Name: adenoviral transduction of naive cd4 t cells to study treg differentiation
Uploaded: 2013-08-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation at JoVE.com

Forfatterne ønsker å takke Lirui Du for byggingen av pCAGAdDU vektor og Oliver Gorka for levering av fiksering protokollen.

En. Kloning av et gen av interesse inn i en post Vector <ol><li> Klon genet av interesse inn i en post vektor. PCR amplifikasjon av genet fulgt av butt-ende ligering inn i en topoisomerase-coupled vektor (f.eks pENTR / D-TOPO) eller restriksjonsenzym-mediert kloning kan anvendes for denne fremgangsmåte. </li></ol> 2. Overføre genet av interesse i pCAGAdDu Destinasjon Vector <ol><li> Overføre genet av interesse fra oppføringen vektor inn destinasjonen vektor av LR rekombinasjon <e...

<ol>
	<li>Lahl, K., Loddenkemper, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+depletion+of+Foxp3++regulatory+T+cells+induces+a+scurfy-like+disease.">Selective depletion of Foxp3+ regulatory T cells induces a scurfy-like disease.</a> The Journal of Experimental Medicine. 204 (1), 57-63 (2007).</li><li>Kretschmer, K., Apostolou, I., Hawiger, D., Khazaie, K., Nussenzweig, M. C., von Boehmer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducing+and+expanding+regulatory+T+cell+populations+by+foreign+antigen.">Inducing and expanding regulatory T cell populations by foreign antigen.</a> Nature Immunology. 6 (12), 1219-1227 (2005).</li><li>Zhang, X., Izikson, L., Liu, L., Weiner, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+CD25(+)CD4(+)+regulatory+T+cells+by+oral+antigen+administration.">Activation of CD25(+)CD4(+) regulatory T cells by oral antigen administration.</a> Journal of Immunology (Baltimore, Md). 167 (8), 4245-4253 (2001).</li><li>Josefowicz, S. Z., Niec, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrathymically+generated+regulatory+T+cells+control+mucosal+TH2+inflammation.">Extrathymically generated regulatory T cells control mucosal TH2 inflammation.</a> Nature. 482 (7385), 395-399 (2012).</li><li>Samstein, R. M., Josefowicz, S. Z., Arvey, A., Treuting, P. M., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrathymic+generation+of+regulatory+T+cells+in+placental+mammals+mitigates+maternal-fetal+conflict.">Extrathymic generation of regulatory T cells in placental mammals mitigates maternal-fetal conflict.</a> Cell. 150 (1), 29-38 (2012).</li><li>Laurence, A., Amarnath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT3+Transcription+Factor+Promotes+Instability+of+nTreg+Cells+and+Limits+Generation+of+iTreg+Cells+during+Acute+Murine+Graft-versus-Host+Disease.">STAT3 Transcription Factor Promotes Instability of nTreg Cells and Limits Generation of iTreg Cells during Acute Murine Graft-versus-Host Disease.</a> Immunity. 37 (2), 209-222 (2012).</li><li>Terabe, M., Berzofsky, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoregulatory+T+cells+in+tumor+immunity.">Immunoregulatory T cells in tumor immunity.</a> Current Opinion in Immunology. 16 (2), 157-162 (2004).</li><li>Li, X., Kostareli, E., Suffner, J., Garbi, N., H&#228;mmerling, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Treg+depletion+induces+T-cell+infiltration+and+rejection+of+large+tumors.">Efficient Treg depletion induces T-cell infiltration and rejection of large tumors.</a> European Journal of Immunology. 40 (12), 3325-3335 (2010).</li><li>Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxp3+programs+the+development+and+function+of+CD4+CD25++regulatory+T+cells.">Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells.</a> Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).</li><li>Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+regulatory+T+cell+development+by+the+transcription+factor+Foxp3.">Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3.</a> Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).</li><li>Chen, W., Jin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+Peripheral+CD4+CD25-+Naive+T+Cells+to+CD4+CD25++Regulatory+T+Cells+by+TGF-&#946;+Induction+of+Transcription+Factor+Foxp3.">Conversion of Peripheral CD4+CD25- Naive T Cells to CD4+CD25+ Regulatory T Cells by TGF-&#946; Induction of Transcription Factor Foxp3.</a> The Journal of Experimental Medicine. 198 (12), 1875-1886 (2003).</li><li>Xu, W., Lan, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+transfer+of+induced-treg+cells+effectively+attenuates+murine+airway+allergic+inflammation.">Adoptive transfer of induced-treg cells effectively attenuates murine airway allergic inflammation.</a> PloS ONE. 7 (7), e40314 (2012).