Name: reconstitution of a kv channel into lipid membranes for structural and functional studies
Uploaded: 2013-07-13T13:00:00
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江ラボでKvAPに関する研究ロックフェラー大学で博士ロデリック·マッキノンの研究室からの重要な助けを得ている。特別な感謝は彼らのアドバイスのために博士KathlynnブラウンとマイケルMcQuireに行くと我々のファージスクリーン実験に役立つ。この作品は、NIH（Q-XJにGM088745とGM093271）とAHA（Q-XJへ12IRG9400019）からの補助金によって支えられて。

1。発現とKvAPチャンネルの精製（図1） <ol><li>準備作業 - 0日目<ol><li>一般食器から洗剤の痕跡を除去するために脱イオン水（DIH 2 O）とミリQ H 2 O（MQH 2 O）で細菌培養用のガラスフラスコを洗浄します。 </li><li> 2.8 L三角フラスコ（ここでは例として、合計2リットルの文化）でオートクレーブ千ミリリットルのLB培地。水の硬度が低い形質転換された細菌の培養に成功?...

<ol>
	<li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Biology of the Cell. , (2007).</li><li>Lee, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+lipids+and+proteins+interact+in+a+membrane:+a+molecular+approach.">How lipids and proteins interact in a membrane: a molecular approach.</a> Mol. Biosyst. 1, 203 (2005).</li><li>Lee, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+lipids+affect+the+activities+of+integral+membrane+proteins.">How lipids affect the activities of integral membrane proteins.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1666, 62 (2004).</li><li>Anderson, R. 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X., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipids+and+the+origin+of+cationic+gating+charges+in+voltage+sensors.">Phospholipids and the origin of cationic gating charges in voltage sensors.</a> Nature. 444, 775 (2006).</li><li>Ruta, V., Jiang, Y., Lee, A., Chen, J., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+an+archaebacterial+voltage-dependent+K++channel.">Functional analysis of an archaebacterial voltage-dependent K+ channel.</a> Nature. 422, 180 (2003).</li><li>Jiang, Q. X., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+lipids+on+voltage-gated+ion+channels.">The influence of lipids on voltage-gated ion channels.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. , 3408884 (2012).</li><li>Artimo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ExPASy:+SIB+bioinformatics+resource+portal.">ExPASy: SIB bioinformatics resource portal.</a> Nucleic Acids Res. 40, W597 (2012).</li><li>Cladera, J., Rigaud, J. L., Villaverde, J., Dunach, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome+solubilization+and+membrane+protein+reconstitution+using+Chaps+and+Chapso.">Liposome solubilization and membrane protein reconstitution using Chaps and Chapso.</a> Eur. J. 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Incorporation of a vesicular membrane marker into the planar membrane.</a> The Journal of General Physiology. 75, 251 (1980).</li><li>Fuks, B., Homble, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+and+electrical+properties+of+planar+lipid+membranes+from+thylakoid+lipids.">Permeability and electrical properties of planar lipid membranes from thylakoid lipids.</a> Biophysical Journal. 66, 1404 (1994).</li><li>Hanke, W., Schlue, W. -. R., Sattelle, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+Lipid+Bilayers.+Methods+and+Applications.">Planar Lipid Bilayers. Methods and Applications.</a> Biological Techniques. , 133 (1993).</li><li>Tien, H. 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H., Zimmerberg, J., Finkelstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parameters+affecting+the+fusion+of+unilamellar+phospholipid+vesicles+with+planar+bilayer+membranes.">Parameters affecting the fusion of unilamellar phospholipid vesicles with planar bilayer membranes.</a> The Journal of Cell Biology. 98, 1054 (1984).</li><li>Smith, G. P., Petrenko, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+Display.">Phage Display.</a> Chem. Rev. 97, 391-39 (1997).</li><li>McGuire, M. J., Li, S., Brown, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biopanning+of+phage+displayed+peptide+libraries+for+the+isolation+of+cell-specific+ligands.">Biopanning of phage displayed peptide libraries for the isolation of cell-specific ligands.</a> Methods Mol. Biol. 504, 291 (2009).</li><li>Rigaud, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins:+functional+and+structural+studies+using+reconstituted+proteoliposomes+and+2-D+crystals.">Membrane proteins: functional and structural studies using reconstituted proteoliposomes and 2-D crystals.</a> Braz. J. Med. Biol. Res. 35, 753 (2002).</li><li>Chami, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+octyl+beta-thioglucopyranoside+in+two-dimensional+crystallization+of+membrane+proteins.">Use of octyl beta-thioglucopyranoside in two-dimensional crystallization of membrane proteins.</a> J. Struct. Biol. 133, 64 (2001).</li><li>Kuhlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+crystallization+of+membrane+proteins.">Two-dimensional crystallization of membrane proteins.</a> Q. Rev. Biophys. 25, 1 (1992).</li><li>Rigaud, J. L., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes.">Reconstitution of membrane proteins into liposomes.</a> Methods Enzymol. 372, 65 (2003).</li><li>Walz, T., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Crystallography+of+Two-Dimensional+Crystals+of+Membrane+Proteins.">Electron Crystallography of Two-Dimensional Crystals of Membrane Proteins.</a> J. Struct. Biol. 121 (2), 142 (1998).</li><li>Signorell, G. A., Kaufmann, T. C., Kukulski, W., Engel, A., Remigy, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+2D+crystallization+of+membrane+proteins+using+methyl-beta-cyclodextrin.">Controlled 2D crystallization of membrane proteins using methyl-beta-cyclodextrin.</a> J. Struct. Biol. 157, 321 (2007).</li><li>Vink, M., Derr, K., Love, J., Stokes, D. L., Ubarretxena-Belandia, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+strategy+to+screen+2D+crystallization+trials+of+membrane+proteins.">A high-throughput strategy to screen 2D crystallization trials of membrane proteins.</a> J. Struct. 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異なる膜にKvAPチャネルの再構成は、いくつかの研究8-10に使用されています。洗剤/脂質混合ミセル及びタンパク質/洗剤/脂質混合ミセル間での脂質の分布を確保するという考え方に続いて、我々は非常に異なる脂質からなる膜にKvAPのほぼ完全な再構成を達成することができる。各四量KvAPチャネルは完全にその膜貫通ドメインをカバーするために〜100脂質分子を必要とします。本質的?...

