1 dag van injectie) 22. </li></ol>

<ol>
	<li>Stocum, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Regenerative Biology and Medicine. , (2006).</li><li>Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+understanding+tissue+regenerative+capacity+and+mechanisms+in+animals.">Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals.</a> Nat. Rev. Genet. 11 (10), 710-722 (2010).</li><li>Doetsch, F., Scharff, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+for+brain+repair:+insights+from+adult+neurogenesis+in+birds+and+mammals.">Challenges for brain repair: insights from adult neurogenesis in birds and mammals.</a> Brain Behav. Evol. 58 (5), 306-322 (2001).</li><li>Kaslin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation,+neurogenesis+and+regeneration+in+the+non-mammalian+vertebrate+brain.">Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 363 (1489), 101-122 (2008).</li><li>Kizil, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neurogenesis+and+brain+regeneration+in+zebrafish.">Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish.</a> Dev. Neurobiol. 72 (3), 429-461 (2012).</li><li>Grandel, H., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+aspects+of+adult+neural+stem+cell+activity+in+vertebrates.">Comparative aspects of adult neural stem cell activity in vertebrates.</a> Dev. Genes Evol. , (2013).</li><li>Kempermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Adult Neurogenesis 2: Stem Cells and Neuronal Development in the Adult Brain. , (2010).</li><li>Ihrie, R. A., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+in+the+astroglial+lineage+are+neural+stem+cells.">Cells in the astroglial lineage are neural stem cells.</a> Cell Tissue Res. 331 (1), 179-191 (2008).</li><li>Grandel, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+and+neurogenesis+in+the+adult+zebrafish+brain:+origin,+proliferation+dynamics,+migration+and+cell.">Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell.</a> 295 (1), 263-277 (2006).</li><li>Chapouton, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neurogenesis+in+non-mammalian+vertebrates.">Adult neurogenesis in non-mammalian vertebrates.</a> Bioessays. 29 (8), 745-757 (2007).</li><li>Adolf, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+and+acquired+features+of+adult+neurogenesis+in+the+zebrafish+telencephalon.">Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon.</a> Dev Biol. 295 (1), 278-293 (2006).</li><li>Byrd, C. A., Brunjes, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+the+olfactory+bulb+of+adult+zebrafish.">Neurogenesis in the olfactory bulb of adult zebrafish.</a> Neuroscience. 105 (4), 793-801 (2001).</li><li>Pellegrini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+aromatase-positive+radial+glial+cells+as+progenitor+cells+in+the+ventricular+layer+of+the+forebrain+in+zebrafish.">Identification of aromatase-positive radial glial cells as progenitor cells in the ventricular layer of the forebrain in zebrafish.</a> J. Comp. Neurol. 501 (1), 150-167 (2007).</li><li>Lam, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gfap+and+nestin+reporter+lines+reveal+characteristics+of+neural+progenitors+in+the+adult+zebrafish.">gfap and nestin reporter lines reveal characteristics of neural progenitors in the adult zebrafish.</a> 238 (2), 475-486 (2009).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Wnt-responsive+cells+in+the+zebrafish+hypothalamus.">Identification of Wnt-responsive cells in the zebrafish hypothalamus.</a> Zebrafish. 6 (1), 49-58 (2009).</li><li>Kaslin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+in+the+adult+zebrafish+cerebellum:+initiation+and+maintenance+of+a+novel+stem+cell+niche.">Stem cells in the adult zebrafish cerebellum: initiation and maintenance of a novel stem cell niche.</a> J. Neurosci. 29 (19), 6142-6153 (2009).</li><li>Ganz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+and+Fgf+dependence+of+adult+neural+progenitors+in+the+zebrafish+telencephalon.">Heterogeneity and Fgf dependence of adult neural progenitors in the zebrafish telencephalon.</a> Glia. 58 (11), 1345-1363 (2010).</li><li>M&#228;rz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+progenitor+cell+subtypes+in+the+ventricular+zone+of+the+zebrafish+adult+telencephalon.">Heterogeneity in progenitor cell subtypes in the ventricular zone of the zebrafish adult telencephalon.</a> Glia. 58 (7), 870-888 (2010).</li><li>Rothenaigner, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+analysis+by+distinct+viral+vectors+identifies+bona+fide+neural+stem+cells+in+the+adult+zebrafish+telencephalon+and+characterizes+their+division+properties+and+fate.">Clonal analysis by distinct viral vectors identifies bona fide neural stem cells in the adult zebrafish telencephalon and characterizes their division properties and fate.</a> Development. 138 (8), 1459-1469 (2011).</li><li>Kroehne, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+the+adult+zebrafish+brain+from+neurogenic+radial+glia-type+progenitors.">Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors.</a> Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).</li><li>Ito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+neural+stem+cells+and+their+progeny+in+the+adult+zebrafish+optic+tectum.">Characterization of neural stem cells and their progeny in the adult zebrafish optic tectum.</a> Dev. Biol. 342 (1), 26-38 (2010).</li><li>Kizil, C., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebroventricular+microinjection+(CVMI)+into+adult+zebrafish+brain+is+an+efficient+misexpression+method+for+forebrain+ventricular+cells.">Cerebroventricular microinjection (CVMI) into adult zebrafish brain is an efficient misexpression method for forebrain ventricular cells.</a> PLoS One. 6 (11), e27395 (2011).</li><li>Morcos, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vivo-Morpholinos:+a+non-peptide+transporter+delivers+Morpholinos+into+a+wide+array+of+mouse+tissues.">Vivo-Morpholinos: a non-peptide transporter delivers Morpholinos into a wide array of mouse tissues.</a> Biotechniques. 45 (6), 613-614 (2008).</li><li>Kizil, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemokine+receptor+cxcr5+regulates+the+regenerative+neurogenesis+response+in+the+adult+zebrafish+brain.">The chemokine receptor cxcr5 regulates the regenerative neurogenesis response in the adult zebrafish brain.</a> Neural Dev. 7, 27 (2012).