Name: micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides
Uploaded: 2013-05-23T17:00:00
Duration: 5 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 655) og Den europeiske union (Zf-Health).

En. Klargjøring av Injection Blanding <ol><li> Bruk vivo Morpholinos som celler internalisere dem mer effektivt enn vanlige morfolino molekyler. Se produsentens opplysninger for detaljer (Tabell 1: Reagenser og materialer). </li><li> Bruk en fluorescerende sporing fargestoff (f.eks CellTracker Red CMTPX, Invitrogen) for å visualisere nøyaktigheten av injeksjonen. Dette fargestoff er metabolisert i cellen og blir fluorescerende bare i cellen etter opptaket. Derfor er dette trinnet avgjørende for å fastslå de cellene som er effektivt målrettet av cerebroventricular mikroinjeksjon. </li><li> Forbered fosfat-bufret saltvann (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na HPO 2 4, 2 mM KH PO 2 4, pH: 7,4) til fortynning morpholino-løsning. Hvis en fortynning av den morpholino løsning er nødvendig ved alltid å bruke PBS. </li><li> Forbered 10 mL av injeksjon blandingen ved å legge til 9 mL av morpholino løsning og en ul av the celle tracker fargestoff (fortynnet eller ufortynnet Aksjen konsentrasjonen av morpholino løsningen er 500 mikrometer Våre tidligere resultater 22 indikerer at flere ulike doser av morpholino -.. som strekker seg fra 50 mikrometer til 500 mikrometer - resultere i forskjellige nivåer av knockdown fra en effektiv knockdown til hypomorphic fenotyper). 1 ul oppløsning er nok for injeksjon i en zebrafisk hjernen. </li><li> Bland godt og lagres ved romtemperatur inntil injeksjon. </li></ol> 2. Klargjøring av Injection Apparatus <ol><li> Klargjør glasset injeksjon kapillærer hjelp av en nål avtrekker. Bruk følgende parametere: Oppvarming syklus verdi: 463, trekke syklus verdi: 230, hastighet: 1,5 sek, tid: 75 ms. </li><li> Slå på trykket kilde og justere trykkinnstillinger til 50 psi eller 3,5 barer. </li><li> Juster microinjector innstillingene slik: hold trykk 20 psi, eject trykk 10 psi, periode verdi på 2,5 og 100 msek spekter av gating. </li><li> Svingpå ringen lyset og finne ringen over mikroskopet scenen. </li><li> Plasser den kapillære holderen til en passende stilling ved siden av mikroskopet. </li><li> Sett glasskapillær inn i holderen. Juster injeksjon vinkel til 45 grader. </li><li> Sprette av tuppen av glass kapillær med en fin-end pinsett og kalibrere trykkytelse fra åpningen. Dette må bli testet ved å senke spissen av nålen inn i fisken vann og gi en kontinuerlig trykkpuls. De luftbobler som oppstår skal bare være en rad, noe som er en indikasjon på optimalt trykk / åpningsstørrelse. Vennligst se video for demonstrasjon av denne kalibreringen. </li><li> Laste glasskapillær med injeksjon løsning uten luftbobler. </li><li> Gi trykk for å fjerne luft mellom spissen av glasset kapillarrøret og den lastede injeksjonsoppløsningen. </li></ol> 3. Anestesi <ol><li> Klargjør stamløsning av anestetika (0,1% MESAB - etyl-m-aminobenzoat-metansulfonat). </li><li> Fjern ønskede antall fisk fra deres beholdere i plast mus bur eller annet transport-beholder med tilstrekkelig mengde vann. </li><li> Klargjør for anestesi-løsning i en liten plastboks ved å blande 200 ml av fisk vann med 5 ml av anestetika stamløsning. Sluttkonsentrasjonen av anestetika: 0,0025% (v / v). </li><li> Half-fylle en plast petriskål med bedøvelse. Bruk denne retten for injeksjoner. </li><li> Inkuber fisk i bedøvelsesmidler til fisken undertvinger. </li></ol> 4. Snitt og Cerebroventricular Mikroinjeksjon <ol><li> Fjern fisken fra boksen med en fisk nettet og plassere den i petriskål. </li><li> Hold forsiktig fiskene med pinsett og orientere hodet på en slik måte at den kan vippes litt nedover. Dette vil lette innsnitt. </li><li> Generere en liten spalte på skallen med en 30 gauge piggtråd-end nål. Bruk bare spissen av nålen, og kan ikke trenge mer ennnok inn i hjernen, da dette vil føre til skader på hjernevev og vil manifestere seg som blødning. </li><li> Fortsett å holde fisken og sett spissen av glass kapillær gjennom innsnitt området. </li><li> Orient tuppen av glass kapillær mot telencephalon. Unngå å ta hjernevevet fordi dette skaper vevsskade og også forhindrer dispergering av den injiserte oppløsning. </li><li> Injisere løsningen. Væsken sprer umiddelbart etter injeksjon. </li></ol> 5. Utvinning og Analysere Injection Nøyaktighet <ol><li> Fjern fisken fra injeksjon oppsett og sted inn i en plastboks med fersk fisk vann. </li><li> Tillate utvinning. </li><li> Re-anaesthetize fisken med 0,0025% MESAB kort og sjekke fisken under fluorescens mikroskop. En grundig dispersjon av rød fluorescens er en indikasjon på utstrakt fordeling av den injiserte væske. </li><li> Legg fisken tilbake til plastboks. </li><li> Koble plastboks til than sirkulasjonssystem oksygenering av fisk og opprettholde over lengre tidsperioder. </li><li> Bruk fisk til ønskede formål som atferdsmessige analyser eller ofre dyrene på ønskede tidspunkter etter injeksjonen for å forberede vevsprøver for videre analyser (histologiske stainings, immunhistokjemi, osv.). Følgende referanser gi eksempler på hvordan å analysere voksen sebrafisk hjerne: 9,11,17-20,24-27. Den raskeste tid til å observere en effektiv knockdown (mer enn 50% knockdown) var 12 hr i våre studier 22. </li></ol> 6. Foreslåtte Vitenskapelige Controls <ol><li> Bruk en mismatch morfolinogruppe molekyl som ikke er ment å medføre noen fenotype som en negativ kontroll. Bruke enten et standard morfolino molekyl eller spesifikt motiv morfolino kontroller for hvert gen av interesse. I tillegg, bruker oppløsningsmiddel (i dette tilfellet PBS) som en ytterligere negativ kontroll for å vurdere den ikke-spesifikke virkninger eller toksisitet av mismeatch / styre morfolino injeksjoner. </li><li> Bruk PCNA Morpholinos beskrevet tidligere 22 som positive kontroller. Dette morpholino fører til effektiv knockdown i den voksne sebrafisk hjernen (75-95% knockdown effektivitet innen en dag som injeksjonen) 22. </li></ol>

