Name: reconstitution of a kv channel into lipid membranes for structural and functional studies
Uploaded: 2013-07-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies at JoVE.com

जियांग प्रयोगशाला में KvAP पर पढ़ाई रॉकफेलर विश्वविद्यालय में डॉ. रॉड्रिक MacKinnon की प्रयोगशाला से महत्वपूर्ण मदद प्राप्त किया है. विशेष धन्यवाद उनकी सलाह के लिए डॉ. Kathlynn ब्राउन और माइकल McQuire जाने के लिए और हमारे फेज स्क्रीन प्रयोगों पर मदद करते हैं. इस काम एनआईएच (क्यू XJ को GM088745 और GM093271) और अहा (क्यू XJ को 12IRG9400019) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था.

1. अभिव्यक्ति और KvAP चैनल का शोधन (चित्रा 1) <ol><li> तैयारी कार्य - दिवस 0 <ol><li> सामान्य dishwashing से डिटर्जेंट के निशान को हटाने के लिए विआयनीकृत पानी (Dih 2 हे) और MilliQ एच 2 ओ (MQH 2 हे) के साथ जीवाणु संस्कृति के लिए कां?...

<ol>
	<li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Biology of the Cell. , (2007).</li><li>Lee, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+lipids+and+proteins+interact+in+a+membrane:+a+molecular+approach.">How lipids and proteins interact in a membrane: a molecular approach.</a> Mol. Biosyst. 1, 203 (2005).</li><li>Lee, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+lipids+affect+the+activities+of+integral+membrane+proteins.">How lipids affect the activities of integral membrane proteins.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1666, 62 (2004).</li><li>Anderson, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+caveolae+membrane+system.">The caveolae membrane system.</a> Annu. Rev. Biochem. 67, 199 (1998).</li><li>Simons, K., Vaz, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+systems,+lipid+rafts,+and+cell+membranes.">Model systems, lipid rafts, and cell membranes.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 33, 269 (2004).</li><li>Edidin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+state+of+lipid+rafts:+from+model+membranes+to+cells.">The state of lipid rafts: from model membranes to cells.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 32, 257 (2003).</li><li>Kapoor, R., Kim, J. H., Ingolfson, H., Andersen, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Artificial+Bilayers+for+Electrophysiology+Experiments.">Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments.</a> J. Vis. Exp. (20), e1033 (2008).</li><li>Zheng, H., Liu, W., Anderson, L. Y., Jiang, Q. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-dependent+gating+of+a+voltage-gated+potassium+channel.">Lipid-dependent gating of a voltage-gated potassium channel.</a> Nat. Commun. 2, 250 (2011).</li><li>Schmidt, D., Jiang, Q. X., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipids+and+the+origin+of+cationic+gating+charges+in+voltage+sensors.">Phospholipids and the origin of cationic gating charges in voltage sensors.</a> Nature. 444, 775 (2006).</li><li>Ruta, V., Jiang, Y., Lee, A., Chen, J., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+an+archaebacterial+voltage-dependent+K++channel.">Functional analysis of an archaebacterial voltage-dependent K+ channel.</a> Nature. 422, 180 (2003).</li><li>Jiang, Q. X., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+lipids+on+voltage-gated+ion+channels.">The influence of lipids on voltage-gated ion channels.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. , 3408884 (2012).</li><li>Artimo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ExPASy:+SIB+bioinformatics+resource+portal.">ExPASy: SIB bioinformatics resource portal.</a> Nucleic Acids Res. 40, W597 (2012).</li><li>Cladera, J., Rigaud, J. L., Villaverde, J., Dunach, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome+solubilization+and+membrane+protein+reconstitution+using+Chaps+and+Chapso.">Liposome solubilization and membrane protein reconstitution using Chaps and Chapso.</a> Eur. J. Biochem. 243, 798 (1997).</li><li>Levy, D., Bluzat, A., Seigneuret, M., Rigaud, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+study+of+liposome+and+proteoliposome+reconstitution+involving+Bio-Bead-mediated+Triton+X-100+removal.">A systematic study of liposome and proteoliposome reconstitution involving Bio-Bead-mediated Triton X-100 removal.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1025, 179 (1990).</li><li>Young, H. S., Rigaud, J. L., Lacapere, J. J., Reddy, L. G., Stokes, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+tubular+crystals+by+reconstitution+of+detergent-solubilized+Ca2(+)-ATPase.">How to make tubular crystals by reconstitution of detergent-solubilized Ca2(+)-ATPase.</a> Biophys. J. 72, 2545 (1997).</li><li>Levy, D., Gulik, A., Bluzat, A., Rigaud, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+sarcoplasmic+reticulum+Ca(2+)-ATPase:+mechanisms+of+membrane+protein+insertion+into+liposomes+during+reconstitution+procedures+involving+the+use+of+detergents.">Reconstitution of the sarcoplasmic reticulum Ca(2+)-ATPase: mechanisms of membrane protein insertion into liposomes during reconstitution procedures involving the use of detergents.