</li><li>Chapouton, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=her5+expression+reveals+a+pool+of+neural+stem+cells+in+the+adult+zebrafish+midbrain.">her5 expression reveals a pool of neural stem cells in the adult zebrafish midbrain.</a> Development. 133 (21), 4293-4303 (2006).</li><li>Kizil, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+neurogenesis+from+neural+progenitor+cells+requires+injury-induced+expression+of+Gata3.">Regenerative neurogenesis from neural progenitor cells requires injury-induced expression of Gata3.</a> Developmental Cell. 23 (6), 1230-1237 (2012).</li><li>Kyritsis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+inflammation+initiates+the+regenerative+response+in+the+adult+zebrafish+brain.">Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain.</a> Science. 338 (6112), 1353-1356 (2012).</li><li>Rosen, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).</li><li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos.">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).</li><li>Rikin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reverse+genetic+approach+to+test+functional+redundancy+during+embryogenesis.">A reverse genetic approach to test functional redundancy during embryogenesis.</a> J. Vis. Exp. (42), e2020 (2010).</li></ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De methode die we hier beschrijven maakt een eenvoudige en snelle toediening van morpholinos in de volwassen hersenen zebravis. We hebben aangetoond dat onze injectiemethode efficiënt blokkeert genexpressie in de ventriculaire cellen en resulteert in functionele gevolgen in de neurogenese reactie. Er zijn belangrijke punten om voorzichtig te zijn over bij het uitvoeren van de cerebroventricular micro-injectie. Bijvoorbeeld, het effect van de morfolino moleculen afhankelijk van de gebruikte concentratie. Deze concentratie moet worden bepaald door de eindgebruiker. Wij adviseren om te beginnen met de stockoplossing (500 uM) en het uitvoeren van seriële verdunningen, en ideaal voor een pre-test door injectie in embryo&#39;s met behulp van standaard embryo injectie protocollen 28-30. Eerder verkregen we verschillende knockdown efficiëntie concentraties morpholinos van 50 uM tot 500 uM 22. Ten tweede moet de opening van de glazen capillaire niet groe wat zal leiden tot uitgebreide vloeistof instroom in de hersenen na de injectie. Zo moet de opening niet te smal als dit voorkomt een adequate injectie. Men kan de optimale opening-druk combinatie te bepalen door het pompen van lucht in een petrischaal met water. De belletjes ontstaan ​​moet worden in een enkele rij, maar niet in meerdere rijen. We demonstreren deze in de video. Ten derde, het incuberen van de vis in de anesthesie is kritisch. De vis mag niet langer worden bewaard dan 2 min in de anesthesie. Dit zal de recovery rate na de injectie belemmeren. Ten vierde, de plaats van de incisie is cruciaal voor het grondig dispergeren van de geïnjecteerde vloeistof. De ventriculaire regio over de optische tectum groter is boven de middellijn en smaller lateraal. Daarom moet er worden de gleuf in de schedel dichtbij de middellijn genereren en net caudaal van de schedel afdekplaat van de telencephalic regio. Een van de voordelen van de cerebroventricular injection-methode (CVMI) is zijn rapidness. CVMI is een snelle methode voor het analyseren van gen-functie. Deze functie is belangrijk en nuttig is in vergelijking tot generatie van transgene lijnen voor functionele studies, die in het algemeen verscheidene maanden. Daarnaast CVMI leidt tot gelijkmatige verdeling van de geïnjecteerde vloeistof en verschaft derhalve een relatief grondige manipulatie van gen-activiteit in vergelijking met focale injectie of elektroporatie. Met CVMI, kunnen meerdere genen tegelijk worden neergehaald door het voorbereiden injectie vermengt met meerdere morpholinos oligonucleotide. CVMI kunnen worden gebruikt om verschillende concentraties van een bepaald morfolino oligonucleotiden injecteren, en kan daarom worden gebruikt voor het analyseren hypomorfe fenotypen. Tot slot is deze injectie paradigma niet giftigheid veroorzaken of gevaar voor het voortbestaan ​​van de dieren. De CVMI techniek zou kunnen worden uitgebreid naar andere type studies zoals injectie van modulerende peptiden, drugs, plasmide-DNA of RNA modulerende molecules of andere stoffen die de fysiologie van de cellen kunnen beïnvloeden. Het testen van een combinatie van moleculen en dosis-respons analyses uitvoeren zijn mogelijk met behulp van onze methode, waardoor het bestuderen hypomorphic fenotypes. Met deze eigenschappen CVMI blijkt een snelle en gemakkelijke test voor expressie studies in de volwassen zebravis hersenen en opent snelle screening en functionele analyses. De volwassen zebravis hersenen kunnen constitutief produceren nieuwe cellen langs de gehele as rostrocaudal en kan regenereren na traumatisch letsel. Dit staat in schril contrast met zoogdieren hersenen met beperkte neurogenese en als dat al, nogal slecht regeneratievermogen. Zulke wijdverspreide stamcel activiteit en recuperatie vermogen maakt zebravis een nuttig modelorganisme voor het begrijpen van de moleculaire programma&#39;s die nodig zijn voor het centrale zenuwstelsel regeneratie, die momenteel grotendeels onbekend. Daarom is onderzoek naar de moleculaire basis van de regeneratieve geschiktheid van ZEbrafish brein is een interessant gebied van onderzoek dat het fundamentele verschil hoe vissen en zoogdieren hersenen reageren na een blessure, en ook begiftigen mogelijkheden voor regeneratieve medische therapieën bij de mens zou kunnen verklaren. Om de moleculaire infrastructuur van gewervelde hersenen plasticiteit en regeneratie begrijpen, gliacellen dienen als een belangrijk onderzoeksterrein omdat ze de neurogene voorlopers 3,8,20. Dus, door CVMI techniek om gen-functie te veranderen in de radiale gliacellen van de hersenen zebravis is instrumenteel in het ontrafelen hoe vis hersenen kunt koppelen voorlopercellen activiteit om efficiënt volwassen neurogenese en regeneratieve respons. Wij toonden de betrokkenheid en eisen van verschillende factoren en signaalwegen in de regeneratieve neurogenese reactie van de volwassen hersenen zebravis 24,26,27 en deze studies werden mogelijk gemaakt door het gebruik van CVMI methode. In totaal kan de kennis die we halen uit de hersenen zebravis worden aangewend om regene leggenratieve vermogen om de zoogdier gliacellen die reageren op blessures en zal dus helpen het ontwerpen van klinische therapieën voor menselijke neurologische aandoeningen en acute blessures.