<ol>
	<li>Stocum, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Regenerative Biology and Medicine. , (2006).</li><li>Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+understanding+tissue+regenerative+capacity+and+mechanisms+in+animals.">Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals.</a> Nat. Rev. Genet. 11 (10), 710-722 (2010).</li><li>Doetsch, F., Scharff, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+for+brain+repair:+insights+from+adult+neurogenesis+in+birds+and+mammals.">Challenges for brain repair: insights from adult neurogenesis in birds and mammals.</a> Brain Behav. Evol. 58 (5), 306-322 (2001).</li><li>Kaslin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation,+neurogenesis+and+regeneration+in+the+non-mammalian+vertebrate+brain.">Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 363 (1489), 101-122 (2008).</li><li>Kizil, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neurogenesis+and+brain+regeneration+in+zebrafish.">Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish.</a> Dev. Neurobiol. 72 (3), 429-461 (2012).</li><li>Grandel, H., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+aspects+of+adult+neural+stem+cell+activity+in+vertebrates.">Comparative aspects of adult neural stem cell activity in vertebrates.</a> Dev. Genes Evol. , (2013).</li><li>Kempermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Adult Neurogenesis 2: Stem Cells and Neuronal Development in the Adult Brain. , (2010).</li><li>Ihrie, R. A., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+in+the+astroglial+lineage+are+neural+stem+cells.">Cells in the astroglial lineage are neural stem cells.</a> Cell Tissue Res. 331 (1), 179-191 (2008).</li><li>Grandel, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+and+neurogenesis+in+the+adult+zebrafish+brain:+origin,+proliferation+dynamics,+migration+and+cell.">Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell.</a> 295 (1), 263-277 (2006).</li><li>Chapouton, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neurogenesis+in+non-mammalian+vertebrates.">Adult neurogenesis in non-mammalian vertebrates.</a> Bioessays. 29 (8), 745-757 (2007).</li><li>Adolf, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+and+acquired+features+of+adult+neurogenesis+in+the+zebrafish+telencephalon.">Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon.</a> Dev Biol. 295 (1), 278-293 (2006).</li><li>Byrd, C. A., Brunjes, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+the+olfactory+bulb+of+adult+zebrafish.">Neurogenesis in the olfactory bulb of adult zebrafish.</a> Neuroscience. 105 (4), 793-801 (2001).</li><li>Pellegrini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+aromatase-positive+radial+glial+cells+as+progenitor+cells+in+the+ventricular+layer+of+the+forebrain+in+zebrafish.">Identification of aromatase-positive radial glial cells as progenitor cells in the ventricular layer of the forebrain in zebrafish.</a> J. Comp. Neurol. 501 (1), 150-167 (2007).</li><li>Lam, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gfap+and+nestin+reporter+lines+reveal+characteristics+of+neural+progenitors+in+the+adult+zebrafish.">gfap and nestin reporter lines reveal characteristics of neural progenitors in the adult zebrafish.</a> 238 (2), 475-486 (2009).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Wnt-responsive+cells+in+the+zebrafish+hypothalamus.">Identification of Wnt-responsive cells in the zebrafish hypothalamus.</a> Zebrafish. 6 (1), 49-58 (2009).</li><li>Kaslin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+in+the+adult+zebrafish+cerebellum:+initiation+and+maintenance+of+a+novel+stem+cell+niche.">Stem cells in the adult zebrafish cerebellum: initiation and maintenance of a novel stem cell niche.</a> J. Neurosci. 29 (19), 6142-6153 (2009).