Name: isolation of embryonic ventricular endothelial cells
Uploaded: 2013-07-20T14:00:00
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Gostaríamos de agradecer a Andrea Portbury para a leitura crítica do manuscrito, o Laboratório de Serviço Microscópio de UNC para a assistência com a imagem time-lapse, eo NIH (Grant # R01HL061656) para apoio financeiro.

1. Preparar anticorpos conjugados grânulos <ol><li> Um dia antes da dissecação, combinar o anticorpo de escolha com as Dynabeads apropriadas (por exemplo IgG de rato Dynabeads para um anticorpo criado em ratos, 4 x 10 8 contas / ml), segundo as instruções do fabricante. Para o rato anti-CD31 anticorpo BD (0,5 mg / mL, utilizados para isolar as células endoteliais), 3 ul de anticorpo é adicionado a cada 25 ul de pérolas, para uma concentração final de 1,5 ug de anticorpo anti-CD31 e 1 x 10...

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	<li>Landecker, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culturing Life: How Cells Became Technologies. , (2007).</li><li>Kan, C. Y., Wen, V. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+dysfunction+and+cytoskeletal+changes+associated+with+repression+of+p16(INK4a)+during+immortalization.">Endothelial cell dysfunction and cytoskeletal changes associated with repression of p16(INK4a) during immortalization.</a> Oncogene. , (2012).</li><li>Dyer, L. A., Patterson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+endothelium:+an+emphasis+on+heterogeneity.">Development of the endothelium: an emphasis on heterogeneity.</a> Semin. Thromb. Hemost. 36, 227-235 (2010).</li><li>Dong, Q. G., Bernasconi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+strategy+for+isolation+of+endothelial+cells+from+murine+tissues.+Characterization+of+two+endothelial+cell+lines+from+the+murine+lung+and+subcutaneous+sponge+implants.">A general strategy for isolation of endothelial cells from murine tissues. Characterization of two endothelial cell lines from the murine lung and subcutaneous sponge implants.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 17, 1599-1604 (1997).</li><li>van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+endothelial+cells+from+fresh+tissues.">Isolation of endothelial cells from fresh tissues.</a> Nat. Protoc. 3, 1085-1091 (2008).</li><li>Runyan, R. B., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+mesenchyme+into+three-dimensional+collagen+gels:+a+regional+and+temporal+analysis+of+interaction+in+embryonic+heart+tissue.">Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue.</a> Dev. Biol. 95, 108-114 (1983).</li><li>Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+angiogenesis:+endothelial+cell+tube+formation+on+gelled+basement+membrane+extract.">In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract.</a> Nat. Protoc. 5, 628-635 (2010).</li><li>Zeisberg, E. M., Potenta, S. E., Sugimoto, H., Zeisberg, M., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+in+kidney+fibrosis+emerge+via+endothelial-to-mesenchymal+transition.">Fibroblasts in kidney fibrosis emerge via endothelial-to-mesenchymal transition.</a> Journal of the American Society of Nephrology : JASN. 19, 2282-2287 (2008).</li><li>Chang, L., Noseda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+vascular+smooth+muscle+cells+from+local+precursors+during+embryonic+and+adult+arteriogenesis+requires+Notch+signaling.">Differentiation of vascular smooth muscle cells from local precursors during embryonic and adult arteriogenesis requires Notch signaling.</a> PNAS. 109, 5993-6998 (2012).</li><li>Fehrenbach, M. L., Cao, G., Williams, J. T., Finklestein, J. M., DeLisser, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+murine+lung+endothelial+cells.">Isolation of murine lung endothelial cells.</a> American Journal of Physiology: Lung Cellular and Molecular Physiology. 296, L1095-L1103 (2009).</li><li>Frauli, M., Ludwig, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+fibroblast+proliferation+in+a+culture+of+human+endometrial+stromal+cells+using+a+medium+containing+D-valine.">Inhibition of fibroblast proliferation in a culture of human endometrial stromal cells using a medium containing D-valine.</a> Archives of Gynecology and Obstetrics. , 241-96 (1987).</li><li>Lazzaro, V. A., Walker, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+fibroblast+proliferation+in+L-valine+reduced+selective+media.">Inhibition of fibroblast proliferation in L-valine reduced selective media.</a> Research communications in chemical pathology and pharmacology. 75, 39-48 (1992).</li><li>Arima, S., Nishiyama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenic+morphogenesis+driven+by+dynamic+and+heterogeneous+collective+endothelial+cell+movement.">Angiogenic morphogenesis driven by dynamic and heterogeneous collective endothelial cell movement.</a> Development. 138, 4763-4776 (2011).</li></ol>