セル交換物質と特異的膜蛋白質1の機能を通じて環境との情報。細胞膜中の膜タンパク質は、ポンプチャネル、受容体、膜内酵素、リンカーおよび膜を横切って構造的支持として機能する。膜タンパク質に影響を与える突然変異は、多くのヒトの疾患に関連していた。それらは重要で細胞膜で容易にアクセス可能であるため、実際には、多くの膜タンパク質は、一次薬物標的であった。これは、膜に種々の膜タンパク質の構造と機能を理解することが非常に重要であり、それが可能にヒトの疾患において突然変異体タンパク質からの有害な影響を軽減する新規な方法を考案するにしている。 脂質二重層は、2、3に統合されたすべての膜タンパク質を取り囲む。真核生物の膜において、脂質の様々な異なるタイプのミクロドメイン4,5に編成されることが知られている。多くの膜タンパク質は、これらのマイクロドメインならびに膜3,6の嵩高流体相の間で分配されることが示された。マイクロドメインとそれらへの膜タンパク質の配信とそのような分布の生理的意義の組織化のメカニズムは明らかに重要ですが、よくわかっていないままです。膜タンパク質に脂質の影響を研究の1つの主要な技術的な難しさは、生化学的にほぼすべての再構成されたタンパク質は7官能であるように十分に制御された脂質組成物の膜に膜タンパク質を精製した信頼性の高い再構成である。過去数年間で、我々はAから再構成プロトタイプ電位依存性カリウムチャネルに方法を開発の構造的および機能的研究8-10のための様々な膜システムにペルニクス （KvAP）。他人からのデータと私たちは一緒に脂質がおそらく電圧センシングのコンホメーション変化における決定要因であることを示した電位依存性イオンチャンネルの領域と、これらのチャネル11の一部の構造を形作ることができる。次では、我々の方法の詳細な説明を提供します、おそらく我々の結果の成功の再現だけでなく、他の膜タンパク質の研究と我々の方法の延長を確保する重要な技術的なヒントを提供します。

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tryptone</td>
 <td>RPI Corp.</td>
 <td>T60060</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Yeast Extract</td>
 <td>RPI Corp.</td>
 <td>Y20020</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaCl</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>S271-3</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris Base</td>
 <td>RPI Corp.</td>
 <td>T60040</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium Chloride</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP366-500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>n-Dodecyl-&beta;-D-Maltoside</td>
 <td>Affymetrix</td>
 <td>D322S</td>
 <td>Sol-grade</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>n-Octyl-&beta;-D-Glucoside </td>
 <td>Affymetrix</td>
 <td>O311</td>
 <td>Ana-grade</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Aprotinin</td>
 <td>RPI Corp.</td>
 <td>A20550-0.05</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Leupeptin</td>
 <td>RPI Corp.</td>
 <td>L22035-0.025</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pepstatin A</td>
 <td>RPI Corp.</td>
 <td>P30100-0.025</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PMSF</td>
 <td>SIGMA</td>
 <td>P7626</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dnase I</td>
 <td>Roche</td>
 <td>13407000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bio-Bead SM-2</td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>152-3920</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>RPI Corp.</td>
 <td>H75030</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>POPE</td>
 <td>Avanti Polar Lipids</td>
 <td>850757C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>POPG</td>
 <td>Avanti Polar Lipids</td>
 <td>840457C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DOGS</td>
 <td>Avanti Polar Lipids</td>
 <td>870314C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMPC </td>
 <td>Avanti Polar Lipids</td>
 <td>850345C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Biotin-DOPE </td>
 <td>Avanti Polar Lipids</td>
 <td>870282C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DOTAP</td>
 <td>Avanti Polar Lipids</td>
 <td>890890C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NeutrAvidin agarose beads </td>
 <td>Piercenet</td>
 <td>29200</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dialysis Tubing</td>
 <td>Spectrum Laboratories, Inc</td>
 <td>132-570</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pentane</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>R399-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Decane</td>
 <td>TCI America</td>
 <td>D0011</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MTS-PEG5000</td>
 <td>Toronto Research Cemicals</td>
 <td>M266501</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