</li><li>Ganz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+and+Fgf+dependence+of+adult+neural+progenitors+in+the+zebrafish+telencephalon.">Heterogeneity and Fgf dependence of adult neural progenitors in the zebrafish telencephalon.</a> Glia. 58 (11), 1345-1363 (2010).</li><li>M&#228;rz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+progenitor+cell+subtypes+in+the+ventricular+zone+of+the+zebrafish+adult+telencephalon.">Heterogeneity in progenitor cell subtypes in the ventricular zone of the zebrafish adult telencephalon.</a> Glia. 58 (7), 870-888 (2010).</li><li>Rothenaigner, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+analysis+by+distinct+viral+vectors+identifies+bona+fide+neural+stem+cells+in+the+adult+zebrafish+telencephalon+and+characterizes+their+division+properties+and+fate.">Clonal analysis by distinct viral vectors identifies bona fide neural stem cells in the adult zebrafish telencephalon and characterizes their division properties and fate.</a> Development. 138 (8), 1459-1469 (2011).</li><li>Kroehne, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+the+adult+zebrafish+brain+from+neurogenic+radial+glia-type+progenitors.">Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors.</a> Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).</li><li>Ito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+neural+stem+cells+and+their+progeny+in+the+adult+zebrafish+optic+tectum.">Characterization of neural stem cells and their progeny in the adult zebrafish optic tectum.</a> Dev. Biol. 342 (1), 26-38 (2010).</li><li>Kizil, C., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebroventricular+microinjection+(CVMI)+into+adult+zebrafish+brain+is+an+efficient+misexpression+method+for+forebrain+ventricular+cells.">Cerebroventricular microinjection (CVMI) into adult zebrafish brain is an efficient misexpression method for forebrain ventricular cells.</a> PLoS One. 6 (11), e27395 (2011).</li><li>Morcos, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vivo-Morpholinos:+a+non-peptide+transporter+delivers+Morpholinos+into+a+wide+array+of+mouse+tissues.">Vivo-Morpholinos: a non-peptide transporter delivers Morpholinos into a wide array of mouse tissues.</a> Biotechniques. 45 (6), 613-614 (2008).</li><li>Kizil, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemokine+receptor+cxcr5+regulates+the+regenerative+neurogenesis+response+in+the+adult+zebrafish+brain.">The chemokine receptor cxcr5 regulates the regenerative neurogenesis response in the adult zebrafish brain.</a> Neural Dev. 7, 27 (2012).</li><li>Chapouton, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=her5+expression+reveals+a+pool+of+neural+stem+cells+in+the+adult+zebrafish+midbrain.">her5 expression reveals a pool of neural stem cells in the adult zebrafish midbrain.</a> Development. 133 (21), 4293-4303 (2006).</li><li>Kizil, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+neurogenesis+from+neural+progenitor+cells+requires+injury-induced+expression+of+Gata3.">Regenerative neurogenesis from neural progenitor cells requires injury-induced expression of Gata3.</a> Developmental Cell. 23 (6), 1230-1237 (2012).</li><li>Kyritsis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+inflammation+initiates+the+regenerative+response+in+the+adult+zebrafish+brain.">Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain.</a> Science. 338 (6112), 1353-1356 (2012).</li><li>Rosen, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).</li><li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos.">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).</li><li>Rikin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reverse+genetic+approach+to+test+functional+redundancy+during+embryogenesis.">A reverse genetic approach to test functional redundancy during embryogenesis.</a> J. Vis. Exp. (42), e2020 (2010).</li></ol>