Volwassen neurogenese is een gemeenschappelijk kenmerk van gewervelde dieren, maar de mate van prevalentie en efficiëntie varieert met de fylogenie 1,2,3,4,5,6. Bijvoorbeeld, volwassen zoogdieren hersenen bevatten stamcellen regio&#39;s grotendeels beperkt tot de voorhersenen 7,8, terwijl de teleost zebravis bevat zestien verschillende stamcel domeinen en bijbehorende neurogene zones in zijn hele brein 4,5,9,10. Deze variatie tussen zoogdieren en zebravis kan een ongelijkheid in de mechanismen van stamcel onderhoud en neurogene capaciteit van de progenitorcellen weerspiegelen. De levenslange bevoegdheid van zebravis over neuronen in het brein van kan vormen ook klinische vertakkingen de moleculaire mechanismen die door de hersenen zebravis haalbaar zijn voor therapeutische toepassingen van de neurodegeneratieve stoornissen bij mensen pakken. Verschillende stamcellen zones van de volwassen zebravis hersenen werden geanalyseerd en het is aangetoond dat deepitheelcellen van de ventriculaire oppervlak van deze gebieden dienen als voorlopercellen 9,11-20. Gedetailleerde analyses in de zebravis telencephalon, bijvoorbeeld, die de radiale gliale cellen, die het ventriculaire oppervlak van deze hersengebied bakenen om neurogene progenitors 19, 20. Dit geldt voor andere regio&#39;s, zoals het cerebellum en de optische tectum, waar ventricularly-gevestigd neuro-cellen zorgen voor de neurogene ingang 16,21. Te dien einde, het begrijpen van de moleculaire mechanismen die de wijdverbreide neurogene competentie in volwassen hersenen zebravis vereist manipulatie van genexpressie in de voorlopercellen. Verschillende methoden werden eerder beschreven voor het moduleren van gen-functie in de zebravis. Deze omvatten genereren van conditionele transgene lijnen tot expressie gewenst varianten van een eiwit, plasmiden gebaseerde focal injecties gekoppeld met elektroporatie of chemische behandelingen. We hebben eerder ontwierpen eenWerkwijze voor het toedienen van verschillende stoffen waaronder morfolino-oligonucleotiden of eiwitten in de volwassen hersenen zebravis met cerebroventricular microinjectie een snelle en efficiënte manier van moduleren van genfunctie in de ventriculaire cellen van de volwassen zebravis voorhersenen 22. In onze studies, werden vivo morpholinos gebruikt vanwege hun chemie waarbij de morfolino-molecuul covalent aan rijke levering peptiden die efficiënte levering mogelijk om de cellen van belang, zonder behoefte aan extra permeabilisatie zoals elektroporatie 23 arginine. Dit zou een grondige doelgerichtheid van het gewenste weefsel na de injectie, net als wat we waargenomen in volwassen zebravissen telencefalon 22. Gebruik vivo morpholinos daarom superieur aan bestaande methoden weefseltargeting zoals elektroporatie of focale injectie van DNA moleculen. Hier laten we zien visueel hoe we deze operatie uit te voeren en zorgen voor eenstap voor stap protocol. We beginnen met het uitleggen voorbereiding van de injectie mengsel en de vis te worden geïnjecteerd, en verder door aan te tonen hoe de injectie-apparatuur wordt opgesteld. Wij bieden een beschrijving van de cerebroventricular injectie methode, wat inhoudt dat het genereren van een incisie in de schedel en de injectie van de morpholinos behulp microinjector. We ook ingaan op de kritische punten dient men voorzichtig op te zijn tijdens de hele procedure door te stellen hen als optimalisatie of richtlijnen om problemen.