reconstitution of a kv channel into lipid membranes for structural and functional studies

還元主義様式で脂質 - タンパク質相互作用を研究するために、明確に定義された脂質組成物の膜に膜タンパク質を組み込むことが必要である。我々はプロトタイプ電位依存性カリウム（Kv値）チャネル内の脂質依存ゲーティングの効果を研究しているし、別の膜システムにチャネルが再構成する詳細な手順をしてきました。当社の再構成の手順は、洗剤によって誘発される小胞の融合及び脂質/洗剤混合ミセルと同様、タンパク質/洗剤/脂質と洗剤間脂質の平衡分布に達することの重要性を持つタンパク質/洗剤ミセルの融合両方の配慮を/脂質混合ミセル。我々のデータは、脂質小胞のチャネルの挿入方向で相対的にランダムであり、かつ再構成効率が検出可能なタンパク質凝集体を分別実験で見られなかったように高いことを示唆した。我々は再構成を利用してきた異なる脂質のチャネルのコンフォメーション状態を決定するために、dはチャネルは、平面脂質二重層に組み込まれたチャンネルの数が少ない、ファージディスプレイペプチドライブラリーからのコンフォメーション特異的リガンドをスクリーニングの電気的活動を記録し、二次元結晶の成長を支える膜のチャンネル。ここで説明した再構成手順は、特に真核生物の電位依存性イオンチャンネル上の脂質効果の調査のために、脂質二重層内の他の膜タンパク質を研究するために適合され得る。

生化学的に均質KvAPチャネルを浄化するための実験の一般的な流れは、 図1Aに記載されている。タンパク質の発現および精製の ​​間に、典型的な試料は、 図1BにおけるSDS-PAGEゲルに示す。 IMAC精製後のタンパク質は比較的純粋である。 KvAPチャンネルの収量は約1.0 mg / Lの文化です。 洗剤と脂質小胞の可溶化は、脂質対洗剤のペアごとに解決され?...

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Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies

脂質膜にプロトタイプ電位依存性カリウムチャネルの完全な再構成のための手順が説明されています。再構成されたチャネルは、生化学的アッセイ、電気録音、リガンドのスクリーニングおよび電子結晶学的研究に適している。これらの方法は、他の膜タンパク質の構造的および機能的研究の一般的なアプリケーションを有することができる。

構造と機能研究のための脂質膜へのKvチャネルの再構築

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined ...

Research

JoVE Journal

Biology

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

脂質中間相を用いた構造決定のための膜タンパク質の結晶化

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography

電子線結晶学による構造生物学研究用小型膜タンパク質の二次元結晶化トライアルの評価

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

異種哺乳動物細胞で発現したイオンチャネルの変異導入と機能解析

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses

機能と構造解析のためにペプチジル- tRNAを含む翻訳リボソームの分離

Recently, structural and biochemical studies have detailed many of the molecular events that occur in the ribosome during inhibition of protein synthesis ...

A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles

Nanodisc脂質粒子にABCトランスポーターの再構成のためのステップ·バイ·ステップ方式

The nanodisc is a discoidal particle (~ 10-12 nm large) that trap membrane proteins into a small patch of phospholipid bilayer. The nanodisc is a ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

脂質中間相における膜タンパク質のハイスループット結晶化のためのロボットの使用

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

高分子結晶学による構造決定のための脂質メソフェーズで栽培膜タンパク質の収穫とクライオ冷却結晶

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

マウス心房と心室の心筋細胞における分離とKvチャンネル録音

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

生物物理学研究のための昆虫細胞からの効率的な生産と組換えマウスKindlin-3の精製

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

膜貫通タンパク質の再構成、顕微鏡およびパッチクランプ研究のための巨大単膜小胞への電位依存性イオンチャネル、KvAP、

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...