Ingen interessekonflikter erklært.

Metoden vi beskriver her gir enkel og rask administrasjon av Morpholinos inn i voksen sebrafisk hjernen. Vi har vist at vår injeksjon metode effektivt blokkerer genekspresjon i de ventrikulære celler, og resulterer i funksjonelle konsekvenser i nevrogenesen respons. Det er viktige punkter å være forsiktige under behandlingen av cerebroventricular mikroinjeksjon. For eksempel, avhengig av effekten av molekyler på morfolino ved konsentrasjonen anvendt. Denne konsentrasjon skal bestemmes av slutt-brukeren. Vi anbefaler at du starter med stamløsning (500 mm) og utføre seriefortynning, og ideelt å pre-test ved injeksjon i embryoer ved hjelp av standard embryo injeksjon protokoller 28-30. Tidligere fikk vi ulike nivåer av knockdown effektivitet med konsentrasjoner av Morpholinos fra 50 mikrometer til 500 mikrometer 22. Andre bør åpningen av glasskapillær ikke være store fee, da dette vil føre til omfattende væske tilstrømning inn i hjernen etter injeksjonen. Likeledes må åpningen ikke være for smal, da dette vil forhindre tilstrekkelig injeksjon. Man kan bestemme den optimale åpningsdefinerende trykk kombinasjon ved å pumpe luft inn i en petriskål med vann. Boblene som oppstår bør være i en enkelt rad, men ikke i flere rader. Vi viser dette i videoen. Tredje, inkubering av fisken i anestetika er kritisk. Fisken bør ikke holdes lenger enn 2 min i anestetika. Dette vil hemme utvinningsgraden etter injeksjonen. Fjerde, plasseringen av innsnitt kritisk for grundig dispergering av den injiserte væske. Den ventrikulære regionen over optisk Tectum er større over midtlinjen og får smalere lateralt. Derfor bør eksperimentator generere slit i skallen nær midtlinjen og bare kaudal til skallen plate dekker telencephalic regionen. En av fordelene med cerebroventricular injection (CVMI)-metoden er dens rapidness. CVMI er en rask metode for bestemmelse genfunksjon. Denne funksjonen er viktig og nyttig i forhold til generering av transgene linjer for funksjonelle studier, som vanligvis tar flere måneder. I tillegg fører CVMI til jevn fordeling av den injiserte væske, og derfor gir et forholdsvis grundig manipulering av genet aktivitet, i forhold til fokal injeksjoner eller electroporation. Med CVMI, kan flere gener bli slått ned samtidig ved å forberede injeksjon blander inneholder flere Morpholinos oligonukleotid. CVMI kan brukes til å injisere forskjellige konsentrasjoner av en gitt morfolino oligonukleotider, og kan følgelig anvendes for å analysere hypomorphic fenotyper. Endelig, dette injeksjon paradigmet ikke forårsake toksisitet eller kompromiss overlevelsen av dyrene. Den CVMI teknikken kan bli utvidet for andre typer studier som injeksjon av regulerende peptider, narkotika, plasmid DNA eller regulerende RNA molecules eller andre stoffer som kan påvirke fysiologi av cellene. Analysering kombinasjon av molekyler og utføre dose-respons analyser er mulig ved hjelp av vår metode, slik at å studere hypomorphic fenotyper. Med disse egenskapene, beviser CVMI å være en rask og enkel test for uttrykk studier i voksen sebrafisk hjernen, og åpner opp rask screening og funksjonelle analyser. Den voksne sebrafisk hjernen kan constitutively produsere nye nerveceller langs hele rostrocaudal aksen og det kan også regenerere etter traumatiske skader. Dette står i sterk kontrast til mammalske hjerne med begrenset nevrogenesen og hvis i det hele tatt, heller dårlig evne til reproduksjon. Slike omfattende stamcelleforskningen aktivitet og rekreasjon muligheten gjør sebrafisk en nyttig modell organisme for å forstå de molekylære programmer som kreves for sentralnervesystemet gjenfødelse, som for tiden er i stor grad ukjent. Derfor undersøker det molekylære grunnlaget for den regenerative evner av zebrafish hjernen er en interessant verden av forskning som kan forklare den grunnleggende forskjellen hvordan fisk og pattedyr hjerner reagerer etter en skade, og også gi gave veier for regenerativ medisinske behandlingsformer hos mennesker. For å forstå den molekylære infrastruktur av virveldyr hjernens plastisitet og regenerering, gliaceller tjene som et viktig forskningsfelt som de er neurogene stamfedre 3,8,20. Dermed bruker CVMI teknikk for å endre gen-funksjon i de radiale gliaceller av sebrafisk hjerne er instrumental i å belyse hvordan fisk hjernen kan par stamfar aktivitet til effektiv voksen neurogenesis og regenerativ respons. Vi har nylig vist engasjement og kravet av flere faktorer og signalveier i regenerativ neurogenesis respons av den voksne sebrafisk hjerne 24,26,27, og disse studiene ble gjort mulig ved bruk av CVMI metoden. Samlet kan den kunnskapen vi får fra sebrafisk hjernen bli brukt til å pålegge regenerative evne til pattedyr gliacellene som reagerer på skader og vil dermed bidra til å utforme kliniske terapi for menneskelige nevrologiske lidelser og akutte skader.