</li><li>Circosta, P., Granziero, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+receptor+(TCR)+gene+transfer+with+lentiviral+vectors+allows+efficient+redirection+of+tumor+specificity+in+naive+and+memory+T+cells+without+prior+stimulation+of+endogenous+TCR.">T cell receptor (TCR) gene transfer with lentiviral vectors allows efficient redirection of tumor specificity in naive and memory T cells without prior stimulation of endogenous TCR.</a> Human Gene Therapy. 20 (12), 1576-1588 (2009).</li><li>Patel, C., Muthuswamy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency,+Site-specific+Transfection+of+Adherent+Cells+with+siRNA+Using+Microelectrode+Arrays+(MEA).">High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA).</a> J. Vis. Exp. (67), e4415 (2012).</li><li>Zhong, S., Malecek, K., Perez-Garcia, A., Krogsgaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+transduction+of+T-cell+receptors+in+mouse+T-cells.">Retroviral transduction of T-cell receptors in mouse T-cells.</a> J. Vis. Exp. (44), e2307 (2010).</li><li>Leon, R. P., Hedlund, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenoviral-mediated+gene+transfer+in+lymphocytes.">Adenoviral-mediated gene transfer in lymphocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (22), 13159-13164 (1998).</li><li>Wan, Y. Y., Leon, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+expression+of+the+coxsackie/adenovirus+receptor+enables+adenoviral-mediated+gene+delivery+in+naive+T+cells.">Transgenic expression of the coxsackie/adenovirus receptor enables adenoviral-mediated gene delivery in naive T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13784-13789 (2000).</li><li>Hurez, V., Dzialo-Hatton, R., Oliver, J., Matthews, R. J., Weaver, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+adenovirus-mediated+gene+transfer+into+primary+T+cells+and+thymocytes+in+a+new+coxsackie/adenovirus+receptor+transgenic+model.">Efficient adenovirus-mediated gene transfer into primary T cells and thymocytes in a new coxsackie/adenovirus receptor transgenic model.</a> BMC Immunology. 3, 4 (2002).</li><li>Eitelhuber, A. C., Warth, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dephosphorylation+of+Carma1+by+PP2A+negatively+regulates+T-cell+activation.">Dephosphorylation of Carma1 by PP2A negatively regulates T-cell activation.</a> The EMBO Journal. 30 (3), 594-605 (2011).</li><li>Glasmacher, E., Hoefig, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roquin+binds+inducible+costimulator+mRNA+and+effectors+of+mRNA+decay+to+induce+microRNA-independent+post-transcriptional+repression.">Roquin binds inducible costimulator mRNA and effectors of mRNA decay to induce microRNA-independent post-transcriptional repression.</a> Nature Immunology. 11 (8), 725-733 (2010).</li><li>Russell, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+adenovirus+and+its+vectors.">Update on adenovirus and its vectors.</a> The Journal of General Virology. 81 (Pt. 11), 2573-2604 (2000).</li><li>Graham, F. L., Smiley, J., Russell, W. C., Nairn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+a+Human+Cell+Line+Transformed+by+DNA+from+Human+Adenovirus+Type+5.">Characteristics of a Human Cell Line Transformed by DNA from Human Adenovirus Type 5.</a> Journal of General Virology. 36 (1), 59-72 (1977).</li><li>Landy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic,+structural,+and+regulatory+aspects+of+lambda+site-specific+recombination.">Dynamic, structural, and regulatory aspects of lambda site-specific recombination.</a> Annual Review of Biochemistry. 58, 913-949 (1989).</li><li>Bernard, P., Couturier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+killing+by+the+F+plasmid+CcdB+protein+involves+poisoning+of+DNA-topoisomerase+II+complexes.">Cell killing by the F plasmid CcdB protein involves poisoning of DNA-topoisomerase II complexes.</a> Journal of Molecular Biology. 226 (3), 735-745 (1992).</li><li>Thai, T. -. H., Calado, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+Germinal+Center+Response+by+MicroRNA-155.">Regulation of the Germinal Center Response by MicroRNA-155.</a> Science. 316 (5824), 604-608 (2007).</li><li>Rodriguez, A., Vigorito, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+bic/microRNA-155+for+Normal+Immune+Function.">Requirement of bic/microRNA-155 for Normal Immune Function.</a> Science. 316 (5824), 608-611 (2007).</li><li>Cobb, B. S., Hertweck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+Dicer+in+immune+regulation.">A role for Dicer in immune regulation.</a> The Journal of Experimental Medicine. 203 (11), 2519-2527 (2006).</li><li>Steiner, D. F., Thomas, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-29+Regulates+T-Box+Transcription+Factors+and+Interferon-&#947;+Production+in+Helper+T+Cells.">MicroRNA-29 Regulates T-Box Transcription Factors and Interferon-&#947; Production in Helper T Cells.</a> Immunity. , (2011).</li></ol>

