Name: intravital microscopy of the microcirculation in the mouse cremaster muscle for the analysis of peripheral stem cell migration
Uploaded: 2013-11-05T18:00:00
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L&#39;ensemble du protocole après l&#39;isolement cellulaire dure environ 2 heures. Une. Préparation de microchirurgie <ol><li> Effectuer l&#39;isolement de cellules souches de la moelle osseuse du donneur et un marquage fluorescent de la sous-population isolée selon des protocoles 9,12 permettre aux cellules de se reposer pendant le temps de l&#39;opération de l&#39;animal est effectuée normalisés. Pour le marquage fluorescent, nous recommandons CFDA (Carboxyfluorescein d...

<ol>
	<li>Madlambayan, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=marrow+stem+and+progenitor+cell+contribution+to+neovasculogenesis+is+dependent+on+model+system+with+SDF-1+as+a+permissive+trigger.">marrow stem and progenitor cell contribution to neovasculogenesis is dependent on model system with SDF-1 as a permissive trigger.</a> Blood. 114, 4310-4319 (2009).</li><li>Lapidot, T., Dar, A., Kollet, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+stem+cells+find+their+way+home?.">How do stem cells find their way home?.</a> Blood. 106, 1901-1910 (2005).</li><li>Lehr, H. A., Vollmar, B., Vajkoczy, P., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+fluorescence+microscopy+for+the+study+of+leukocyte+interaction+with+platelets+and+endothelial+cells.">Intravital fluorescence microscopy for the study of leukocyte interaction with platelets and endothelial cells.</a> Methods Enzymol. 300, 462-481 (1999).</li><li>Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+for+the+study+of+mouse+microcirculation+in+anti-inflammatory+drug+research:+focus+on+the+mesentery+and+cremaster+preparations.">Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).</li><li>Leister, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+peritoneal+cavity+chamber+for+intravital+microscopy+of+the+liver+under+conditions+of+pneumoperitoneum.">A peritoneal cavity chamber for intravital microscopy of the liver under conditions of pneumoperitoneum.</a> Surg. Endosc. 17, 939-942 (2003).</li><li>Sriramarao, P., Anderson, W., Wolitzky, B. A., Broide, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+bone+marrow-derived+mast+cells+roll+on+P-selectin+under+conditions+of+flow+in+vivo.">Mouse bone marrow-derived mast cells roll on P-selectin under conditions of flow in vivo.</a> Lab Invest. 74, 634-643 (1996).</li><li>Baez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+open+cremaster+muscle+preparation+for+the+study+of+blood+vessels+by+in+vivo+microscopy.">An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy.</a> Microvasc. Res. 5, 384-394 (1973).</li><li>Bagher, P., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+cremaster+muscle+preparation+for+intravital+imaging+of+the+microcirculation.">The mouse cremaster muscle preparation for intravital imaging of the microcirculation.</a> J. Vis. Exp. , e2874 (2011).</li><li>Kaminski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+NOS+is+required+for+SDF-1alpha/CXCR4-mediated+peripheral+endothelial+adhesion+of+c-kit++bone+marrow+stem+cells.">Endothelial NOS is required for SDF-1alpha/CXCR4-mediated peripheral endothelial adhesion of c-kit+ bone marrow stem cells.</a> Lab Invest. 88, 58-69 (2008).</li><li>Furlani, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HMGB-1+induces+c-kit++cell+microvascular+rolling+and+adhesion+via+both+toll-like+receptor-2+and+toll-like+receptor-4+of+endothelial+cells.">HMGB-1 induces c-kit+ cell microvascular rolling and adhesion via both toll-like receptor-2 and toll-like receptor-4 of endothelial cells.</a> J. Cell Mol. Med. 16, 1094-1105 (2012).</li><li>Furlani, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+the+intravascular+administration+of+mesenchymal+stem+cells+safe?+Mesenchymal+stem+cells+and+intravital+microscopy.">Is the intravascular administration of mesenchymal stem cells safe? Mesenchymal stem cells and intravital microscopy.</a> Microvasc. Res. 77, 370-376 (2009).</li><li>Donndorf, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysing+migratory+properties+of+human+CD+133(+)+stem+cells+in+vivo+after+intraoperative+sternal+bone+marrow+isolation.">Analysing migratory properties of human CD 133(+) stem cells in vivo after intraoperative sternal bone marrow isolation.</a> Cell Transplant. , (2012).</li></ol>

