Name: reconstitution of a kv channel into lipid membranes for structural and functional studies
Uploaded: 2013-07-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies at JoVE.com

Исследования по KvAP в Цзян лаборатории получили значительную помощь от лаборатории доктора Родерик МакКиннон автора в Университете Рокфеллера. Особая благодарность доктору Kathlynn Браун и Майкл McQuire за их советы и помощь в нашей фага экране экспериментов. Работа выполнена при поддержке грантов от NIH (GM088745 и GM093271 к Q-XJ) и AHA (12IRG9400019 к Q-XJ).

1. Экспрессия и очистка KvAP канала (рис. 1) <ol><li> Подготовительные работы - день 0 <ol><li> Промыть стекло колбы для бактериальной культуры деионизированной водой (DIH 2 O) и MilliQ Н 2 О (MQH 2 O), чтобы удалить следы моющего средства из общих мытья посуды. </li><li> Автоклав 1000 мл LB среды в 2,8 ...

<ol>
	<li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Biology of the Cell. , (2007).</li><li>Lee, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+lipids+and+proteins+interact+in+a+membrane:+a+molecular+approach.">How lipids and proteins interact in a membrane: a molecular approach.</a> Mol. Biosyst. 1, 203 (2005).</li><li>Lee, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+lipids+affect+the+activities+of+integral+membrane+proteins.">How lipids affect the activities of integral membrane proteins.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1666, 62 (2004).</li><li>Anderson, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+caveolae+membrane+system.">The caveolae membrane system.</a> Annu. Rev. Biochem. 67, 199 (1998).</li><li>Simons, K., Vaz, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+systems,+lipid+rafts,+and+cell+membranes.">Model systems, lipid rafts, and cell membranes.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 33, 269 (2004).</li><li>Edidin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+state+of+lipid+rafts:+from+model+membranes+to+cells.">The state of lipid rafts: from model membranes to cells.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 32, 257 (2003).</li><li>Kapoor, R., Kim, J. H., Ingolfson, H., Andersen, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Artificial+Bilayers+for+Electrophysiology+Experiments.">Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments.</a> J. Vis. Exp. (20), e1033 (2008).</li><li>Zheng, H., Liu, W., Anderson, L. Y., Jiang, Q. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-dependent+gating+of+a+voltage-gated+potassium+channel.">Lipid-dependent gating of a voltage-gated potassium channel.</a> Nat. Commun. 2, 250 (2011).</li><li>Schmidt, D., Jiang, Q. X., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipids+and+the+origin+of+cationic+gating+charges+in+voltage+sensors.">Phospholipids and the origin of cationic gating charges in voltage sensors.</a> Nature. 444, 775 (2006).</li><li>Ruta, V., Jiang, Y., Lee, A., Chen, J., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+an+archaebacterial+voltage-dependent+K++channel.">Functional analysis of an archaebacterial voltage-dependent K+ channel.</a> Nature. 422, 180 (2003).</li><li>Jiang, Q. X., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+lipids+on+voltage-gated+ion+channels.">The influence of lipids on voltage-gated ion channels.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. , 3408884 (2012).</li><li>Artimo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ExPASy:+SIB+bioinformatics+resource+portal.">ExPASy: SIB bioinformatics resource portal.</a> Nucleic Acids Res. 40, W597 (2012).</li><li>Cladera, J., Rigaud, J. L., Villaverde, J., Dunach, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome+solubilization+and+membrane+protein+reconstitution+using+Chaps+and+Chapso.">Liposome solubilization and membrane protein reconstitution using Chaps and Chapso.</a> Eur. J. Biochem. 243, 798 (1997).</li><li>Levy, D., Bluzat, A., Seigneuret, M., Rigaud, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+study+of+liposome+and+proteoliposome+reconstitution+involving+Bio-Bead-mediated+Triton+X-100+removal.">A systematic study of liposome and proteoliposome reconstitution involving Bio-Bead-mediated Triton X-100 removal.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1025, 179 (1990).</li><li>Young, H. S., Rigaud, J. L., Lacapere, J. J., Reddy, L. G., Stokes, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+tubular+crystals+by+reconstitution+of+detergent-solubilized+Ca2(+)-ATPase.">How to make tubular crystals by reconstitution of detergent-solubilized Ca2(+)-ATPase.</a> Biophys. J. 72, 2545 (1997).</li><li>Levy, D., Gulik, A., Bluzat, A., Rigaud, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+sarcoplasmic+reticulum+Ca(2+)-ATPase:+mechanisms+of+membrane+protein+insertion+into+liposomes+during+reconstitution+procedures+involving+the+use+of+detergents.">Reconstitution of the sarcoplasmic reticulum Ca(2+)-ATPase: mechanisms of membrane protein insertion into liposomes during reconstitution procedures involving the use of detergents.