Trabalhando com células embrionárias primárias permite novas experiências para abordar em passos críticos do desenvolvimento in vitro. No entanto, o procedimento de isolamento não é trivial. Passos críticos para o isolamento de qualquer tipo de células, nomeadamente, assegurar que as células são bem separados por digestão com colagenase e depois que eles são bem suspensa durante os passos de lavagem. Dissecção mecânica por pipetagem contribui grandemente separar as células durante a et...

O advento das linhas de células imortalizadas revolucionou a biologia das células de base 1. As linhas de células actualmente disponíveis são derivados de uma vasta gama de órgãos e abrangem todos os principais tipos de células. No entanto, as linhas celulares estabelecidas têm algumas limitações. O processo de imortalizao, obviamente, alterar o comportamento das células, especialmente no que diz respeito ao tempo de vida e a proliferação, mas também pode afectar a expressão de proteínas inesperadas, tais como as proteínas do citoesqueleto 2. Além disso, apesar de muitas linhas celulares diferentes estão disponíveis, existe uma diversidade significativa mesmo entre um único tipo de células dentro de um organismo inteiro. As células endoteliais em particular mostra diversos comportamentos com base em se elas linha de artérias ou veias e que tipo de fluxo está presente no recipiente 3. Ainda mais premente de uma perspectiva do desenvolvimento, no entanto, é que a maioria das linhas celulares disponíveis são derivados de tecidos de adulto (veja, por exemplo, tele coleção disponível via ATCC). Estas linhas de células adultas provavelmente não recapitular a natureza dinâmica dos seus precursores embrionários. As rápidas mudanças espaciotemporais padrões de expressão de genes durante o desenvolvimento, também observadas sugerem que uma célula endotelial de um órgão num determinado estágio de desenvolvimento pode não se comportam da mesma maneira como uma célula endotelial, a partir desse mesmo órgão, numa fase de desenvolvimento diferente. Como uma alternativa ao uso comercialmente disponíveis linhas celulares imortalizadas, as células primárias podem ser isoladas a partir do tecido de interesse específica. Entre as vantagens desta técnica, essas células primárias podem ser isolados a partir de um órgão específico ou mesmo parte de um órgão, em qualquer fase de desenvolvimento específico. Além disso, essas células primárias podem ser isolados a partir da grande variedade de animais transgénicos disponíveis, permitindo o estudo in vitro do gene knockout e knock-in, evitando outros problemas, tais como a eficiência da transfecção. Não surpreendentemente, muitostécnicas têm sido publicados detalhando como isolar tipos específicos de células a 4,5. Em geral, estas técnicas envolvem a recolha na região de interesse, a dissociação das células, de etiquetagem do tipo de célula específico de interesse, e isolando as células para análise posterior. Para estudar uma população embrionária das células endoteliais coronárias, que foi reduzida a 4 técnica previamente publicada para o uso com um órgão menor. Com este procedimento, em escala reduzida, pode-se isolar as células endoteliais coronárias do coração embrionário em estágios embrionários específicos. Estas células podem depois ser utilizados em ensaios endoteliais tradicionais, tais como análises de migração. Até linhagens de células embrionárias precoces tornam-se mais prevalente, trabalhando com as pilhas é uma técnica inestimável.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Timed-pregnant mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To be dissected at the embryonic stage of interest</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-mouse CD31</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553370</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Rat IgG Dynabeads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>110-35</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Collagen</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>PBS (1x)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Collagenase, type I</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Cellgro </td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich </td>
			<td>F2442 </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Endothelial cell growth medium</td>
			<td>(made in lab as described in notes)</td>
			<td></td>
			<td>DMEM containing 20% FBS, 5 &mu;M &beta;-mercaptoethanol, 50 &mu;g/ml ECG, and 1x penicillin/streptomycin</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>&beta;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>ECGS</td>
			<td>Biomedical Technologies, Inc.</td>
			<td>BT-203</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>384-well culture plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>T-3037-6</td>
			<td>Plate was prepared with a thin collagen gel, as described in 6; working surface area 10 mm2</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Collagen type I</td>
			<td>BD</td>
			<td>354236</td>
			<td>Use at a final concentration of 1.5 mg/ml</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>M199, 10x</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11825-015</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Syto-16</td>
			<td>Invitrogen </td>
			<td>S7578 </td>
			<td>Used as directed in 13 </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Stereoscopic microscope</td>
			<td>Nikon </td>
			<td>SMZ645</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>Thermo </td>
			<td>3110 </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DynaMag</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>123-21D</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Table-top centrifuge</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>75002430</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