<html> La microscopie à fluorescence intravitale permet la visualisation directe et une analyse quantitative des interactions cellules-souches endothéliales. Le modèle de muscle crémaster est particulièrement utile, étant donné que l&#39;exposition et les techniques de microchirurgie visualisation intravitale ont été bien établies au cours de la recherche sur les interactions des leucocytes et l&#39;endothélium différents composants chimiques peuvent être appliqués de façon sélective à du tissu cible par...

Le but du présent article est de décrire la technique de microscopie intravitale (IVM) appliqué sur le crémaster microcirculation de la souris pour l&#39;observation directe et l&#39;analyse de la migration de la moelle osseuse de cellules souches périphériques. Tissus et organes régénération, le concept actuel de cellules souches basée implique la domiciliation des cellules souches dérivées de la moelle osseuse dans le tissu lésé 1. Une étape cruciale pour la réussite de la migration de cellules souches comprend des cellules souches interaction avec l&#39;endothélium locale au sein de l&#39;organe lésé suivie par la migration trans-endothéliale et, éventuellement, la prise de greffe organe 2. Intravitale analyse de ces cellules souches - interactions des cellules endothéliales forme un paramètre idéal pour la quantification d&#39;une réponse par récupération à base de cellules souches dans des contextes différents physiopathologiques in vivo. En outre, il semble concevable que, dans l&#39;avenir, l&#39;analyse intravitale de la capacité migratoire des cellules souches spécifiques populations dans les environnements de la microcirculation normalisés, pourraient être appliquées avant la promotion de ces populations à d&#39;autres essais cliniques. Microscopie intravitale a été initialement mis au point pour l&#39;observation et la quantification de l&#39;interaction de la cellule leucocyte-endothéliale in vivo dans le domaine de la recherche inflammatoire 3. Premiers enregistrements succès des études de microscopie intravitale ont été signalés par Cohnheim déjà au 19ème siècle, l&#39;étude des langues et mésentères de grenouilles sous un microscope optique 4. Depuis sa première utilisation IVM a connu un développement technique énorme et aujourd&#39;hui certains éléments essentiels constituent les conditions préalables pour effectuer IVM quantitative: (i) des préparations de tissus qui permettent l&#39;accès optique, (ii) des sondes moléculaires qui peuvent être détectés par un microscope, (iii ) un microscope raccordé à un système de détection et (iv) sur la base de l&#39;analyse des systèmes informatiques qui peuvent extraire des paramètres d&#39;intérêt à partir des données d&#39;imageset 4. Une variété de préparations de tissus a été introduit pour les études IVM y compris les mésentère et le foie de la souris et le rat 5, les chambres dorsale du pli cutané de la souris et le hamster 6, l&#39;oreille de lapin et le hamster cheek pouch pour n&#39;en nommer que quelques-uns. Toutefois, dans ce qui suit, nous allons nous concentrer sur le crémaster muscle de souris, ce qui représente un tissu idéal pour les observations intravitale, la préparation et la visualisation sont possibles par une intervention chirurgicale bien standardisée, et en général pas de problèmes d&#39;artefacts de mouvement se produire. La préparation crémaster muscle ouverte a été réalisée pour la première fois dans les années 1970 par Baez et ses collègues 7. Initialement décrit chez le rat, il a été adopté avec succès également pour la souris 8. Après des études antérieures avaient principalement porté sur les interactions des leucocytes avec la paroi du vaisseau, notre groupe a récemment introduit la souris crémaster préparation musculaire comme évable outil pour la visualisation directe et l&#39;analyse quantitative des interactions cellule-souches endothéliales dans un microenvironnement défini 9. Différentes sous-populations de cellules souches a été étudiée en utilisant ce modèle, y compris murin c-kit + de la moelle osseuse les cellules souches et les cellules souches mésenchymateuses, ainsi que les CD humaines des cellules souches 133 + de la moelle osseuse de 10 à 12. Suite à l&#39;isolation de cellules de moelle osseuse du donneur et un marquage fluorescent pour la visualisation, les cellules souches sont appliqués de manière sélective dans la microcirculation crémaster utilisant une injection artérielle par l&#39;intermédiaire de l&#39;artère fémorale, ce qui évite tout coincement des cellules dans des organes distants. En outre, le modèle de muscle crémaster est particulièrement utile car diverses chimiokines potentiellement médiatrices migration de cellules souches locales dans les paramètres respectifs, peuvent être appliquées par voie topique au tissu cible par une technique de surfusion simple.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxy-fluorescein diacetate succinimidylester (CFDA)</td>
			<td>Invitrogen, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>C1157</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine 6 G (1%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Munich, Germany</td>
			<td>83697</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamin (Ketanest)</td>
			<td>Pfizer, Berlin, Germany</td>
			<td>not available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylacin (Rompun)</td>
			<td>Bayer, Leverkusen, Germany</td>
			<td>not available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate - buffered saline (PBS)</td>
			<td>PAN Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P04-36500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intravital microscopy of the microcirculation in the mouse cremaster muscle for the analysis of peripheral stem cell migration