Virus Generation og Titrering For optimal transfeksjon resultater, kvaliteten og mengden av lineær vektor vises viktigst. Vi observerte ikke negative effekter på primære lysate produksjon fra en innledende overvekst av kulturen siden infeksjonen vil raskt gå en gang effektiv virus produksjon skjer. Imidlertid kan virusproduksjon ved HEK293A celler bli påvirket av lange innstikk som reduserer effektiviteten. Noen åpne leserammene ble faktisk funnet å forstyrre virus produksjon. Disse vira...

Tregs er avgjørende for å opprettholde immunforsvaret toleranse og til å dempe skyter immunreaksjoner. Tregs undertrykke tilskuer T celle aktivering. Følgelig fører ablasjon av Tregs til dødelig autoimmunitet og selvødeleggelse drevet av aktiverte T-celler en. Tregs utvikles i thymus ved negativ seleksjon av CD4 positive enkelt-forløpere, men de kan også skille i periferien fra naive CD4 T-celler ved lav-dose antigen stimulering med suboptimal ko-stimulering 1,2. Thymisk Tregs synes å undertrykke vev autoimmunitet mot selv-antigener, mens perifer Tregs har vært innblandet i å gi toleranse i tarmen eller lunge. Disse induserte Tregs potente hindre T celle aktivering etter anerkjennelse av utenlandske antigener i slimhinnene, herunder miljømessige antigener fra mat og luft, commensal bakterier og allergener 3,4. I tillegg Tregs er avgjørende for å etablere mors toleranse for fosterets peptider 5 og å prelufthull graft-versus-host sykdom 6.. På samme tid, Tregs også mediere uønskede effekter ved å dempe immun overvåking av tumorceller 7,8. Kjennetegnet av Tregs er uttrykk for den delen-angivelse transkripsjonsfaktor foxp3, en gaffel-head domenenavn som inneholder transkripsjonsfaktor som er nødvendig og tilstrekkelig for å konferere Treg funksjon 9,10. Noen signalveier som kan indusere foxp3 uttrykk er kjent. Imidlertid er de molekylære prosesser som kontroll, regulere eller modulere Treg differensiering i respons til T-celle-reseptor utløsende mindre godt forstått. Tregs kan meget effektivt kan bli indusert in vitro gjennom stimulering av naive CD4 T-celler med anti-CD3 og anti-CD28-antistoffer i nærvær av TGFβ og IL-2 11. Som den nye Tregs er funksjonelle in vivo, manipulering av molekyler som fremmer Treg differensiering bærer et enormt potensial for fremtidig therapies, for eksempel, ved behandling av astma, Crohns sykdom, og transplantasjon 11,12. Motsatt kan terapeutisk modulering av molekyler til å blokkere Treg differensiering gi nytte i fremtidige tilnærminger av kombinert behandling av slike pasienter. In vitro differensiering assay har vært medvirkende til beskrivelsen av molekylære endringer som er forbundet med T-celle undersett differensiering. I øyeblikket, eksperimentelle forsøk på å søke eller skjerm for genprodukter som styrer T-celle differensiering er hemmet av det faktum at de vanligste metodene for ektopisk genuttrykk mislykkes i naive T-celler. For eksempel elektroporering og retroviral transduksjon er bare effektive i aktiverte T-celler. I motsetning til opprinnelige forventninger, lentiviral transduksjon, som vanligvis effektiv i hvilende celler, krever pre-aktivering av naive T-celler av cytokiner 13. Videre overføring av cDNA eller mRNA under elektroporeringinnebærer depolarisering av cellemembranen, som selv confers trekk ved T-celleaktivering, og kan til og med mobilisere Ca 2 + signalering og aktivere NFAT proteiner (upublisert observasjon og ref.. 14). Tilsvarende for retroviral transduksjon, naive T-celler har til å bli aktivert for 18 - 40 timer. I løpet av denne tid, forekommer nedbrytning av den nukleære membranen i løpet av celledeling og gjør det mulig for den etterfølgende genomisk integrering av den retrovirale vektoren 15.. Disse metoder er derfor ikke i stand til å ta opp den molekylære tidlig innledende regulering av T-celle møte med antigen, som er den avgjørende fase av hjelper T celle-differensiering. Adenoviral transduksjon er kjent for å gi forbigående ektopisk genekspresjon i en rekke humane celletyper som uttrykker human adenovirus Coxsackie-reseptor (CAR). Den fortsetter uten krav til celle aktivering eller celle-syklus progresjon. Overflaten uttrykk for CAR er en forutsetning for effektiv virus tilknytning og internalisering, og transgene ekspresjon av den avkortede versjon CARΔ1 under en T-celle-spesifikk promotor ble funnet å gjengi mus thymocytter og T-celler som er mottakelige for infeksjon adenoviral 16.. Viktigere, ikke transgene ikke endre thymocyte utvikling eller in vitro differensiering av naive CD4 T-celler i ulike undergrupper (data ikke vist, ref. 17.). Adenovirus-mediert transduksjon av T-celler ble tidligere brukt for overexpression 17,18 og knock-down tilnærming 19,20. De transgene T-celler kan bli renset fra kommersielt tilgjengelig DO11.10 tg; CARΔ1 tg (Taconic, Inc. og ref. 17..). Viktigste er at adenoviral transduction høyt uttrykk av et gen av interesse for naive T-celler uten å indusere tydelige tegn på aktivering. T-cellene er fortsatt naiv (CD44 lav, CD62L høy) og hvile (CD25 -, CD69 -) etter infectipå og kan aktiveres og differensiert i Treg lik ikke-infiserte celler. Produksjon av rekombinante adenovirus kan oppnås etter transfeksjon av celler