Name: intravital microscopy of the microcirculation in the mouse cremaster muscle for the analysis of peripheral stem cell migration
Uploaded: 2013-11-05T18:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration at JoVE.com

Hela protokollet efter cellisolering tar ungefär 2 timmar. 1. Mikro Framställning <ol><li> Utför stamcellsisolering från donatorn benmärg och fluorescerande märkning av den isolerade subpopulation enligt standardiserade protokoll 9,12 tillåter celler att vila under den tid djuret utförs. För fluorescerande märkning rekommenderar vi CFDA (karboxyfluorescein diacetate succinimidylester). </li><li> Söva en manlig mus väger 20-25 g med ketamin (75 mg / kg) och xylazin (2...

<ol>
	<li>Madlambayan, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=marrow+stem+and+progenitor+cell+contribution+to+neovasculogenesis+is+dependent+on+model+system+with+SDF-1+as+a+permissive+trigger.">marrow stem and progenitor cell contribution to neovasculogenesis is dependent on model system with SDF-1 as a permissive trigger.</a> Blood. 114, 4310-4319 (2009).</li><li>Lapidot, T., Dar, A., Kollet, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+stem+cells+find+their+way+home?.">How do stem cells find their way home?.</a> Blood. 106, 1901-1910 (2005).</li><li>Lehr, H. A., Vollmar, B., Vajkoczy, P., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+fluorescence+microscopy+for+the+study+of+leukocyte+interaction+with+platelets+and+endothelial+cells.">Intravital fluorescence microscopy for the study of leukocyte interaction with platelets and endothelial cells.</a> Methods Enzymol. 300, 462-481 (1999).</li><li>Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+for+the+study+of+mouse+microcirculation+in+anti-inflammatory+drug+research:+focus+on+the+mesentery+and+cremaster+preparations.">Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).</li><li>Leister, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+peritoneal+cavity+chamber+for+intravital+microscopy+of+the+liver+under+conditions+of+pneumoperitoneum.">A peritoneal cavity chamber for intravital microscopy of the liver under conditions of pneumoperitoneum.</a> Surg. Endosc. 17, 939-942 (2003).</li><li>Sriramarao, P., Anderson, W., Wolitzky, B. A., Broide, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+bone+marrow-derived+mast+cells+roll+on+P-selectin+under+conditions+of+flow+in+vivo.">Mouse bone marrow-derived mast cells roll on P-selectin under conditions of flow in vivo.</a> Lab Invest. 74, 634-643 (1996).</li><li>Baez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+open+cremaster+muscle+preparation+for+the+study+of+blood+vessels+by+in+vivo+microscopy.">An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy.</a> Microvasc. Res. 5, 384-394 (1973).</li><li>Bagher, P., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+cremaster+muscle+preparation+for+intravital+imaging+of+the+microcirculation.">The mouse cremaster muscle preparation for intravital imaging of the microcirculation.</a> J. Vis. Exp. , e2874 (2011).</li><li>Kaminski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+NOS+is+required+for+SDF-1alpha/CXCR4-mediated+peripheral+endothelial+adhesion+of+c-kit++bone+marrow+stem+cells.">Endothelial NOS is required for SDF-1alpha/CXCR4-mediated peripheral endothelial adhesion of c-kit+ bone marrow stem cells.</a> Lab Invest. 88, 58-69 (2008).</li><li>Furlani, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HMGB-1+induces+c-kit++cell+microvascular+rolling+and+adhesion+via+both+toll-like+receptor-2+and+toll-like+receptor-4+of+endothelial+cells.">HMGB-1 induces c-kit+ cell microvascular rolling and adhesion via both toll-like receptor-2 and toll-like receptor-4 of endothelial cells.</a> J. Cell Mol. Med. 16, 1094-1105 (2012).</li><li>Furlani, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+the+intravascular+administration+of+mesenchymal+stem+cells+safe?+Mesenchymal+stem+cells+and+intravital+microscopy.">Is the intravascular administration of mesenchymal stem cells safe? Mesenchymal stem cells and intravital microscopy.</a> Microvasc. Res. 77, 370-376 (2009).</li><li>Donndorf, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysing+migratory+properties+of+human+CD+133(+)+stem+cells+in+vivo+after+intraoperative+sternal+bone+marrow+isolation.">Analysing migratory properties of human CD 133(+) stem cells in vivo after intraoperative sternal bone marrow isolation.</a> Cell Transplant. , (2012).</li></ol>

<html> Intravital fluorescensmikroskopi möjliggör direkt visualisering och kvantitativ analys av stemcell-endotel interaktioner. Kremastermuskeln modell är särskilt användbar, eftersom mikrokirurgisk exponering och tekniker intravital visualisering har blivit väl etablerat under forskning på leukocyt-endotel interaktioner och olika kemiska komponenter kan selektivt anbringas till målvävnaden genom enkel superfusionstekniken. På grund av avsaknaden av rörelse artefakter och svår bildbrus, just denna modell, i ...

