Name: reconstitution of a kv channel into lipid membranes for structural and functional studies
Uploaded: 2013-07-13T13:00:00
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Gli studi sulla KvAP nel Jiang laboratorio hanno ottenuto un aiuto significativo dal laboratorio del Dr. Roderick MacKinnon presso la Rockefeller University. Un ringraziamento particolare va al Dott. Kathlynn Brown e Michael McQuire per i loro consigli e aiuto sui nostri esperimenti fago schermo. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal NIH (GM088745 e GM093271 a Q-XJ) e AHA (12IRG9400019 a Q-XJ).

1. Espressione e purificazione di KvAP Canale (Figura 1) <ol><li> Preparazione lavoro - Giorno 0 <ol><li> Sciacquare i flaconi di vetro per la coltura batterica con acqua deionizzata (diH 2 O) e MilliQ H 2 O (MQH 2 O) per rimuovere tracce di detersivo da lavastoviglie generale. </li><li> Autoclave 1000 ml di mezzo LB in 2.8 L Erlenmeyer (totale due litri cultura come un esempio qui). Bassa durezza dell&#39;acqua è risultato essere importante per la coltura positiva dei batteri trasfor...

<ol>
	<li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Biology of the Cell. , (2007).</li><li>Lee, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+lipids+and+proteins+interact+in+a+membrane:+a+molecular+approach.">How lipids and proteins interact in a membrane: a molecular approach.</a> Mol. Biosyst. 1, 203 (2005).</li><li>Lee, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+lipids+affect+the+activities+of+integral+membrane+proteins.">How lipids affect the activities of integral membrane proteins.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1666, 62 (2004).</li><li>Anderson, R. 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X., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipids+and+the+origin+of+cationic+gating+charges+in+voltage+sensors.">Phospholipids and the origin of cationic gating charges in voltage sensors.</a> Nature. 444, 775 (2006).</li><li>Ruta, V., Jiang, Y., Lee, A., Chen, J., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+an+archaebacterial+voltage-dependent+K++channel.">Functional analysis of an archaebacterial voltage-dependent K+ channel.</a> Nature. 422, 180 (2003).</li><li>Jiang, Q. X., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+lipids+on+voltage-gated+ion+channels.">The influence of lipids on voltage-gated ion channels.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. , 3408884 (2012).</li><li>Artimo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ExPASy:+SIB+bioinformatics+resource+portal.">ExPASy: SIB bioinformatics resource portal.</a> Nucleic Acids Res. 40, W597 (2012).</li><li>Cladera, J., Rigaud, J. L., Villaverde, J., Dunach, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome+solubilization+and+membrane+protein+reconstitution+using+Chaps+and+Chapso.">Liposome solubilization and membrane protein reconstitution using Chaps and Chapso.</a> Eur. J. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+sarcoplasmic+reticulum+Ca(2+)-ATPase:+mechanisms+of+membrane+protein+insertion+into+liposomes+during+reconstitution+procedures+involving+the+use+of+detergents.">Reconstitution of the sarcoplasmic reticulum Ca(2+)-ATPase: mechanisms of membrane protein insertion into liposomes during reconstitution procedures involving the use of detergents.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1107, 283 (1992).</li><li>Cohen, F. S., Zimmerberg, J., Finkelstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+of+phospholipid+vesicles+with+planar+phospholipid+bilayer+membranes.+II.+Incorporation+of+a+vesicular+membrane+marker+into+the+planar+membrane.">Fusion of phospholipid vesicles with planar phospholipid bilayer membranes. II. Incorporation of a vesicular membrane marker into the planar membrane.</a> The Journal of General Physiology. 75, 251 (1980).</li><li>Fuks, B., Homble, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+and+electrical+properties+of+planar+lipid+membranes+from+thylakoid+lipids.">Permeability and electrical properties of planar lipid membranes from thylakoid lipids.</a> Biophysical Journal. 66, 1404 (1994).</li><li>Hanke, W., Schlue, W. -. R., Sattelle, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+Lipid+Bilayers.+Methods+and+Applications.">Planar Lipid Bilayers. Methods and Applications.</a> Biological Techniques. , 133 (1993).</li><li>Tien, H. 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H., Zimmerberg, J., Finkelstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parameters+affecting+the+fusion+of+unilamellar+phospholipid+vesicles+with+planar+bilayer+membranes.">Parameters affecting the fusion of unilamellar phospholipid vesicles with planar bilayer membranes.</a> The Journal of Cell Biology. 98, 1054 (1984).</li><li>Smith, G. P., Petrenko, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+Display.">Phage Display.</a> Chem. Rev. 97, 391-39 (1997).</li><li>McGuire, M. J., Li, S., Brown, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biopanning+of+phage+displayed+peptide+libraries+for+the+isolation+of+cell-specific+ligands.">Biopanning of phage displayed peptide libraries for the isolation of cell-specific ligands.</a> Methods Mol. Biol. 504, 291 (2009).</li><li>Rigaud, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins:+functional+and+structural+studies+using+reconstituted+proteoliposomes+and+2-D+crystals.">Membrane proteins: functional and structural studies using reconstituted proteoliposomes and 2-D crystals.</a> Braz. J. Med. Biol. 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L., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes.">Reconstitution of membrane proteins into liposomes.</a> Methods Enzymol. 372, 65 (2003).</li><li>Walz, T., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Crystallography+of+Two-Dimensional+Crystals+of+Membrane+Proteins.">Electron Crystallography of Two-Dimensional Crystals of Membrane Proteins.</a> J. Struct. Biol. 121 (2), 142 (1998).</li><li>Signorell, G. A., Kaufmann, T. C., Kukulski, W., Engel, A., Remigy, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+2D+crystallization+of+membrane+proteins+using+methyl-beta-cyclodextrin.">Controlled 2D crystallization of membrane proteins using methyl-beta-cyclodextrin.</a> J. Struct. Biol. 157, 321 (2007).</li><li>Vink, M., Derr, K., Love, J., Stokes, D. L., Ubarretxena-Belandia, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+strategy+to+screen+2D+crystallization+trials+of+membrane+proteins.">A high-throughput strategy to screen 2D crystallization trials of membrane proteins.</a> J. Struct. Biol. 160, 295 (2007).</li><li>Iacovache, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2DX+robot:+a+membrane+protein+2D+crystallization+Swiss+Army+knife.">The 2DX robot: a membrane protein 2D crystallization Swiss Army knife.</a> J. Struct. Biol. 169, 370 (2010).</li></ol>