À l&#39;ère de protocoles d&#39;application intravasculaire de cellules dans le cadre de la thérapie cellulaire régénérative, les mécanismes sous-jacents de la migration des cellules souches de tissu nonmarrow n&#39;ont pas été complètement clarifiée. Nous décrivons ici la technique de microscopie intravitale appliquée à la cremaster microcirculation de la souris pour l&#39;analyse de la moelle osseuse migration périphérique de cellules souches in vivo. Microscopie intravitale de l&#39;M. crémaster a été préalablement introduit dans le domaine de la recherche inflammatoire pour l&#39;observation directe de l&#39;interaction des leucocytes à l&#39;endothélium vasculaire. Depuis souches périphériques suffisante et la migration des cellules progénitrices comprend les étapes initiales similaires de rouler le long et ferme adhésion à la endothéliales tapissant il est envisageable d&#39;appliquer le modèle de cremaster M. pour l&#39;observation et la quantification de l&#39;interaction des cellules intravasculary souches administrées avec l&#39;endothélium. Comme différents composants chimiques peuvent être appliqués de manière sélective à la cible tquestion par des techniques de surfusion simples, il est possible d&#39;établir des conditions préalables essentielles du micro-environnement, pour le recrutement de cellules souches initiale aura lieu dans un organisme vivant à l&#39;extérieur de la moelle osseuse.

En général, l&#39;interaction d&#39;injecter directement des cellules souches ou progénitrices avec l&#39;endothélium vasculaire au sein de la microcirculation du muscle crémaster est un événement rare et se produit exclusivement dans veinules post-capillaires (diamètre: 30 à 80 um). En raison de la fluorescence étiquetage laminage et les cellules souches fermement adhérentes peuvent être clairement quantifiés dans la séparation de leucocytes circulants endogènes dans les veinules observés (Figur...

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Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

Microscopie intravitale de la microcirculation souris crémaster M. offre un service unique et bien normalisé modèle in vivo pour l&#39;analyse de la moelle osseuse migration de cellules souches périphériques.

Microscopie intravitale de la microcirculation dans le muscle de souris Cremaster pour l&#39;analyse des souches périphériques migration cellulaire

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to ...

Research

JoVE Journal

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