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1107, 283 (1992).</li><li>Cohen, F. S., Zimmerberg, J., Finkelstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+of+phospholipid+vesicles+with+planar+phospholipid+bilayer+membranes.+II.+Incorporation+of+a+vesicular+membrane+marker+into+the+planar+membrane.">Fusion of phospholipid vesicles with planar phospholipid bilayer membranes. II. Incorporation of a vesicular membrane marker into the planar membrane.</a> The Journal of General Physiology. 75, 251 (1980).</li><li>Fuks, B., Homble, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+and+electrical+properties+of+planar+lipid+membranes+from+thylakoid+lipids.">Permeability and electrical properties of planar lipid membranes from thylakoid lipids.</a> Biophysical Journal. 66, 1404 (1994).</li><li>Hanke, W., Schlue, W. -. R., Sattelle, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+Lipid+Bilayers.+Methods+and+Applications.">Planar Lipid Bilayers. Methods and Applications.</a> Biological Techniques. , 133 (1993).</li><li>Tien, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bilayer lipid membranes (BLM). Theory and Practice. , 655-65 (1974).</li><li>Pagano, R. E., Ruysschaert, J. M., Miller, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+composition+of+some+lipid+bilayer+membranes+in+aqueous+solution.">The molecular composition of some lipid bilayer membranes in aqueous solution.</a> The Journal of Membrane Biology. 10, 11 (1972).</li><li>Henn, F. A., Thompson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+lipid+bilayer+membranes+separating+two+aqueous+phases:+composition+studies.">Properties of lipid bilayer membranes separating two aqueous phases: composition studies.</a> Journal of Molecular Biology. 31, 227 (1968).</li><li>Tao, X., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+Kv1.2+and+paddle+chimera+Kv+channels+in+planar+lipid+bilayers.">Functional analysis of Kv1.2 and paddle chimera Kv channels in planar lipid bilayers.</a> J. Mol. Biol. 382, 24 (2008).</li><li>Cohen, F. S., Akabas, M. H., Zimmerberg, J., Finkelstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parameters+affecting+the+fusion+of+unilamellar+phospholipid+vesicles+with+planar+bilayer+membranes.">Parameters affecting the fusion of unilamellar phospholipid vesicles with planar bilayer membranes.</a> The Journal of Cell Biology. 98, 1054 (1984).</li><li>Smith, G. P., Petrenko, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+Display.">Phage Display.</a> Chem. Rev. 97, 391-39 (1997).</li><li>McGuire, M. J., Li, S., Brown, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biopanning+of+phage+displayed+peptide+libraries+for+the+isolation+of+cell-specific+ligands.">Biopanning of phage displayed peptide libraries for the isolation of cell-specific ligands.</a> Methods Mol. Biol. 504, 291 (2009).</li><li>Rigaud, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins:+functional+and+structural+studies+using+reconstituted+proteoliposomes+and+2-D+crystals.">Membrane proteins: functional and structural studies using reconstituted proteoliposomes and 2-D crystals.</a> Braz. J. Med. Biol. Res. 35, 753 (2002).</li><li>Chami, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+octyl+beta-thioglucopyranoside+in+two-dimensional+crystallization+of+membrane+proteins.">Use of octyl beta-thioglucopyranoside in two-dimensional crystallization of membrane proteins.</a> J. Struct. Biol. 133, 64 (2001).</li><li>Kuhlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+crystallization+of+membrane+proteins.">Two-dimensional crystallization of membrane proteins.</a> Q. Rev. Biophys. 25, 1 (1992).</li><li>Rigaud, J. L., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes.">Reconstitution of membrane proteins into liposomes.</a> Methods Enzymol. 372, 65 (2003).</li><li>Walz, T., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Crystallography+of+Two-Dimensional+Crystals+of+Membrane+Proteins.">Electron Crystallography of Two-Dimensional Crystals of Membrane Proteins.</a> J. Struct. Biol. 121 (2), 142 (1998).</li><li>Signorell, G. A., Kaufmann, T. C., Kukulski, W., Engel, A., Remigy, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+2D+crystallization+of+membrane+proteins+using+methyl-beta-cyclodextrin.">Controlled 2D crystallization of membrane proteins using methyl-beta-cyclodextrin.</a> J. Struct. Biol. 157, 321 (2007).</li><li>Vink, M., Derr, K., Love, J., Stokes, D. L., Ubarretxena-Belandia, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+strategy+to+screen+2D+crystallization+trials+of+membrane+proteins.">A high-throughput strategy to screen 2D crystallization trials of membrane proteins.</a> J. Struct. Biol. 160, 295 (2007).</li><li>Iacovache, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2DX+robot:+a+membrane+protein+2D+crystallization+Swiss+Army+knife.">The 2DX robot: a membrane protein 2D crystallization Swiss Army knife.</a> J. Struct. Biol. 169, 370 (2010).</li></ol>