La ricostituzione dei canali KvAP in diverse membrane è stata utilizzata in diversi studi 8-10. Seguendo l&#39;idea di garantire la distribuzione dei lipidi tra detergenti / lipide micelle miste e le proteine ​​/ detergente / lipide micelle miste, siamo in grado di raggiungere quasi completa ricostituzione del KvAP nelle membrane in molto differenti lipidi. Ogni canale KvAP tetramerica bisogno ~ 100 molecole lipidiche per coprire pienamente il suo dominio transmembrana. Il requisito essenziale è permett...

Celle scambiare materiali e informazioni con l&#39;ambiente attraverso le funzioni delle proteine ​​di membrana specifici 1. Le proteine ​​di membrana nelle membrane cellulari funzionano come pompe, canali, recettori, enzimi intramembrane, linker e sostenitori strutturali attraverso le membrane. Le mutazioni che influenzano le proteine ​​di membrana sono stati legati a molte malattie umane. Infatti, molte proteine ​​di membrana sono stati gli obiettivi farmacologici primari perché sono importanti e facilmente accessibili nelle membrane cellulari. È quindi molto importante per comprendere la struttura e funzione di varie proteine ​​di membrana nelle membrane, e consentire di escogitare nuovi metodi per alleviare gli effetti negativi delle proteine ​​mutanti in malattie umane. Lipidi circondano tutte le proteine ​​di membrana integrati in doppi strati 2, 3. In membrane eucariotiche, i vari tipi di lipidi sono noti come organizzato in microdomini 4, 5.Molte proteine ​​di membrana sono stati mostrati essere distribuite tra questi microdomini nonché la fase fluida ingombrante di membrane 3, 6. Il meccanismo alla base l&#39;organizzazione dei microdomini e la consegna di proteine ​​di membrana in loro e il significato fisiologico di tali distribuzioni sono chiaramente importanti, ma rimangono poco conosciute. Una delle principali difficoltà tecnica a studiare gli effetti dei lipidi sulle proteine ​​di membrana è la ricostituzione affidabile di biochimicamente purificata proteine ​​di membrana nelle membrane di composizione lipidica ben controllati in modo che quasi tutte le proteine ​​ricostituite sono funzionali 7. Negli ultimi anni, abbiamo sviluppato metodi per ricostituire il prototipo di canale del potassio voltaggio-dipendente da A. Pernix (KvAP) nei vari sistemi a membrana per gli studi 8-10 strutturali e funzionali. I dati da altri e noi insieme hanno mostrato che i lipidi sono probabili un determinante nei cambiamenti conformazionali del rilevamento della tensionedomini di un canale e ionici voltaggio-dipendenti possono modellare le strutture di alcuni di questi canali 11. Nel prossimo, ci fornirà una descrizione dettagliata dei nostri metodi e offrirà suggerimenti tecnici critici che probabilmente garantire il successo riproduttivo dei nostri risultati, nonché l&#39;estensione dei nostri metodi per gli studi di altre proteine ​​di membrana.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tryptone</td>
 <td>RPI Corp.</td>
 <td>T60060</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Yeast Extract</td>
 <td>RPI Corp.</td>
 <td>Y20020</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaCl</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>S271-3</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris Base</td>
 <td>RPI Corp.</td>
 <td>T60040</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium Chloride</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP366-500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>n-Dodecyl-&beta;-D-Maltoside</td>
 <td>Affymetrix</td>
 <td>D322S</td>
 <td>Sol-grade</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>n-Octyl-&beta;-D-Glucoside </td>
 <td>Affymetrix</td>
 <td>O311</td>
 <td>Ana-grade</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Aprotinin</td>
 <td>RPI Corp.</td>
 <td>A20550-0.05</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Leupeptin</td>
 <td>RPI Corp.</td>
 <td>L22035-0.025</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pepstatin A</td>
 <td>RPI Corp.</td>
 <td>P30100-0.025</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PMSF</td>
 <td>SIGMA</td>
 <td>P7626</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dnase I</td>
 <td>Roche</td>
 <td>13407000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bio-Bead SM-2</td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>152-3920</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>RPI Corp.</td>
 <td>H75030</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>POPE</td>
 <td>Avanti Polar Lipids</td>
 <td>850757C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>POPG</td>
 <td>Avanti Polar Lipids</td>
 <td>840457C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DOGS</td>
 <td>Avanti Polar Lipids</td>
 <td>870314C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMPC </td>
 <td>Avanti Polar Lipids</td>
 <td>850345C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Biotin-DOPE </td>
 <td>Avanti Polar Lipids</td>
 <td>870282C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DOTAP</td>
 <td>Avanti Polar Lipids</td>
 <td>890890C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NeutrAvidin agarose beads </td>
 <td>Piercenet</td>
 <td>29200</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dialysis Tubing</td>
 <td>Spectrum Laboratories, Inc</td>
 <td>132-570</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pentane</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>R399-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Decane</td>
 <td>TCI America</td>
 <td>D0011</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MTS-PEG5000</td>
 <td>Toronto Research Cemicals</td>
 <td>M266501</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