Voksen neurogenesis er et fellestrekk for virveldyr, men dens grad av utbredelse og effektivitet varierer med fylogeni 1,2,3,4,5,6. For eksempel, voksne pattedyr hjerner inneholder stamceller regioner i stor grad begrenset til 7,8 forhjernen, mens teleost sebrafisk inneholder seksten forskjellige stamcelle domener og tilhørende neurogene soner i hele hjernen 4,5,9,10. Denne variasjonen mellom pattedyr og sebrafisk kan gjenspeile et misforhold i mekanismene for stamcelleforskningen vedlikehold og nevrogen kapasiteten til stamceller. Livslang kompetanse sebrafisk til å produsere nerveceller i hjernen kan også utgjøre kliniske konsekvenser som de molekylære mekanismene ansatt av sebrafisk hjernen kan bli brukt til terapeutiske programmer for å takle de nevrodegenerative lidelser hos mennesker. Flere stamceller soner av den voksne hjernen zebrafisk har blitt analysert, og det har vist seg at denceller lining ventrikkel overflaten av disse regionene tjene som stamceller 9,11-20. Detaljerte analyser i zebrafisk telencephalon, for eksempel, identifisert de radiale glial-celler, som avgrense ventrikulære overflate av denne hjerne regionen for å være nevrogen progenitorer 19, 20. Dette gjelder for andre regioner som lillehjernen og den optiske Tectum, hvor ventricularly plassert neuroepithelial celler gir nevrogen inngang 16,21. For dette formål, å forstå de molekylære mekanismene som styrer den utbredte nevrogen kompetanse i voksen sebrafisk hjerne krever manipulering av genuttrykk i stamceller. Ulike metoder ble tidligere beskrevet for modulerende gen-funksjon hos sebrafisk. Disse inkluderer generasjon av betingede transgene linjer uttrykker ønskede varianter av et enkelt protein, plasmid-baserte fokale injeksjoner koblet til electroporation eller kjemiske behandlinger. Vi har tidligere utviklet enmetode for å administrere ulike stoffer, inkludert morfolino oligonukleotidene eller proteiner i den voksne sebrafisk hjernen ved hjelp cerebroventricular mikroinjeksjon som en rask og effektiv måte å modulere gen-funksjon i ventrikulære celler av den voksne sebrafisk forhjernen 22. I våre undersøkelser ble vivo Morpholinos brukt på grunn av deres kjemi som involverer morpholino molekyl kovalent bundet til arginin rike levering peptider, som muliggjør effektiv levering til cellene av interesse, uten behov for ekstra permeabilization eksempel elektroporering 23.. Dette vil gi en grundig målretting av ønsket vev etter injeksjon, akkurat som det vi observerte i voksen sebrafisk telencephalon 22. Bruk av vivo Morpholinos er derfor bedre enn allerede eksisterende metoder for vev målgruppe som elektroporering eller fokale injeksjon av DNA-molekyler. Her viser vi visuelt hvordan vi utfører denne operasjonen og gi ensteg-for-steg-protokollen. Vi begynner med å forklare fremstillingen av injeksjonen blandingen og fisken som skal injiseres, og fortsetter ved å demonstrere hvordan injeksjonsapparatet er satt opp. Vi gir en beskrivelse av cerebroventricular injeksjon metode, som innebærer generering av et snitt i skallen, og injeksjon av de Morpholinos hjelp microinjector. Vi har også utdype de kritiske punkter man må være forsiktige på under hele prosedyren ved å erklære dem som optimalisering eller feilsøking guider.

