Name: isolation of embryonic ventricular endothelial cells
Uploaded: 2013-07-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells at JoVE.com

Biz kritik yazının okuma, zaman atlamalı görüntüleme ile yardım için UNC en Mikroskop Hizmet Laboratuvarı, ve finansman desteği için NIH (hibe # R01HL061656) için Andrea Portbury teşekkür etmek istiyorum.

1. Antikor-konjuge boncuk hazırlayın <ol><li> Diseksiyon önce bir gün, üreticinin talimatlarına göre, uygun Dynabeads (sıçan yükseltilmiş bir antikor örneğin fare IgG Dynabeads, 4 x 10 8 boncuk / ml), seçilen antikor bir araya getirir. BD sıçan anti-CD31 antikoru (0.5 mg / ml, endotel hücreleri izole etmek için kullanılan) için 3 ul antikor, bir son 1.5 mg anti-CD31 antikoru konsantrasyonu ve / 1 x 10 7 boncuklar için, her 25 ul boncuk ilave edilir 25 ul tampon. </li...

<ol>
	<li>Landecker, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culturing Life: How Cells Became Technologies. , (2007).</li><li>Kan, C. Y., Wen, V. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+dysfunction+and+cytoskeletal+changes+associated+with+repression+of+p16(INK4a)+during+immortalization.">Endothelial cell dysfunction and cytoskeletal changes associated with repression of p16(INK4a) during immortalization.</a> Oncogene. , (2012).</li><li>Dyer, L. A., Patterson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+endothelium:+an+emphasis+on+heterogeneity.">Development of the endothelium: an emphasis on heterogeneity.</a> Semin. Thromb. Hemost. 36, 227-235 (2010).</li><li>Dong, Q. G., Bernasconi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+strategy+for+isolation+of+endothelial+cells+from+murine+tissues.+Characterization+of+two+endothelial+cell+lines+from+the+murine+lung+and+subcutaneous+sponge+implants.">A general strategy for isolation of endothelial cells from murine tissues. Characterization of two endothelial cell lines from the murine lung and subcutaneous sponge implants.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 17, 1599-1604 (1997).</li><li>van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+endothelial+cells+from+fresh+tissues.">Isolation of endothelial cells from fresh tissues.</a> Nat. Protoc. 3, 1085-1091 (2008).</li><li>Runyan, R. B., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+mesenchyme+into+three-dimensional+collagen+gels:+a+regional+and+temporal+analysis+of+interaction+in+embryonic+heart+tissue.">Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue.</a> Dev. Biol. 95, 108-114 (1983).</li><li>Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+angiogenesis:+endothelial+cell+tube+formation+on+gelled+basement+membrane+extract.">In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract.</a> Nat. Protoc. 5, 628-635 (2010).</li><li>Zeisberg, E. M., Potenta, S. E., Sugimoto, H., Zeisberg, M., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+in+kidney+fibrosis+emerge+via+endothelial-to-mesenchymal+transition.">Fibroblasts in kidney fibrosis emerge via endothelial-to-mesenchymal transition.</a> Journal of the American Society of Nephrology : JASN. 19, 2282-2287 (2008).</li><li>Chang, L., Noseda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+vascular+smooth+muscle+cells+from+local+precursors+during+embryonic+and+adult+arteriogenesis+requires+Notch+signaling.">Differentiation of vascular smooth muscle cells from local precursors during embryonic and adult arteriogenesis requires Notch signaling.</a> PNAS. 109, 5993-6998 (2012).</li><li>Fehrenbach, M. L., Cao, G., Williams, J. T., Finklestein, J. M., DeLisser, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+murine+lung+endothelial+cells.">Isolation of murine lung endothelial cells.</a> American Journal of Physiology: Lung Cellular and Molecular Physiology. 296, L1095-L1103 (2009).</li><li>Frauli, M., Ludwig, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+fibroblast+proliferation+in+a+culture+of+human+endometrial+stromal+cells+using+a+medium+containing+D-valine.">Inhibition of fibroblast proliferation in a culture of human endometrial stromal cells using a medium containing D-valine.</a> Archives of Gynecology and Obstetrics. , 241-96 (1987).</li><li>Lazzaro, V. A., Walker, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+fibroblast+proliferation+in+L-valine+reduced+selective+media.">Inhibition of fibroblast proliferation in L-valine reduced selective media.</a> Research communications in chemical pathology and pharmacology. 75, 39-48 (1992).</li><li>Arima, S., Nishiyama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenic+morphogenesis+driven+by+dynamic+and+heterogeneous+collective+endothelial+cell+movement.">Angiogenic morphogenesis driven by dynamic and heterogeneous collective endothelial cell movement.</a> Development. 138, 4763-4776 (2011).</li></ol>

Primer embriyonik hücreler ile çalışma yeni deneyler geliştirme in vitro kritik adımda ele sağlar. Ancak, izolasyon prosedürü önemsiz değildir. Hücrelerin her türlü izole etmek için kritik adımlar hücreleri de onlar iyi yıkama adımları sırasında askıya alınır o zaman kollajenaz sindirim üzerine ayrılır ve olmasını sağlamak yer alıyor. Pipetleme mekanik diseksiyon ölçüde kolajenaz adımı sırasında hücrelerinin ayrılmasında yardımcı olur ve filtreleme adımı h?...