reconstitution of a kv channel into lipid membranes for structural and functional studies

Studiare l&#39;interazione proteina-lipide in modo riduttivo, è necessario incorporare le proteine ​​di membrana nelle membrane di composizione lipidica ben definita. Stiamo studiando gli effetti di gating lipidi-dipendenti in un potassio voltaggio-dipendenti (Kv) canale di prototipo, e abbiamo lavorato procedure dettagliate per ricostituire i canali in diversi sistemi a membrana. Nostre procedure ricostituzione tengono conto sia della fusione detergente indotta di vescicole e la fusione di proteina / detergente micelle con i lipidi / detergente micelle miste nonché l&#39;importanza di raggiungere una distribuzione di equilibrio di lipidi tra le proteine ​​/ detergente / lipidi e il detersivo / lipidi micelle miste. I nostri dati suggeriscono che l&#39;inserimento di canali nei vescicole lipidiche è relativamente casuale in orientamenti, e l&#39;efficienza di ricostituzione è così alto che non rilevabili aggregati proteici sono stati osservati in esperimenti di frazionamento. Abbiamo utilizzato il ricostituired canali per determinare gli stati conformazionali dei canali in differenti lipidi, registrare attività elettrica di un piccolo numero di canali incorporate in bistrati lipidici planari, schermo per ligandi conformazione-specifici da una libreria peptidica fago visualizzato, e sostenere la crescita dei cristalli 2D dei canali in membrane. Le procedure descritte qui di ricostituzione possono essere adeguati per lo studio di altre proteine ​​di membrana in doppi strati lipidici, in particolare per l&#39;indagine degli effetti dei lipidi sui canali ionici voltaggio-dipendenti eucariotiche.

Il flusso generale degli esperimenti per purificare il canale KvAP in omogeneità biochimica è descritto nella Figura 1A. Esempi tipici durante l&#39;espressione e la purificazione della proteina è mostrato nel gel SDS-PAGE in Figura 1B. La proteina dopo la purificazione IMAC è relativamente pura. La resa del canale KvAP è di circa 1,0 mg / Litro cultura. Solubilizzazione delle vescicole lipidiche con detergenti deve essere elaborato per ciascuna coppia ...

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Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies

Procedure per la ricostituzione completa di un canale del potassio voltaggio-dipendenti prototipo nelle membrane lipidiche sono descritti. I canali ricostituiti sono adatti per saggi biochimici, registrazioni elettriche, screening ligando e studi cristallografici di elettroni. Questi metodi possono avere applicazioni generali agli studi strutturali e funzionali di altre proteine ​​di membrana.

La ricostituzione di un canale Kv in membrane lipidiche per gli studi strutturali e funzionali

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined ...

Research

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