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1107, 283 (1992).</li><li>Cohen, F. S., Zimmerberg, J., Finkelstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+of+phospholipid+vesicles+with+planar+phospholipid+bilayer+membranes.+II.+Incorporation+of+a+vesicular+membrane+marker+into+the+planar+membrane.">Fusion of phospholipid vesicles with planar phospholipid bilayer membranes. II. Incorporation of a vesicular membrane marker into the planar membrane.</a> The Journal of General Physiology. 75, 251 (1980).</li><li>Fuks, B., Homble, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+and+electrical+properties+of+planar+lipid+membranes+from+thylakoid+lipids.">Permeability and electrical properties of planar lipid membranes from thylakoid lipids.</a> Biophysical Journal. 66, 1404 (1994).</li><li>Hanke, W., Schlue, W. -. R., Sattelle, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+Lipid+Bilayers.+Methods+and+Applications.">Planar Lipid Bilayers. Methods and Applications.</a> Biological Techniques. , 133 (1993).</li><li>Tien, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bilayer lipid membranes (BLM). Theory and Practice. , 655-65 (1974).</li><li>Pagano, R. E., Ruysschaert, J. M., Miller, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+composition+of+some+lipid+bilayer+membranes+in+aqueous+solution.">The molecular composition of some lipid bilayer membranes in aqueous solution.</a> The Journal of Membrane Biology. 10, 11 (1972).</li><li>Henn, F. A., Thompson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+lipid+bilayer+membranes+separating+two+aqueous+phases:+composition+studies.">Properties of lipid bilayer membranes separating two aqueous phases: composition studies.</a> Journal of Molecular Biology. 31, 227 (1968).</li><li>Tao, X., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+Kv1.2+and+paddle+chimera+Kv+channels+in+planar+lipid+bilayers.">Functional analysis of Kv1.2 and paddle chimera Kv channels in planar lipid bilayers.</a> J. Mol. Biol. 382, 24 (2008).</li><li>Cohen, F. S., Akabas, M. H., Zimmerberg, J., Finkelstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parameters+affecting+the+fusion+of+unilamellar+phospholipid+vesicles+with+planar+bilayer+membranes.">Parameters affecting the fusion of unilamellar phospholipid vesicles with planar bilayer membranes.</a> The Journal of Cell Biology. 98, 1054 (1984).</li><li>Smith, G. P., Petrenko, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+Display.">Phage Display.</a> Chem. Rev. 97, 391-39 (1997).</li><li>McGuire, M. J., Li, S., Brown, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biopanning+of+phage+displayed+peptide+libraries+for+the+isolation+of+cell-specific+ligands.">Biopanning of phage displayed peptide libraries for the isolation of cell-specific ligands.</a> Methods Mol. Biol. 504, 291 (2009).</li><li>Rigaud, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins:+functional+and+structural+studies+using+reconstituted+proteoliposomes+and+2-D+crystals.">Membrane proteins: functional and structural studies using reconstituted proteoliposomes and 2-D crystals.</a> Braz. J. Med. Biol. Res. 35, 753 (2002).</li><li>Chami, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+octyl+beta-thioglucopyranoside+in+two-dimensional+crystallization+of+membrane+proteins.">Use of octyl beta-thioglucopyranoside in two-dimensional crystallization of membrane proteins.</a> J. Struct. Biol. 133, 64 (2001).</li><li>Kuhlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+crystallization+of+membrane+proteins.">Two-dimensional crystallization of membrane proteins.</a> Q. Rev. Biophys. 25, 1 (1992).</li><li>Rigaud, J. L., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes.">Reconstitution of membrane proteins into liposomes.</a> Methods Enzymol. 372, 65 (2003).</li><li>Walz, T., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Crystallography+of+Two-Dimensional+Crystals+of+Membrane+Proteins.">Electron Crystallography of Two-Dimensional Crystals of Membrane Proteins.</a> J. Struct. Biol. 121 (2), 142 (1998).</li><li>Signorell, G. A., Kaufmann, T. C., Kukulski, W., Engel, A., Remigy, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+2D+crystallization+of+membrane+proteins+using+methyl-beta-cyclodextrin.">Controlled 2D crystallization of membrane proteins using methyl-beta-cyclodextrin.</a> J. Struct. Biol. 157, 321 (2007).</li><li>Vink, M., Derr, K., Love, J., Stokes, D. L., Ubarretxena-Belandia, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+strategy+to+screen+2D+crystallization+trials+of+membrane+proteins.">A high-throughput strategy to screen 2D crystallization trials of membrane proteins.</a> J. Struct. Biol. 160, 295 (2007).</li><li>Iacovache, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2DX+robot:+a+membrane+protein+2D+crystallization+Swiss+Army+knife.">The 2DX robot: a membrane protein 2D crystallization Swiss Army knife.</a> J. Struct. Biol. 169, 370 (2010).</li></ol>