Ölümsüzleştirdi hücre hatları gelişi temel hücre biyolojisi 1 devrim yarattı. Hali hazırda mevcut olan hücre hatları organların geniş elde edilen ve bütün büyük hücre tipleri kapsamaktadır edilir. Ancak, kurulan hücre hatları bazı sınırlamalar var. Ölümsüzleşme işlemi belli özel kullanım ömrü ve çoğalma ile ilgili olarak, hücre davranışını değiştirir, aynı zamanda, örneğin 2 sitoskeletal proteinler gibi beklenmedik proteinlerin ifade etkileyebilir. Pek çok farklı hücre hatları kullanılabilir olsa da buna ek olarak, bütün bir organizma içinde tek bir hücre türü arasında anlamlı bir farklılık yoktur. Özellikle gösteri çeşitli davranışlarda endotel hücreleri arter veya ven ve akış ne tür geminin 3 mevcut onlar hat olmasına göre. Gelişimsel olarak daha acil, ancak, (bakınız, örneğin, t mevcut hücre hatlarının büyük çoğunluğu yetişkin dokusundan elde edilen olmasıdırATCC ile kullanılabilir o toplama). Bu yetişkin hücre hatları büyük olasılıkla embriyonik öncüleri dinamik yapısı özetlemek yok. Gelişimi sırasında gözlenen hızla değişen uzaysal gen ifade desenleri belirli bir gelişim aşamasında bir organı bir endotel hücre farklı bir gelişim aşamasında aynı organdan bir endotel hücre ile aynı şekilde davranır değil olabileceğini düşündürmektedir. Ticari olarak temin edilebilen ölümsüzleştirilmiş hücre çizgileri kullanılarak bir alternatif olarak, primer hücrelerde ilgilenilen belirli bir dokusundan izole edilebilir. Bu tekniğin avantajı ise, bu birincil hücrelerde bile belirli bir organ ya da belirli bir gelişme aşamasında bir organ parçası izole edilebilir. Ayrıca, bu birincil hücreler gen nakavt ve bu transfeksiyon verimi gibi başka sorunlar kaçınarak Knock-in vitro çalışma sağlayan, mevcut transgenik hayvanların çeşitli izole edilebilir. Beklendiği gibi, pek çokteknikleri özel hücre tipleri 4,5 izole etmek için nasıl ayrıntılı yayınlanmıştır. Genel olarak, bu teknikler, hücreler, etiketleme ilgilenilen belirli bir hücre tipi, tutmuş ve daha fazla analiz için bu hücrelerin izole edilmesi, ilgili bölgenin toplama içerir. Koroner endotel hücrelerinin erken embriyonik nüfus incelemek için, daha küçük bir organı ile kullanmak için daha önce yayınlanmış teknik 4. küçültülmüş. Bu ölçekli aşağı prosedürü ile, özel embriyonik aşamalarında embriyonik kalp koroner endotel hücreleri izole olabilir. Bu hücreler daha sonra bu geçiş analizleri gibi geleneksel endotel deneyleri, de kullanılabilir. Erken evredeki embriyonik hücre hatları daha yaygın hale gelinceye kadar, birincil hücreler ile çalışan bir çok değerli bir tekniktir.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Timed-pregnant mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To be dissected at the embryonic stage of interest</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-mouse CD31</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553370</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Rat IgG Dynabeads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>110-35</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Collagen</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>PBS (1x)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Collagenase, type I</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Cellgro </td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich </td>
			<td>F2442 </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Endothelial cell growth medium</td>
			<td>(made in lab as described in notes)</td>
			<td></td>
			<td>DMEM containing 20% FBS, 5 &mu;M &beta;-mercaptoethanol, 50 &mu;g/ml ECG, and 1x penicillin/streptomycin</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>&beta;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>ECGS</td>
			<td>Biomedical Technologies, Inc.</td>
			<td>BT-203</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>384-well culture plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>T-3037-6</td>
			<td>Plate was prepared with a thin collagen gel, as described in 6; working surface area 10 mm2</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Collagen type I</td>
			<td>BD</td>
			<td>354236</td>
			<td>Use at a final concentration of 1.5 mg/ml</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>M199, 10x</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11825-015</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Syto-16</td>
			<td>Invitrogen </td>
			<td>S7578 </td>
			<td>Used as directed in 13 </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Stereoscopic microscope</td>
			<td>Nikon </td>
			<td>SMZ645</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>Thermo </td>
			<td>3110 </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DynaMag</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>123-21D</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Table-top centrifuge</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>75002430</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