<table border="1">
	<tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent/Material</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CellTracker Red CMTPX</td>
 <td>Life Technologies, Invitrogen</td>
 <td>C34552</td>
 <td>Use at 1:100 dilution for measuring the injection accuracy</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MESAB (ethyl-m-aminobenzoate methanesulphonate)</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A5040</td>
 <td>For anesthetizing the fish</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Petri dishes</td>
 <td>Sarstedt</td>
 <td>821,472</td>
 <td>For handling the fish during injection and imaging</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phosphate-buffered saline</td>
 <td>Life Technologies, GIBCO</td>
 <td>10010-056</td>
 <td>As sterile dilution medium</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vivo morpholinos</td>
 <td>Gene Tools Inc.</td>
 <td>Customized</td>
 <td>More info on vivo morpholinos: <a href="http://www.gene-tools.com" target="_blank">www.gene-tools.com</a></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Barbed-end needle</td>
 <td>Becton-Dickinson</td>
 <td>305178</td>
 <td>To generate the incision in the skull</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dissecting microscope</td>
 <td>Olympus, Leica, Zeiss </td>
 <td>Varies with the manufacturer</td>
 <td>Part of the whole injection setup</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dumont Tweezers</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>501985</td>
 <td>To snap off the tip of the glass capillary</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluorescence camera</td>
 <td>Zeiss, Nikon, Leica</td>
 <td>Varies with the manufacturer</td>
 <td>To visualize the fluorescence after injection</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gillies Dissecting Forceps</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>501265</td>
 <td>To hold the fish in position</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass injection capillaries</td>
 <td>World Precision Instruments </td>
 <td>TWF10 </td>
 <td>For microinjection</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PicoNozzle kit (microinjector holder)</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>5430-12</td>
 <td>For microinjection</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pneumatic PicoPump (microinjector)</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>SYS-PV820 </td>
 <td>For microinjection</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ring illuminator; Ring Light Guide</td>
 <td>Parkland Scientific</td>
 <td>ILL-RLG </td>
 <td>For illuminating the specimen</td>
 </tr>
	</tbody>
 </table>

micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides

Manipulering av genekspresjon i vev er nødvendig for å utføre funksjonelle studier. I denne artikkelen viser vi den cerebroventricular mikroinjeksjon (CVMI) teknikken som et middel til å modulere genuttrykk i den voksne sebrafisk hjernen. Ved å bruke CVMI, kan stoffene administreres inn i det cerebroventricular væske og bli grundig fordelt langs rostrocaudal aksen av hjernen. Vi spesielt fokus på bruk av antisens oligonukleotider morfolino, som er kraftige verktøy for å slå ned genekspresjon in vivo. I vår metode, når den brukes, er morfolino molekyler tas opp av cellene lining ventrikkel overflate. Disse celler inkluderer de radiale glial-celler, som fungerer som nevrogene stamceller. Derfor slå ned genuttrykk i de radiale gliaceller er av største betydning for å analysere den utbredte neurogenesis respons i sebrafisk, og også vil gi innsikt i hvordan virveldyr kunne opprettholde voksen neurogenESIS respons. En slik forståelse vil også bidra til arbeidet for kliniske applikasjoner i humane nevrodegenerative lidelser og sentralnervesystemet regenerering. Dermed vil vi presentere cerebroventricular mikroinjeksjon metoden som en rask og effektiv måte å endre genuttrykk og neurogenesis respons i den voksne sebrafisk forhjerne. Vi tilbyr også feilsøkingstips og annen nyttig informasjon om hvordan du kan utføre CVMI prosedyren.

Cerebroventricular mikroinjeksjon fører til utbredt distribusjon av injisert løsning Ved hjelp av arbeidsflyten og teknisk ordningen av cerebroventricular mikroinjeksjon avbildet i figur 1, administrert vi morfolino oligonukleotider inn i voksen hjerne zebrafisk. En nøyaktig protokoll injeksjon fører til dispergering av den injiserte væske i hele hjernen og effektiv målretting av cellene nær den ventrikulære overflate (figur 2A). Injeksjoner hvor glasskapillær impales hjernevevet vil ha en tett fluorescerende signal på tidspunktet for injeksjon (figur 2B). Hvis injisert mengde ikke er nok, vil svake fluorescerende signal observeres (figur 2C). Cerebroventricular mikroinjeksjon kan benyttes til å slå ned genekspresjon ved ventrikulære region av voksen hjerne zebrafisk Vi har vist thpå vivo Morpholinos kan trenge noen celle diameter inne i ventrikkel overflaten og dermed effektivt kan målrette ventrikulære celler (Fig. 3A, 3B). Morfolino injeksjon kan knockdown genekspresjon som det vil lindre produksjonen av det tilsvarende protein (et eksempel er PCNA som vist i figurene 3c, 3d). Vi har tidligere vist at å banke ned gener ved hjelp av denne teknikken fører til funksjonelle konsekvenser under den voksne neurogenesis (Tall 3E, 3F) eller regenerering respons (Tall 3G, 3H). Vi demonstrerte at den effektive rekkevidde knockdown (mer enn 50% knockdown) oppnås omtrent 12 timer etter injeksjon av Morpholinos 22.. Vi har også observert at effektiv knockdown perioden er inntil ca 5 dager etter injeksjonen for PCNA protein 22. Mer enn 70% knockdown ble sett inntil 3 dager etter injeksjonen 22. De knockdown kurvene er avhengige on nivået av ekspresjon av de endogene proteiner og effektiviteten til morfolino molekyler, og må bestemmes for hver genet ved experimenter. I våre studier, fikk vi ikke se at CVMI prosedyren kompromisser overlevelsen av dyret, trolig fordi administrasjonen av morfolino molekyler er lokal og ikke forårsaker en systemisk toksisitet. <img alt="Figur 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50415/50415fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50415/50415fig1.jpg" /> Figur 1. Skjematisk fremstilling av cerebroventricular injeksjonsteknikk. (A) Injeksjonen utføres fra dorsal av den voksne sebrafisk (1) på nivå med optisk Tectum (ot, 2). Et snitt er gjort over den optiske tectal skallen plate med en 30-gauge nål (3). Ved hjelp av glass kapillarer, er morfolino molekyler injisert i den ventrikulære væske (4). En grundig spredning er enchieved momentant (5). (B) Det kanylen og piggtråd-end er vist i høy forstørrelse. (C) Orienteringen av nålen før snittet. (D) Snittet er sirkel og skissert av stiplede linjer. (E) Injeksjonen kapillær er plassert som vist, og injeksjonen er utført. Alle paneler var tilpasset fra ref.. 22.. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50415/50415fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se større figur</a> . <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/50415/50415fig2.jpg" /> Figur 2. Sammenligning av injeksjons effektivitet og nøyaktighet. (A) En god injeksjon fører til målretting av cellene nær den ventrikulære overflate. (B) ved glasskapillær settes inn i hjernevevet, vil dette generere en sentralt plassert fluorescens-signal. (C </strong&gt;) Hvis mengden av injeksjon er lavt, vil dette føre til svakere fluorescens signal. <img alt="Figur 3" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50415/50415fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50415/50415fig3.jpg" /> Figur 3. . Morfolinogruppe penetrasjon, effektivitet genet knockdowns og funksjonelle konsekvenser (A) GFP farging på telencephalic tverrsnitt av kontroll morpholino-injisert Tg (H2A: GFP) transgene linjen viser GFP-positive kjerner. (B) GFP farging på telencephalic tverrsnitt av GFP antisans morpholino-injisert Tg (H2A: GFP) transgene linjen viser GFP-positive kjerner. Legg merke til forskjellen i GFP-signal på ventrikkel regionen. v: ventrikkel. (C) PCNA farging på kontroll morpholino-injisert hjerner viser omfattende distribusjon av PCNA-positive celler. ( <strong&gt; D) PCNA farging på PCNA antisensforbindelser morpholino-injisert hjerner viser betydelig redusert mengder PCNA-positive celler, som viser at CVMI can knockdown endogene gener. (E) BrdU og HUC / D farging på kontroll morpholino-injisert hjerner til å bestemme nyfødte nerveceller etter en BrdU puls-chase eksperimentet beskrevet før 22.. (F) BrdU og HUC / D farging på PCNA antisensforbindelser morpholino-injisert hjerner til å bestemme nyfødte nerveceller etter en BrdU puls-chase eksperimentet beskrevet før 22.. (G) Knocking-ned PCNA fører til betydelig reduksjon i generering av nyfødte nevroner, noe som indikerer at CVMI kan brukes til å knockdown endogene gener, som gir opphav til funksjonelle konsekvenser. Alle paneler var tilpasset fra ref.. 22. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50415/50415fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se større figur</a> .