<table border="1">
	<tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent/Material</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CellTracker Red CMTPX</td>
 <td>Life Technologies, Invitrogen</td>
 <td>C34552</td>
 <td>Use at 1:100 dilution for measuring the injection accuracy</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MESAB (ethyl-m-aminobenzoate methanesulphonate)</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A5040</td>
 <td>For anesthetizing the fish</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Petri dishes</td>
 <td>Sarstedt</td>
 <td>821,472</td>
 <td>For handling the fish during injection and imaging</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phosphate-buffered saline</td>
 <td>Life Technologies, GIBCO</td>
 <td>10010-056</td>
 <td>As sterile dilution medium</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vivo morpholinos</td>
 <td>Gene Tools Inc.</td>
 <td>Customized</td>
 <td>More info on vivo morpholinos: <a href="http://www.gene-tools.com" target="_blank">www.gene-tools.com</a></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Barbed-end needle</td>
 <td>Becton-Dickinson</td>
 <td>305178</td>
 <td>To generate the incision in the skull</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dissecting microscope</td>
 <td>Olympus, Leica, Zeiss </td>
 <td>Varies with the manufacturer</td>
 <td>Part of the whole injection setup</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dumont Tweezers</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>501985</td>
 <td>To snap off the tip of the glass capillary</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluorescence camera</td>
 <td>Zeiss, Nikon, Leica</td>
 <td>Varies with the manufacturer</td>
 <td>To visualize the fluorescence after injection</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gillies Dissecting Forceps</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>501265</td>
 <td>To hold the fish in position</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass injection capillaries</td>
 <td>World Precision Instruments </td>
 <td>TWF10 </td>
 <td>For microinjection</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PicoNozzle kit (microinjector holder)</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>5430-12</td>
 <td>For microinjection</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pneumatic PicoPump (microinjector)</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>SYS-PV820 </td>
 <td>For microinjection</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ring illuminator; Ring Light Guide</td>
 <td>Parkland Scientific</td>
 <td>ILL-RLG </td>
 <td>For illuminating the specimen</td>
 </tr>
	</tbody>
 </table>

micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides

Manipulatie van genexpressie in weefsels moet functionele studies te verrichten. In dit artikel tonen we de cerebroventricular microinjectie (CVMI) techniek als middel om genexpressie moduleren in de volwassen hersenen zebravis. Door CVMI kunnen stoffen worden toegediend in de cerebroventricular fluïdum en grondig verdeeld langs de rostrocaudale as van de hersenen. We vooral gericht op het gebruik van antisense morfolino-oligonucleotiden, die krachtige instrumenten voor neerhalen genexpressie in vivo. Bij onze werkwijze, toegepast, morfolino moleculen opgenomen door de epitheelcellen van de ventriculaire oppervlak. Deze cellen zijn de radiale gliacellen, die als neurogene progenitors. Daarom neerhalen genexpressie in de radiale gliacellen is van het grootste belang om de wijdverbreide neurogenese respons in de zebravis te analyseren, en zou ook inzicht geven in hoe gewervelde dieren volwassen Neurogen kon volhoudenesis reactie. Een dergelijk inzicht zou ook helpen de inspanningen voor klinische toepassingen in de humane neurodegeneratieve aandoeningen en centraal zenuwstelsel regeneratie. Zo presenteren we de cerebroventricular microinjectie werkwijze een snelle en efficiënte manier om genexpressie en neurogenese reactie in de volwassen zebravissen voorhersenen veranderen. Wij bieden ook tips en andere nuttige informatie over hoe het uitvoeren van de CVMI procedure.