Восстановление KvAP каналов в различных мембран был использован в нескольких исследованиях 8-10. Следуя идее обеспечения распределение липидов между моющего средства / смешанные мицеллы липидов и белков / моющее средство / липидного смешанные мицеллы, мы способны достичь почти полн...

Клетки обмена материалами и информацией с окружающей средой через функции специфических белков мембраны 1. Мембранные белки в клеточных мембранах функционировать как насосы, каналы, рецепторы, ферменты внутримембранных, линкеры и структурные сторонников через мембраны. Мутации, которые влияют на мембранные белки были связаны со многими заболеваниями человека. В самом деле, многие мембранные белки были основными целями наркотиков, потому что они важны и легко доступны в клеточных мембранах. Поэтому очень важно понимать структуру и функцию различных мембранных белков в мембранах, и делают возможным разработать новые методы, чтобы облегчить вредных эффектов от мутантных белков в человеческих болезней. Липиды окружают все мембранные белки интегрированы в 2 бислоя, 3. В эукариотических мембраны, различные типы липидов, как известно, организованных в микродоменов 4, 5.Многие мембранные белки, как было показано, распределяется между этими микродоменов а также громоздкие жидкой фазы мембран 3, 6. Механизм, лежащий организации микродоменов и поставка мембранных белков в них и физиологическое значение таких распределений явно важна, но остаются плохо изученными. Одним из основных технических трудностей в изучении влияния на липидный мембранных белков является надежным восстановления биохимически очищенных мембранных белков в мембраны хорошо контролируемых липидный состав, так что почти все восстановленные белки являются функциональными 7. В последние несколько лет, мы разработали методы для восстановления прототипа напряжения закрытого канала калия из A. Pernix (KvAP) в различные мембранные системы для структурных и функциональных исследований 8-10. Данные от других и нас вместе показали, что липиды, вероятно определителя в конформационные изменения напряжения зондированиядоменами напряжения закрытого ионных каналов и может формировать структуры некоторых из этих каналов 11. В следующем, мы предоставим подробное описание наших методов и предложит важные технические советы, которые, скорее всего, обеспечить успешное воспроизводство наших результатах, а также расширение наших методов в исследованиях других мембранных белков.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tryptone</td>
 <td>RPI Corp.</td>
 <td>T60060</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Yeast Extract</td>
 <td>RPI Corp.</td>
 <td>Y20020</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaCl</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>S271-3</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris Base</td>
 <td>RPI Corp.</td>
 <td>T60040</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium Chloride</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP366-500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>n-Dodecyl-&beta;-D-Maltoside</td>
 <td>Affymetrix</td>
 <td>D322S</td>
 <td>Sol-grade</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>n-Octyl-&beta;-D-Glucoside </td>
 <td>Affymetrix</td>
 <td>O311</td>
 <td>Ana-grade</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Aprotinin</td>
 <td>RPI Corp.</td>
 <td>A20550-0.05</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Leupeptin</td>
 <td>RPI Corp.</td>
 <td>L22035-0.025</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pepstatin A</td>
 <td>RPI Corp.</td>
 <td>P30100-0.025</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PMSF</td>
 <td>SIGMA</td>
 <td>P7626</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dnase I</td>
 <td>Roche</td>
 <td>13407000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bio-Bead SM-2</td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>152-3920</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>RPI Corp.</td>
 <td>H75030</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>POPE</td>
 <td>Avanti Polar Lipids</td>
 <td>850757C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>POPG</td>
 <td>Avanti Polar Lipids</td>
 <td>840457C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DOGS</td>
 <td>Avanti Polar Lipids</td>
 <td>870314C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMPC </td>
 <td>Avanti Polar Lipids</td>
 <td>850345C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Biotin-DOPE </td>
 <td>Avanti Polar Lipids</td>
 <td>870282C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DOTAP</td>
 <td>Avanti Polar Lipids</td>
 <td>890890C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NeutrAvidin agarose beads </td>
 <td>Piercenet</td>
 <td>29200</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dialysis Tubing</td>
 <td>Spectrum Laboratories, Inc</td>
 <td>132-570</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pentane</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>R399-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Decane</td>
 <td>TCI America</td>
 <td>D0011</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MTS-PEG5000</td>
 <td>Toronto Research Cemicals</td>
 <td>M266501</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