med HEK293A adenovirale plasmider (Figur 1). Disse plasmider inneholder vanligvis den menneskelige type 5 adenovirus genom med E1 og E3 gener slettede å gjengi rekombinant adenovirus replikering-inkompetente 21. HEK293A celler utfylle replikering mangel som de har blitt udødeliggjort gjennom stabil integrering av skåret adenovirus 22. Siden adenovirus vektorer er store (~ 40 kb), og dermed ikke godt egnet for tradisjonell begrensning enzym-mediert kloning, brukte vi den Gateway-systemet. Genet av interesse blir først klonet inn i en mindre adgang vektor, hvorfra det lett kan overføres til det adenovirale vektor destinasjon via lambda rekombinasjon reaksjon (LR) 23. Vi konstruerte pCAGAdDu vektorved å kombinere CAG promoter (kylling aktin promoter og CMV forsterker) med et uttrykk kassett som inneholder LR nettsider flankerer prokaryote ccdB seleksjonsmarkør 24. Denne ekspresjonskassett er sammensmeltet til en intern ribosom inngang stedet (IRES) element som tillater coexpression av den eukaryote infeksjon markør forbedret grønt fluorescerende protein (eGFP), som er kondensert til en sekvens inneholdende det bovine veksthormon poly (A)-signal. Vi valgte CAG cis-regulatoriske sekvenser, ettersom prototypic CMV-promotor ble funnet å være svært aktiveringen-avhengige og derfor ugunstig for genekspresjon i naive T-celler. Her gir vi en protokoll for effektiv in vitro differensiering Treg og en fremgangsmåte for å transduce naive CD4 T-celler uten aktivering (figur 2). Metoden gjør det mulig ektopisk genekspresjon eller slå ned foregående CD4 T-celle differensiering på naive tilstand. Den lar teste effekten av en overexpressed gen av interesse i løpet av tidlig signalering hendelser ved første TCR stimulering til T-celle undergruppe engasjement. Våre validering eksperimenter også gi grunnlag for å etablere lignende adenovirus programmet i differensiering av andre T celle undergrupper som Th1, Th2, Th9, Th17, Th22, eller TFH celler.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENTR/D-TOPO Cloning Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K240020</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gateway LR Clonase II Enzyme mix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11791020</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PacI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R057S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>jetPEI</td>
			<td>Polyplus-transfection</td>
			<td>101-10N</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293A Cell Line</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R705-07</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A549</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-185</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353046</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 cm tissue culture dish</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>168381</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/cJ-Tg(DO11.10)10Dlo Tg(CAR&Delta;1)1Jdgr</td>
			<td>Taconic Farms</td>
			<td>Model Nr. 4285</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-094-131</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>41966-052</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>1502-P110704</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PenStrep</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-167F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaPyruvate</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE13-115E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA 100x</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE13-114E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer Solution (1 M)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15630-056</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&beta;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-7522</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Essential vitamin mixture (100x)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>13-607C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28 for Cell Expansion and Activation</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>114-56D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TGF-beta 1</td>
			<td>R&amp;D Systems</td>
			<td>240B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proleukin S (18 x 106IE)</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L-23105</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse BD Fc BlockT</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553141</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse/Rat Foxp3 PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-5773-82</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mmu-miR-155 TaqMan MicroRNA Assay</td>
			<td>Roche Applied Biosystems</td>
			<td>4427975</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 Probes Master</td>
			<td>Roche Applied Biosystems</td>
			<td>04902343001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Roche Applied Biosystems</td>
			<td>4366596</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adenoviral transduction of naive cd4 t cells to study treg differentiation