Cerebroventricular micro-injectie leidt tot een brede verspreiding van de geïnjecteerde oplossing Met behulp van de workflow en de technische regeling van de cerebroventricular micro-injectie in figuur 1, we toegediend morpholino oligonucleotiden in de volwassen hersenen zebravis. Een nauwkeurige injectie protocol leidt tot dispersie van de injectievloeistof door de hersenen en efficiënt richten van de cellen nabij de ventriculaire oppervlak (Figuur 2A). Injecties waar het glas capillaire doorboort het hersenweefsel hebben een dichte fluorescent signaal op de plaats van injectie (figuur 2B). Indien het geïnjecteerde bedrag niet genoeg is, zal zwak fluorescerend signaal worden waargenomen (figuur 2C). Cerebroventricular micro-injectie kan worden gebruikt voor het neerhalen genexpressie op ventriculaire gebied van de volwassen hersenen zebravis We hebben aangetoond thin vivo morpholinos kan een paar celdiameters binnen de ventriculaire oppervlak doordringen en dus efficiënt kunnen richten op de ventriculaire cellen (Figuren 3A, 3B). Morfolino injectie kan knockdown genexpressie zal verlichting van de productie van het overeenkomstige eiwit (een voorbeeld is PCNA zoals getoond in de figuren 3C, 3D). We hebben eerder aangetoond dat neerhalen genen met behulp van deze techniek leidt tot functionele gevolgen tijdens de volwassen neurogenese (figuren 3E, 3F) of regeneratie respons (figuren 3G, 3H). We toonden aan dat de efficiënte knockdown bereik (meer dan 50% knockdown) wordt bereikt ongeveer 12 uur na injectie van de morpholinos 22. We merkten ook op dat efficiënte knockdown loopt tot ongeveer 5 dagen na de injectie voor de PCNA eiwit 22. Meer dan 70% knockdown werd waargenomen tot 3 dagen na de injectie 22. De knock-down curves zijn afhankelijk on het expressieniveau van de endogene eiwitten en de efficiëntie van de morfolino moleculen, en moet worden bepaald voor elk gen door de experimentator. In onze studies hebben we niet zien dat de CVMI procedure compromitteert het voortbestaan ​​van het dier, waarschijnlijk omdat de administratie van de morfolino moleculen lokaal is en niet leidt tot een systemische toxiciteit. <img alt="Figuur 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50415/50415fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50415/50415fig1.jpg" /> Figuur 1. Schematische weergave van de cerebroventricular injectietechniek. (A) De injectie wordt uitgevoerd op het ruggedeelte van de volwassen zebravissen (1) op het niveau van optische Tectum (ot, 2). Een incisie wordt gemaakt over de optische tectal schedel plaat met een 30-gauge naald (3). Gebruik van glazen capillairen, worden de moleculen morfolino geïnjecteerd in de ventriculaire vloeistof (4). Een grondige dispersie eendiens chieved (5). (B) De canule en barbed-uiteinde wordt in hoge vergroting. (C) De oriëntatie van de naald vóór de incisie. (D) De incisie wordt omcirkeld en aangegeven met stippellijnen. (E) De injectie capillair is geplaatst zoals en injectie wordt uitgevoerd. Alle panelen zijn overgenomen van ref. 22. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50415/50415fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> . <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/50415/50415fig2.jpg" /> Figuur 2. Vergelijking van injectierendement en opname. (A) Een goede injectie leidt het richten van de cellen nabij de ventriculaire oppervlak. (B) Als de glazen capillair wordt in het hersenweefsel, zal dit een centraal gelegen fluorescentiesignaal genereren. (C </strong&gt;) Als de hoeveelheid injectie laag is, zal dit leiden tot zwakkere fluorescentie-signaal. <img alt="Figuur 3" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50415/50415fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50415/50415fig3.jpg" /> Figuur 3. . Morfolino penetratie, efficiëntie van gen knockdowns en functionele gevolgen (A) GFP immunokleuring op de telencephalic dwarsdoorsneden van controle morfolino-geïnjecteerde Tg (H2A: GFP) transgene lijn die GFP-positieve kernen. (B) GFP immunokleuring op de telencephalic dwarsdoorsneden van gfp antisense morfolino-geïnjecteerde Tg (H2A: GFP) transgene lijn die GFP-positieve kernen. Merk het verschil in het GFP-signaal op de ventriculaire gebied. v: ventrikel. (C) PCNA immunokleuring op controle morfolino-geïnjecteerde hersenen toont wijdverspreide distributie van PCNA-positieve cellen. ( <strong&gt; D) PCNA immunokleuring op PCNA antisense morfolino-geïnjecteerde hersenen tonen aanzienlijk verminderd hoeveelheden PCNA-positieve cellen, waaruit blijkt dat CVMI kan knockdown endogene genen. (E) BrdU en HuC / D immunostaining op controle morfolino-geïnjecteerde hersenen om pasgeboren neuronen na een BrdU pulse-chase experiment beschreven vóór 22 bepalen. (F) BrdU en HuC / D immunostaining op PCNA antisense morfolino-ingespoten hersenen om pasgeboren neuronen na een BrdU pulse-chase experiment beschreven vóór 22 bepalen. (G) kloppen-down PCNA leidt tot een aanzienlijke vermindering in productie van pasgeboren neuronen, wat aangeeft dat CVMI kunnen worden om knockdown endogene genen die tot functionele consequenties. Alle panelen zijn overgenomen van ref. 22 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50415/50415fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> .