Watch this Scientific Journal Video about Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides at JoVE.com

Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

I denne artikkelen viser vi en metode for manipulering av genuttrykk i ventrikulære celler av den voksne sebrafisk telencephalon hjelp antisensforbindelser morfolino oligonukleotidene. Vi presenterer denne fremgangsmåte som en effektiv og rask protokoll som kan brukes for funksjonelle studier av den voksne hjernen hos virveldyr.

Mikromanipulasjonsprosedyre av Gene Expression i voksen sebrafisk Brain hjelp Cerebroventricular Mikroinjeksjon av morpholino Oligonukleotider

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

Høy oppløsning Live-Imaging of Cell Behavior i utviklingsland Neuroepithelium

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain

Optimalisert Analyse av DNA-metylering og Gene Expression fra små, anatomisk definerte områder i hjernen

Exposure to diet, drugs and early life adversity during sensitive windows of life 1,2 can lead to lasting changes in gene expression that contribute to ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Elektro opptak i hjernen til Intakt Adult Sebrafisk

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Analysis of Gene Expression Changes in the Rat Hippocampus After Deep Brain Stimulation of the Anterior Thalamic Nucleus

Analyse av genuttrykk Endringer i Rat Hippocampus Etter dyp hjernestimulering av fremre talamiske Nucleus

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

Bruke fluorescensaktivert Cell Sorting å undersøke Cell-Type-Specific genuttrykk i Rat hjernevev

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Modeling Amyloid-&#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Modellering Amyloid-β42 giftighet og Neurodegeneration i voksen sebrafisk hjernen

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to ...

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

I Vivo Overvåking av Circadian klokke genuttrykk i musen Suprachiasmatic kjernen bruker fluorescens journalister

This technique combines optical fiber mediated fluorescence recordings with the precise delivery of recombinant adeno-associated virus based gene ...

Using Near-infrared Fluorescence and High-resolution Scanning to Measure Protein Expression in the Rodent Brain

Bruke nær-infrarød fluorescens og høyoppløselig skanning å måle protein uttrykk i gnagere Brain

Neuroscience is the study of how cells in the brain mediate various functions. Measuring protein expression in neurons and glia is critical for the study ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Vurdering av lang tids depresjon induksjon i voksen lillehjernen skiver

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...