Syftet med denna artikel är att beskriva den teknik för intravital mikroskopi (IVM) tillämpas på musen cremaster mikrocirkulationen för direkt observation och analys av perifer benmärg stamceller migration. Det nuvarande begreppet stamcellsbaserad vävnad och organregenere involverar målsökande av benmärg härrör stamceller i den skadade vävnaden 1. Ett avgörande steg för lyckad stamcells migrering omfattar stamceller samverkan med det lokala endotel i den skadade organet följt av transendotelial migration och slutligen organ engraftment 2. Intravital analys av dessa stamceller - endothelial cell interaktioner utgör en idealisk parameter för kvantifiering av en stamcellsbaserad regenerativ respons i olika patofysiologiska inställningar in vivo. Dessutom verkar det tänkbart, att, i framtiden, intravital analys av migrationskapacitet specifika stamcells populations inom standardiserade mikrocirkulatoriska miljöer, kan tillämpas innan avancera dessa befolkningar att ytterligare kliniska tester. Intravital mikroskopi har ursprungligen utvecklats för observation och kvantifiering av leukocyt-endotel interaktion cell in vivo inom området inflammatoriska forskning 3. Första lyckade inspelningar av intravital mikroskopi studier rapporterades av Cohnheim redan på 19-talet, studerar grod tungor och mesenteries under ett ljusmikroskop 4. Sedan den första användningen IVM har genomgått en enorm teknisk utveckling och idag vissa viktiga komponenter utgör förutsättningar för att utföra kvantitativa IVM: (i) vävnadspreparat som medger optisk access, (ii) molekylära sonder som kan upptäckas genom ett mikroskop, (iii ) ett mikroskop som är ansluten till ett system för upptäckt och (iv) datorbaserade analyssystem som kan extrahera parametrar av intresse från bilddataset 4. En mängd olika vävnadspreparat har införts för IVM studier inklusive mesenteries och lever i mus och råtta 5, de dorsala skinfold kamrar mus 6 och hamster, kanin öron och hamsterkindpåsen för att nämna några. I det följande kommer vi att fokusera på musen kremastermuskeln, som representerar en idealisk vävnad för intravital observationer, som förberedelse och visualisering är möjligt genom en väl standardiserat kirurgiskt ingrepp, och i allmänhet inga problem med rörelseartefakter uppstå. Den öppna kremastermuskeln förberedelse genomfördes för första gången på 1970-talet av Baez och kollegor 7. Ursprungligen beskrivet för råttor har det antagits framgångsrikt även till mus-8. Efter tidigare studier hade främst fokuserat på leukocyt interaktion med kärlväggen, vår egen grupp nyligen infört musen kremastermuskeln förberedelse som en värderingble verktyg för direkt visualisering och kvantitativ analys av stemcell-endotel interaktioner inom ett definierat mikro 9. Olika stamcellspopulationer har studerats utnyttja denna modell, inklusive murina c-kit + benmärg stamceller och mesenkymala stamceller, samt den mänskliga CD 133 + benmärgsstamceller 10-12. Efter cellisolering från givare benmärg och fluorescerande märkning för visualisering, är stamceller selektivt tillämpat i cremaster mikrocirkulationen utnyttjar en arteriell injektion via lårbensartären, och därmed undvika någon cell entrapment inom avlägsna organ. Dessutom är kremastermuskeln modellen särskilt användbart eftersom olika kemokiner potentiellt förmedla lokala stamceller migration inom respektive inställningar, kan lokalt applicerad till målvävnaden genom enkel superfusionsteknik.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxy-fluorescein diacetate succinimidylester (CFDA)</td>
			<td>Invitrogen, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>C1157</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine 6 G (1%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Munich, Germany</td>
			<td>83697</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamin (Ketanest)</td>
			<td>Pfizer, Berlin, Germany</td>
			<td>not available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylacin (Rompun)</td>
			<td>Bayer, Leverkusen, Germany</td>
			<td>not available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate - buffered saline (PBS)</td>
			<td>PAN Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P04-36500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intravital microscopy of the microcirculation in the mouse cremaster muscle for the analysis of peripheral stem cell migration

I en tid präglad av intravaskulära cellapplikationsprotokoll i samband med regenerativ cellterapi, de bakomliggande mekanismerna för stamcells migration till nonmarrow vävnad har inte helt klarlagts. Vi beskriver här tekniken med intravital mikroskopi appliceras på musen cremaster mikrocirkulationen för analys av perifer benmärg stamceller migration in vivo. Intravital mikroskopi av M. cremaster tidigare har införts inom området inflammatorisk forskning för direkt observation av leukocyt interaktion med det vaskulära endotelet. Eftersom tillräcklig perifer stam och stamceller migration innehåller liknande initiala steg rullande längs och fast adhesion vid endothelial foder det är tänkbart att tillämpa M. cremaster modell för observation och kvantifiering av samverkan mellan intravasculary administrerade stamceller med endotelet. Eftersom olika kemiska komponenter kan selektivt appliceras på mål tproblemet genom enkla supertekniker, är det möjligt att fastställa viktiga microenvironmental förutsättningar, för första stamcells rekryteringen att ske i en levande organism utanför benmärgen.