Watch this Scientific Journal Video about Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides at JoVE.com

Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

In dit artikel tonen we een werkwijze voor het manipuleren van genexpressie in het ventriculaire cellen van het volwassen zebravissen telencephalon met morfolino antisense oligonucleotiden. Wij stellen deze werkwijze efficiënt en snel protocol dat kan worden gebruikt voor functionele studies in de volwassen gewervelde hersenen.

Micromanipulatie van genexpressie in de Adult zebravis hersenen met behulp Cerebroventricular Micro-injectie van Morfolino Oligonucleotides

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Spinal Cord Elektrofysiologie II: Extracellulaire Suction Elektrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

Met een hoge resolutie Live-Imaging van cel gedrag in de ontwikkelingslanden Neuroepithelium

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain

Geoptimaliseerd Analyse van DNA-methylatie en Gene Expression uit kleine, anatomisch gedefinieerde gebieden van de hersenen

Exposure to diet, drugs and early life adversity during sensitive windows of life 1,2 can lead to lasting changes in gene expression that contribute to ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Elektrofysiologische opname in de hersenen van Intact Adult zebravis

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Analysis of Gene Expression Changes in the Rat Hippocampus After Deep Brain Stimulation of the Anterior Thalamic Nucleus

Analyse van genexpressie Veranderingen in het Rat Hippocampus Na Deep Brain Stimulation van de Anterior Thalamic Nucleus

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

Met behulp van fluorescentie-geactiveerde Cell Sorting voor Onderzoek Cell-type-specifieke genexpressie in Rat Brain Tissue

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Modeling Amyloid-&#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Modelleren van Amyloid-β42 toxiciteit en neurodegeneratie in volwassen Zebrafish hersenen

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to ...

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

In Vivo Controle van de circadiane klok genexpressie in de muis Suprachiasmatic kern met behulp van fluorescentie verslaggevers

This technique combines optical fiber mediated fluorescence recordings with the precise delivery of recombinant adeno-associated virus based gene ...

Using Near-infrared Fluorescence and High-resolution Scanning to Measure Protein Expression in the Rodent Brain

Het gebruiken van dichtbijgelegen-infrarode fluorescentie en hoge resolutie het scannen om eiwituitdrukking in de knaagdieren hersenen te meten

Neuroscience is the study of how cells in the brain mediate various functions. Measuring protein expression in neurons and glia is critical for the study ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Beoordeling van langdurige depressie inductie in volwassen cerebellaire schijfjes

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...