Regulatoriske T-celler (Tregs) er viktige for å gi immuntoleranse til selv så vel som til visse fremmede antigener. Tregs kan genereres fra naive CD4 T-celler in vitro med TCR-og ko-stimulering i nærvær av TGFβ og IL-2. Dette bærer et enormt potensial for fremtidige terapier, men molekylene og signalveier som styrer differensiering er i stor grad ukjent. Primær T-celler kan manipuleres gjennom svangerskap utenfor genekspresjon, men vanlige metoder ikke klarer å målrette den viktigste naiv tilstand av T-celle før primære antigen anerkjennelse. Her gir vi en protokoll for å uttrykke ektopisk gener for naive CD4 T-celler in vitro før indusere Treg differensiering. Det gjelder transduksjon med replikering-mangelfull adenovirus og forklarer sin generasjon og produksjon. Den adenovirus kan ta opp store innsatser (opptil 7 kb), og kan utstyres med arrangører for å oppnå høy og forbigående overexpression i T-celler. Det transduces effektivt naive mus T-celler hvis de uttrykker en transgen Coxsackie adenovirus reseptor (CAR). Viktigere, etter smitte T-cellene er fortsatt naiv (CD44 lav, CD62L høy) og hvile (CD25 -, CD69 -) og kan aktiveres og differensiert i Tregs lik ikke-infiserte celler. Dermed kan denne metoden manipulering av CD4 T-celle differensiering fra begynnelsen. Det sikrer at ektopisk genuttrykk er allerede på plass når tidlige signalering hendelsene i den første TCR stimulering induserer celleforandringer som til slutt fører til Treg differensiering.

Virus Produksjon For generering av høye virus titer, er tidspunktet for HEK293A celleinnhøstningsutstyr i primær virus produksjon eller virus forsterkning avgjørende. Representative fluorescerende og fase kontrast med visuelle tegn på virus produksjon er vist i figur 3.. Den CPE ble observert 10 dager etter transfeksjon av HEK293A celler med en kontroll pCAGAdDu vektor uten innsatsen. CPE er preget av utseendet på områder med forstørret og round-up celler som begynner ?...

Watch this Scientific Journal Video about Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation at JoVE.com

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

Adenoviral genoverføring inn naive CD4 T-celler med transgene uttrykk for Coxsackie adenovirus reseptoren gjør den molekylære analyser av regulatoriske T-celle differensiering<em&gt; In vitro</em&gt;.

Adenoviral Transduksjon av Naive CD4 T-celler for å studere Treg Differensiering

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

Akselerert Type 1 Diabetes Induksjon i Mus ved Adoptive Overføring av diabetogenic CD4 + T celler

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Isolation and Th17 Differentiation of Na&#239;ve CD4 T Lymphocytes

Isolasjon og Th17 Differensiering av naive CD4 T-lymfocytter

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

Transplantasjon av Tail Skin Study Cell Responses Allogen CD4 T i Mus

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induksjon av murine tarmbetennelse etter adoptiv overføring av Effector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Høy</sup&gt; T-celler i immundefekte mus

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mus naive CD4<sup&gt; +</sup&gt; T Cell Isolasjon og<em&gt; In vitro</em&gt; Differensiering i T cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

Retroviral Transduksjon av stamceller i benmarg for å generere T-celle reseptor Retrogenic Mus

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

Utarbeidelse av CD4<sup&gt; +</sup&gt; T celler for analyse av GD3 og GD2 Gangliosid Membran Expression ved mikroskopi

The methods described herein for activation of na&#239;ve CD4+ T cells in suspension and their adherence in coverslips for confocal microscopy analysis ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Retroviral Transduksjon T-hjelpeceller som genetisk tilnærming å studere mekanismer kontrollere sine Differensiering og funksjon

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...