अलग झिल्ली में KvAP चैनलों के पुनर्गठन के कई अध्ययनों से 8-10 में इस्तेमाल किया गया है. डिटर्जेंट / लिपिड मिश्रित मिसेलस और प्रोटीन / डिटर्जेंट / लिपिड मिश्रित मिसेलस बीच लिपिड का वितरण सुनिश्चित करने के ...

प्रकोष्ठों विनिमय सामग्री और विशिष्ट झिल्ली प्रोटीन 1 के कार्यों के माध्यम से अपने पर्यावरण के साथ जानकारी. कोशिका झिल्ली में झिल्ली प्रोटीन पंप, चैनल, रिसेप्टर्स, intramembrane एंजाइमों, linkers और झिल्ली में संरचनात्मक समर्थकों के रूप में कार्य करते हैं. झिल्ली प्रोटीन प्रभावित म्यूटेशनों कि कई मानव रोगों से संबंधित कर दिया गया है. वे महत्वपूर्ण और कोशिका झिल्लियों में आसानी से उपलब्ध हैं क्योंकि वास्तव में, कई झिल्ली प्रोटीन प्राथमिक दवा लक्ष्य दिया गया है. यह झिल्ली में विभिन्न झिल्ली प्रोटीन की संरचना और समारोह को समझते हैं, और यह संभव मानव रोगों में उत्परिवर्ती प्रोटीन से हानिकारक प्रभाव को कम करने के तरीकों उपन्यास वसीयत करने के लिए बनाने के लिए इसलिए बहुत महत्वपूर्ण है. लिपिड bilayers 2, 3 में एकीकृत सभी झिल्ली प्रोटीन के चारों ओर. यूकेरियोटिक झिल्ली में, लिपिड के विभिन्न विभिन्न प्रकार microdomains 4, 5 में संगठित होने के लिए जाना जाता है.कई झिल्ली प्रोटीन इन microdomains के साथ ही झिल्ली 3, 6 की भारी तरल पदार्थ चरण के बीच वितरित किया जाना दिखाया गया. microdomains और झिल्ली प्रोटीन का वितरण उन में और इस तरह के वितरण के शारीरिक महत्व के संगठन अंतर्निहित तंत्र स्पष्ट रूप से महत्वपूर्ण हैं, लेकिन खराब समझ रहते हैं. झिल्ली प्रोटीन पर लिपिड प्रभाव का अध्ययन करने में एक प्रमुख तकनीकी कठिनाई लगभग सभी पुनर्गठन प्रोटीन कार्यात्मक 7 रहे हैं कि इतना biochemically अच्छी तरह से नियंत्रित लिपिड रचना की झिल्ली में झिल्ली प्रोटीन शुद्ध विश्वसनीय पुनर्गठन है. पिछले कुछ वर्षों में, हम पुनर्गठित करने के लिए ए से प्रोटोटाइप वोल्टेज gated पोटेशियम चैनल तरीके विकसित संरचनात्मक और कार्यात्मक अध्ययन 8-10 के लिए विभिन्न झिल्ली सिस्टम में Pernix (KvAP). दूसरों से डेटा और हमें एक साथ लिपिड संभावना वोल्टेज संवेदन के गठनात्मक परिवर्तन में एक निर्धारक हैं कि पता चलाएक वोल्टेज gated आयन चैनल और के डोमेन इन चैनलों के 11 में से कुछ के ढांचे को आकार कर सकते हैं. अगले में, हम हमारे तरीके का विस्तृत विवरण प्रदान करेगा और संभावना है कि हमारे परिणाम के सफल प्रजनन के साथ ही अन्य झिल्ली प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए हमारे तरीके का विस्तार सुनिश्चित करेंगे कि महत्वपूर्ण तकनीकी सुझावों की पेशकश करेगा.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tryptone</td>
 <td>RPI Corp.</td>
 <td>T60060</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Yeast Extract</td>
 <td>RPI Corp.</td>
 <td>Y20020</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaCl</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>S271-3</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris Base</td>
 <td>RPI Corp.</td>
 <td>T60040</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium Chloride</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP366-500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>n-Dodecyl-&beta;-D-Maltoside</td>
 <td>Affymetrix</td>
 <td>D322S</td>
 <td>Sol-grade</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>n-Octyl-&beta;-D-Glucoside </td>
 <td>Affymetrix</td>
 <td>O311</td>
 <td>Ana-grade</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Aprotinin</td>
 <td>RPI Corp.</td>
 <td>A20550-0.05</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Leupeptin</td>
 <td>RPI Corp.</td>