isolation of embryonic ventricular endothelial cells

Cultura de células tem melhorado muito a nossa capacidade de avaliar populações individuais de células sob condições de cultura inumeráveis. Enquanto as linhas de células imortalizadas oferecem vantagens significativas para a sua facilidade de utilização, estas linhagens de células não estão disponíveis para todos os tipos de células potenciais. Ao isolar as células primárias a partir de uma região específica de interesse, particularmente a partir de um ratinho transgénico, os estudos mais matizadas podem ser executadas. A técnica básica envolve a dissecção do órgão ou órgãos parcial de interesse (por exemplo, do coração ou de uma região específica do coração) e dissociação do órgão para células individuais. Estas células são então incubadas com contas magnéticas conjugadas com um anticorpo que reconhece o tipo celular de interesse. As células de interesse pode então ser isolado, com a utilização de um íman, com uma curta incubação de tripsina dissociar as células dos grânulos. Estas células isoladas podem ser cultivadas e, em seguida, analisado como desejado. Esta técnica foi originalmente concebido para órgão do rato adultos, mas podem ser facilmente reduzidos para uso com os órgãos embrionários, como aqui demonstrado. Porque o nosso interesse é na vasculatura coronária em desenvolvimento, que queria estudar esta população de células em fases embrionárias específicas. Assim, o protocolo original teve de ser modificado para ser compatível com a pequena dimensão dos ventrículos embrionárias e o baixo rendimento potencial das células endoteliais para estas fases de desenvolvimento. Utilizando essa abordagem em escala reduzida, avaliamos coronária remodelação plexo nas células endoteliais ventriculares embrionárias transgênicos.

Usando um anticorpo específico para o endotélio, que reconhece CD31, as células endoteliais foram isolados a partir dos ventrículos embrionárias (E), 13,5 (Figura 1A) e 18.5 (Figuras 1B-1D) embriões. Quando cultivado em um prato de cultura não tratada, essas células permanecem arredondado e que formam um padrão de paralelepípedos se perto confluente (Figura 1A). Diluir colagénio também foi utilizado para revestir os poços, e as células endoteliais, enquant...

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Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Cultura celular primária é uma técnica útil para a análise de populações específicas de células, principalmente a partir de embriões de camundongos transgênicos em estágios de desenvolvimento específicos. Nisto, os ventrículos embrionárias são dissecados e dissociados, e os grânulos de anticorpos conjugados reconhecer e separar as células endoteliais para análise posterior.

Isolamento de Células Embrionárias ventriculares endoteliais

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells HUVEC

Isolamento de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps ...

Biologia

Embryonic Stem Cell-Derived Endothelial Cells for Treatment of Hindlimb Ischemia

Embrionárias com células-tronco derivadas de células endoteliais para tratamento da isquemia dos membros posteriores

Peripheral arterial disease (PAD) results from narrowing of the peripheral arteries that supply oxygenated blood and nutrients to the legs and feet, This ...

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

Isolamento e expansão em grande escala de Adulto Humanos endotelial Colony Células Progenitoras Forming

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

Isolamento e derivação de células embrionárias de rato Germinal

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Isolamento de Valvular Células Endoteliais

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Isolation and Culture of Avian Embryonic Valvular Progenitor Cells

Isolamento e Cultura da Avian embrionárias Células Progenitoras Valvular

Proper formation and function of embryonic heart valves is critical for developmental progression. The early embryonic heart is a U-shaped tube of ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Isolamento e cultura de células endoteliais pulmonares de camundongos Neonatal

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

O isolamento de células endoteliais de Murino Válvula

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolamento e cultura primária de células de camundongo aórtica endoteliais

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

Isolamento de células de camundongo Coronária endoteliais

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...