reconstitution of a kv channel into lipid membranes for structural and functional studies

Для изучения липид-белковых взаимодействий в редукционистский моды, необходимо включить мембранных белков в мембранах четко определенных липидной композиции. Мы изучаем липидов зависит эффект стробирования в прототипе напряжения закрытого калия (кВ) канал и разработали подробные процедуры для восстановления каналов в различных системах мембраны. Наши процедуры восстановления принимать рассмотрение как моющее средство индуцированного слияния пузырьков и слитый белок / детергент мицеллы с липидной / детергент смешанные мицеллы, а также важность достижения равновесного распределения липидов у белка / детергент / липид и моющего средства / липид смешанные мицеллы. Наши данные свидетельствуют о том, что введение каналов в липидных везикул относительно случайной ориентации, а также восстановление эффективность настолько высока, что нет обнаруживаемых совокупностей белка были замечены в фракционирование экспериментов. Мы использовали восстановитьд каналов для определения конформационных состояний каналов в различных липидов записи электрических деятельности небольшим количеством каналов включены в плоских липидных бислоев, экран конформационно-специфических лигандов из пептидных фаговых дисплеев, библиотеку и поддерживать рост кристаллов 2D каналов в мембранах. Восстановление процедуры, описанные здесь, могут быть адаптированы для изучения других мембранных белков в липидных двойных слоев, особенно для исследования липидов действие на эукариотические напряжения закрытого ионных каналов.

Общий поток экспериментов для очистки KvAP канал в биохимические однородность описано на фиг.1А. Типичные образцы во время экспрессии и очистки белка показаны в ДСН-ПААГ-гель в фиг.1В. Белка после очистки IMAC является относительно чистым. Выход канала KvAP составляет приме?...

Watch this Scientific Journal Video about Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies at JoVE.com

Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies

Процедуры для полного восстановления прототип напряжения закрытого калиевых каналов в липидных мембран описаны. Восстановленные каналы подходят для биохимических анализов, электрические записи, лиганд скрининга и электронно исследования кристаллографических. Эти методы могут иметь общего применения в структурных и функциональных исследований других мембранных белков.

Восстановление Kv канала в липидные мембраны для Структурно-функциональные исследования

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined ...

Research

JoVE Journal

Biology

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

Кристаллизующихся мембранных белков для определения структуры использования липидный Мезофазы

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography

Оценка Двумерные Кристаллизация Испытания малых мембранных белков для структурных исследований биологии электронным кристаллографии

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

Мутагенеза и функционального анализа ионных каналов Heterologously Выраженный в клетках млекопитающих

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses

Выделение Перевод Рибосомы содержащих пептидил-тРНК на функциональные и структурные анализы

Recently, structural and biochemical studies have detailed many of the molecular events that occur in the ribosome during inhibition of protein synthesis ...

A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles

Шаг за шагом метод для разведения Transporter ABC в Nanodisc липидных частиц

The nanodisc is a discoidal particle (~ 10-12 nm large) that trap membrane proteins into a small patch of phospholipid bilayer. The nanodisc is a ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Использование робота для высокой пропускной кристаллизации мембранных белков в липидный Мезофазы

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

Сбор и охлаждения Cryo-кристаллы мембранных белков Выращивается в липидный Мезофазы для определения структуры по кристаллографии макромолекул

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

Выделение и записи Kv канала в мышиной предсердий и желудочков кардиомиоцитов

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Эффективное производство и очистка рекомбинантного мышиного Kindlin-3 от клетках насекомых биофизической исследований

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Восстановление трансмембранный белок, напряжения закрытого ионного канала, KvAP, в гигантском однослойные везикулы для микроскопии и локальной фиксации исследований

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...