 <td>L22035-0.025</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pepstatin A</td>
 <td>RPI Corp.</td>
 <td>P30100-0.025</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PMSF</td>
 <td>SIGMA</td>
 <td>P7626</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dnase I</td>
 <td>Roche</td>
 <td>13407000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bio-Bead SM-2</td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>152-3920</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>RPI Corp.</td>
 <td>H75030</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>POPE</td>
 <td>Avanti Polar Lipids</td>
 <td>850757C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>POPG</td>
 <td>Avanti Polar Lipids</td>
 <td>840457C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DOGS</td>
 <td>Avanti Polar Lipids</td>
 <td>870314C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMPC </td>
 <td>Avanti Polar Lipids</td>
 <td>850345C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Biotin-DOPE </td>
 <td>Avanti Polar Lipids</td>
 <td>870282C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DOTAP</td>
 <td>Avanti Polar Lipids</td>
 <td>890890C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NeutrAvidin agarose beads </td>
 <td>Piercenet</td>
 <td>29200</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dialysis Tubing</td>
 <td>Spectrum Laboratories, Inc</td>
 <td>132-570</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pentane</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>R399-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Decane</td>
 <td>TCI America</td>
 <td>D0011</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MTS-PEG5000</td>
 <td>Toronto Research Cemicals</td>
 <td>M266501</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

reconstitution of a kv channel into lipid membranes for structural and functional studies

एक reductionistic फैशन में लिपिड, प्रोटीन बातचीत का अध्ययन करने के लिए, यह अच्छी तरह से परिभाषित लिपिड रचना की झिल्ली में झिल्ली प्रोटीन को शामिल करने के लिए आवश्यक है. हम एक प्रोटोटाइप वोल्टेज gated पोटेशियम (केवी) चैनल में लिपिड निर्भर gating के प्रभावों का अध्ययन कर रहे हैं, और विभिन्न झिल्ली सिस्टम में पुनर्गठित चैनलों के लिए विस्तृत प्रक्रियाओं बाहर काम किया है. हमारी पुनर्गठन प्रक्रियाओं डिटर्जेंट प्रेरित पुटिका के विलय और प्रोटीन / डिटर्जेंट लिपिड / डिटर्जेंट मिश्रित मिसेलस साथ मिसेलस के साथ ही प्रोटीन / डिटर्जेंट / लिपिड और डिटर्जेंट में लिपिड का एक संतुलन वितरण तक पहुँचने के महत्व के विलय दोनों का ध्यान रखना / लिपिड मिश्रित मिसेलस. हमारे डेटा लिपिड vesicles में चैनलों की प्रविष्टि झुकाव में अपेक्षाकृत यादृच्छिक सुझाव दिया है कि, और पुनर्गठन दक्षता कोई detectable प्रोटीन समुच्चय fractionation के प्रयोगों में देखा गया है कि इतनी अधिक है. हम पुनर्गठन का उपयोग किया हैअलग लिपिड में चैनलों के गठनात्मक राज्यों निर्धारित करने के लिए घ चैनलों, तलीय लिपिड bilayers में शामिल चैनलों की एक छोटी संख्या, एक फेज प्रदर्शित पेप्टाइड पुस्तकालय से रचना विशिष्ट ligands के लिए स्क्रीन के बिजली गतिविधियों को रिकॉर्ड, और 2 डी क्रिस्टल के विकास का समर्थन झिल्ली में चैनलों की. यहाँ वर्णित पुनर्गठन प्रक्रियाओं खासकर यूकेरियोटिक वोल्टेज gated आयन चैनल पर लिपिड प्रभाव की जांच के लिए, लिपिड bilayers में अन्य झिल्ली प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.