isolation of embryonic ventricular endothelial cells

Hücre kültürü büyük ölçüde sayısız kültür koşulları altında hücrelerin tek tek nüfus değerlendirmek için yeteneğimizi geliştirdi. Ölümsüzleştirilmiş hücre hatları ve bunların kullanım kolaylığı için önemli avantajlar sunmasına rağmen, bu hücre hatları tüm potansiyel hücre tipleri için kullanılamaz. Özellikle transgenik fare ilgi belirli bir bölgesinden birincil hücreleri, izole ederek, daha nüanslı çalışmalar yapılabilir. Temel teknik organ veya ilgi kısmi organı (kalp ve kalbin belirli bir bölge gibi) diseksiyon ve tek hücrelere organ dissociating içerir. Bu hücreler daha sonra ilgi hücre türünü tanıyan bir antikor ile konjuge manyetik boncukları ile inkübe edilir. İlgi hücreleri daha sonra, taneciklerden hücreleri ayırmasıyla kısa bir tripsin ile inkübasyon sonucunda, bir mıknatısın kullanılması ile izole edilebilir. Bu izole edilmiş hücreler daha sonra kültüre ve benzeri gibi arzu edilen analiz edilebilir. Bu teknik, aslında yetişkin fare organ için tasarlanmıştırs ancak kolayca burada gösterdiği gibi, embriyonik organları ile kullanım için küçültülmüş olabilir. Bizim ilgi gelişmekte olan koroner damar olduğu için, biz özel embriyonik aşamalarında hücrelerin bu nüfus okumak istedim. Bu nedenle, orijinal protokole embriyonik ventriküllerin küçük boyutu ve bu gelişim aşamalarında endotel hücrelerinin potansiyeli düşük verim ile uyumlu olacak şekilde modifiye edilmesi gerekiyordu. Bu ölçekli aşağıya bir yaklaşım kullanarak, biz transgenik embriyonik ventriküler endotel hücreleri koroner pleksus yeniden değerlendirilmiştir.

CD31 tanıyan bir endotel spesifik antikor kullanarak, endotel hücreleri embriyonik (E) 13.5 (Şekil 1A), 18.5 (Şekiller 1B-1D) embriyoların ventriküller izole edilmiştir. Işlenmemiş bir kültür çanak yetişen, bu hücreler yuvarlak kalır ve yakın birleşik (Şekil 1A), bir Arnavut kaldırımı deseni oluşturacak. Sulandırmak kollajen de kuyu kat için kullanılmıştır ve endotel hücreler (Şekil 1B) bağlı olurken, onlar daha az zincir...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells at JoVE.com

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Primer hücre kültürü özellikle belirli gelişim aşamalarında transgenik fare embriyolardan, hücrelerin belirli nüfus analiz etmek için yararlı bir tekniktir. Burada, embriyonik ventriküller disseke ve ayrışmış ve antikor konjuge boncuk tanımak ve daha fazla analiz için endotel hücreleri ayırmak vardır.

Embriyonik Ventriküler Endotel Hücre İzolasyonu

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells HUVEC

İnsan umbilikal ven endotel hücreleri İzolasyon (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps ...

Biyoloji

Embryonic Stem Cell-Derived Endothelial Cells for Treatment of Hindlimb Ischemia

Embriyonik Kök Hücre Tedavi Hindlimb İskemi Türetilmiş Endotel Hücreleri

Peripheral arterial disease (PAD) results from narrowing of the peripheral arteries that supply oxygenated blood and nutrients to the legs and feet, This ...

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

İzolasyon ve Büyük Ölçekli Genişleme Yetişkin İnsan Endotel Koloni Oluşturan Progenitör Hücreler

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

Fare Embriyonik Germinal Hücreleri İzolasyon ve türetilmesi

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Kapak Endotel Hücreleri İzolasyon

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Isolation and Culture of Avian Embryonic Valvular Progenitor Cells

Kuş Embriyonik Kapak Progenitör Hücreler izolasyonu ve Kültür

Proper formation and function of embryonic heart valves is critical for developmental progression. The early embryonic heart is a U-shaped tube of ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Yenidoğan Fareler Pulmoner Endotel Hücreleri İzolasyon ve Kültür

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Murin Vana Endotel Hücreleri İzolasyon

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

İzolasyon ve Fare aort endotel hücreleri İlköğretim Kültür

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

Fare Koroner Endotel Hücreleri İzolasyon

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...