I allmänhet samverkan av direkt injiceras stam-eller stamfaderceller med det vaskulära endotelet inom kremastermuskeln mikrocirkulationen är en sällsynt företeelse och förekommer uteslutande i postkapillära venoler (diameter 30-80 ^ m). På grund av fluorescensmärkning rullande och fast vidhäftande stamceller tydligt kan kvantifieras i separation från cirkulerande endogena leukocyter i de observerade venoler (Figur 2). De mikrocirkulatoriska villkor som representer...

Watch this Scientific Journal Video about Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration at JoVE.com

Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration (Video) | JoVE

Intravital mikroskopi av musen M. cremaster mikrocirkulation erbjuder en unik och väl standardiserat in vivo-modell för analys av perifera benmärg stamceller migration.

Intravital Mikroskopi av mikrocirkulationen i musen kremastermuskeln för analys av perifera stamcells Migration

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to ...

Research

JoVE Journal

Biology

Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

The Mouse Cremaster Muscle Preparation for Intravital Imaging of the Microcirculation

The Mouse Cremaster Muscle Preparation for Intravital Imaging of the Microcirculation (Video) | JoVE

Musen Cremaster Muscle Förberedelser för Intravital avbildning av mikrocirkulationen

Throughout the body, the maintenance of homeostasis requires the constant supply of oxygen and nutrients concomitant with removal of metabolic ...

Microiontophoresis and Micromanipulation for Intravital Fluorescence Imaging of the Microcirculation

Microiontophoresis and Micromanipulation for Intravital Fluorescence Imaging of the Microcirculation (Video) | JoVE

Microiontophoresis och Mikromanipulation för Intravital fluorescens avbildning av mikrocirkulationen

Microiontophoresis entails passage of current through a micropipette tip to deliver a solute at a designated site within an experimental  preparation. ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells (Video) | JoVE

Generering av möss härledda från inducerade pluripotenta stamceller

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle (Video) | JoVE

Isolering av blod-kärl-härledda multi prekursorer från Human Skeletal Muscle

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Identification of Key Factors Regulating Self-renewal and Differentiation in EML Hematopoietic Precursor Cells by RNA-sequencing Analysis

Identification of Key Factors Regulating Self-renewal and Differentiation in EML Hematopoietic Precursor Cells by RNA-sequencing Analysis (Video) | JoVE

Identifiering av nyckelfaktorer Reglersjälvförnyelse och differentiering i EML Hematopoietisk prekursorceller genom RNA-sekvensering analys

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as ...

Visualization and Quantification of the Cell-free Layer in Arterioles of the Rat Cremaster Muscle

Visualization and Quantification of the Cell-free Layer in Arterioles of the Rat Cremaster Muscle (Video) | JoVE

Visualisering och kvantifiering av cellfria lager i arterioler av Rat kremastermuskeln

The cell-free layer is defined as the parietal plasma layer in the microvessel flow, which is devoid of red blood cells. The measurement of the in vivo ...

Analysis of the Gap Junction-dependent Transfer of miRNA with 3D-FRAP Microscopy

Analysis of the Gap Junction-dependent Transfer of miRNA with 3D-FRAP Microscopy (Video) | JoVE

Analys av Gap Junction-beroende överföring av miRNA med 3D-FRAP-mikroskopi

Small antisense RNAs, like miRNA and siRNA, play an important role in cellular physiology and pathology and, moreover, can be used as therapeutic agents ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets (Video) | JoVE

Analys av Beta-cell-funktion som använder Single-cell Resolution kalcium Imaging i zebrafiskar holmar

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

Live Imaging of Microtubule Dynamics in Glioblastoma Cells Invading the Zebrafish Brain

Live Imaging of Microtubule Dynamics in Glioblastoma Cells Invading the Zebrafish Brain (Video) | JoVE

Levande avbildning av mikrotubulidynamik i glioblastomceller som invaderar zebrafiskhjärnan

With a dismal median survival time in real populations-between 6 to 15 months-glioblastoma (GBM) is the most devastating malignant brain tumor. Treatment ...

Fluorescence Lifetime Macro Imager for Biomedical Applications

Fluorescence Lifetime Macro Imager for Biomedical Applications (Video) | JoVE

Fluorescens livstid makrokamera för biomedicinska tillämpningar

This paper presents a new photoluminescence lifetime imager designed to map the molecular oxygen (O2) concentration in different phosphorescent samples ...