जैव रासायनिक एकरूपता में KvAP चैनल सफ़ाई के लिए प्रयोगों का सामान्य प्रवाह चित्रा 1 ए में वर्णित है. प्रोटीन की अभिव्यक्ति और शोधन के दौरान विशिष्ट नमूने चित्रा 1 बी में एसडीएस पृष्ठ जेल में प?...

Watch this Scientific Journal Video about Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies at JoVE.com

Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies

लिपिड झिल्ली में एक प्रोटोटाइप वोल्टेज gated पोटेशियम चैनल की पूरी पुनर्गठन के लिए प्रक्रिया वर्णित हैं. पुनर्गठन चैनलों जैव रासायनिक assays, बिजली रिकॉर्डिंग, ligand के स्क्रीनिंग और इलेक्ट्रॉन crystallographic पढ़ाई के लिए उपयुक्त हैं. इन विधियों अन्य झिल्ली प्रोटीन के संरचनात्मक और कार्यात्मक अध्ययन करने के लिए सामान्य आवेदन कर सकते हैं.

संरचनात्मक और कार्यात्मक अध्ययन के लिए लिपिड झिल्ली में एक केवी चैनल का पुनर्गठन

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined ...

Research

JoVE Journal

Biology

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

संरचना lipídic Mesophases का उपयोग कर निर्धारण के लिए झिल्ली प्रोटीन crystallizing

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography

स्ट्रक्चरल बायोलॉजी के अध्ययन के लिए इलेक्ट्रॉन क्रि द्वारा लघु झिल्ली प्रोटीन के दो आयामी Crystallization परीक्षण मूल्यांकन

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

Mutagenesis और आयन चैनल के कार्यात्मक विश्लेषण Heterologously स्तनधारी कोशिकाओं में व्यक्त

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses

अनुवाद कार्यात्मक और स्ट्रक्चरल विश्लेषण Peptidyl tRNAs युक्त Ribosomes के अलगाव

Recently, structural and biochemical studies have detailed many of the molecular events that occur in the ribosome during inhibition of protein synthesis ...

A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles

Nanodisc लिपिड कणों में एक एबीसी ट्रांसपोर्टर के पुनर्गठन के लिए एक विधि कदम दर कदम

The nanodisc is a discoidal particle (~ 10-12 nm large) that trap membrane proteins into a small patch of phospholipid bilayer. The nanodisc is a ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Lipidic Mesophases में उच्च throughput झिल्ली प्रोटीन का Crystallization के लिए एक रोबोट का प्रयोग

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

झिल्ली macromolecular क्रिस्टलोग्राफी द्वारा संरचना निर्धारण के लिए lipidic Mesophases में बढ़ी प्रोटीन की कटाई और क्रायो ठंडा कण

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

और murine अलिंद और Ventricular cardiomyocytes में अलगाव केवी चैनल रिकॉर्डिंग

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

के कुशल उत्पादन और शोधन संयोजक Murine Kindlin -3 की biophysical अध्ययन के लिए कीट कोशिकाओं से

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

एक transmembrane प्रोटीन के पुनर्गठन, माइक्रोस्कोपी और पैच दबाना अध्ययन के लिए विशालकाय unilamellar vesicles में वोल्टेज-गेटेड आयन चैनल, KvAP,

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...