Name: laser capture microdissection of neurons from differentiated human neuroprogenitor cells in culture
Uploaded: 2013-09-16T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av Merit gjennomgang stipend (NEUD-004-07F) fra Veterans Administration (SP).

En. Utvidelse av menneskerettighets NPCer (Figur 1) <ol><li> Gjenopplive den frosne lager av menneskelige NPCer fra fosterets hjerne (Lonza, Walkers, MD, USA) og kultur dem i suspensjon i T-75 kolber som neurospheres (Figur 1a) i Neurobasal medium som inneholder spredning kosttilskudd, EGF (10 ng / ml) og FGF (10 ng / ml). </li><li> Etter 3 dager i kultur, overføre neurospheres til et 15 ml rør og sentrifugert ved 500 rpm i 5 min. </li><li> Kast supernatanten etterlate ~ 100 ul medi...

<ol>
	<li>Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glial+identity+of+neural+stem+cells.">The glial identity of neural stem cells.</a> Nat Neurosci. 6, 1127-1134 (2003).</li><li>Galli, R., Gritti, A., Bonfanti, L., Vescovi, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells:+an+overview.">Neural stem cells: an overview.</a> Circ. Res. 92, 598-608 (2003).</li><li>Kim, S. U., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-based+cell+therapy+in+neurological+diseases:+a+review.">Stem cell-based cell therapy in neurological diseases: a review.</a> J. Neurosci. Res. 87, 2183-2200 (2009).</li><li>Breier, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+progenitor+cells+as+models+for+high-throughput+screens+of+developmental+neurotoxicity:+state+of+the+science.">Neural progenitor cells as models for high-throughput screens of developmental neurotoxicity: state of the science.</a> Neurotoxicol. Teratol. 32, 4-15 (2010).</li><li>Christie, V. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoid+supplementation+of+differentiating+human+neural+progenitors+and+embryonic+stem+cells+leads+to+enhanced+neurogenesis+in+vitro.">Retinoid supplementation of differentiating human neural progenitors and embryonic stem cells leads to enhanced neurogenesis in vitro.</a> J Neurosci Methods. 193, 239-245 (2010).</li><li>Bonner, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection:+molecular+analysis+of+tissue.">Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue.</a> Science. 278, 1481-1483 (1997).</li><li>Vincent, V. A., DeVoss, J. J., Ryan, H. S., Murphy, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+neuronal+gene+expression+with+laser+capture+microdissection.">Analysis of neuronal gene expression with laser capture microdissection.</a> J. Neurosci. Res. 69, 578-586 (2002).</li><li>Robles, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocampal+gene+expression+profiling+in+spatial+discrimination+learning.">Hippocampal gene expression profiling in spatial discrimination learning.</a> Neurobiol. Learn Mem. 80, 80-95 (2003).</li><li>Su, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+ethanol+versus+formalin+fixation+on+preservation+of+histology+and+RNA+in+laser+capture+microdissected+brain+tissues.">Comparison of ethanol versus formalin fixation on preservation of histology and RNA in laser capture microdissected brain tissues.</a> Brain Pathol. 14, 175-182 (2004).</li><li>Shimamura, M., Garcia, J. M., Prough, D. S., Hellmich, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+and+analysis+of+amplified+antisense+RNA+from+distinct+cell+populations+of+the+young+and+aged+rat+brain:+effect+of+traumatic+brain+injury+on+hippocampal+gene+expression.">Laser capture microdissection and analysis of amplified antisense RNA from distinct cell populations of the young and aged rat brain: effect of traumatic brain injury on hippocampal gene expression.</a> Brain Res. Mol. Brain Res. 122, 47-61 (2004).</li><li>Pugazhenthi, S., Wang, M., Pham, S., Sze, C. I., Eckman, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downregulation+of+CREB+expression+in+Alzheimer's+brain+and+in+Abeta-treated+rat+hippocampal+neurons.">Downregulation of CREB expression in Alzheimer's brain and in Abeta-treated rat hippocampal neurons.</a> Mol. Neurodegener. 6, 60 (2011).</li><li>Dworkin, S., Mantamadiotis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+CREB+signalling+in+neurogenesis.">Targeting CREB signalling in neurogenesis.</a> Expert Opin. Ther. Targets. 14, 869-879 (2010).</li><li>Trujillo, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+perspectives+of+neural+stem+cell+differentiation:+from+neurotransmitters+to+therapeutics.">Novel perspectives of neural stem cell differentiation: from neurotransmitters to therapeutics.</a> Cytometry A. 75, 38-53 (2009).</li><li>Pugazhenthi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Varicella-zoster+virus+infection+of+differentiated+human+neural+stem+cells.">Varicella-zoster virus infection of differentiated human neural stem cells.</a> J. Virol. 85, 6678-6686 (2011).</li><li>Kamme, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+microarray+analysis+in+hippocampus+CA1:+demonstration+and+validation+of+cellular+heterogeneity.">Single-cell microarray analysis in hippocampus CA1: demonstration and validation of cellular heterogeneity.</a> J. Neurosci. 23, 3607-3615 (2003).</li></ol>

Vi beskriver i denne studien et nevron-rik cellekulturmodell ved differensiering av selvfornyende menneskelige neuroprogenitor celler og en metode for å isolere en ren populasjon av nevroner med laser capture microdissection. Vi har brukt en kombinasjon av NGF, BDNF, DBC og retinsyre for nevronal differensiering av NPCer. DBC brukes til å aktivere CREB, en transkripsjonsfaktor som forbedrer neurogenesis 12. Retinsyre induserer cellesyklus exit og reduserer glial befolkningen 13. Metoden som beskr...

Livs lang neurogenesis er kjent å forekomme i subventricular sone av den laterale ventrikler og i subgranular lag av dentate gyrus av den voksne hjernen hos pattedyr en. Neuroprogenitor celler (NPC) som stammer fra disse regionene er multipotente celler som kan differensieres til nevroner, astrocytter og oligodendrocytes to. NPC har vakt interesse på grunn av deres potensial til å bli transplantert i pasienter med forskjellige neurodegenerative forstyrrelser inkludert Parkinsons sykdom, amyotrofisk lateral sklerose, slag og Alzheimers sykdom (AD) 3. Studier med NPC har generelt fokusert på denne transplantasjon vinkel, men potensialet for NPC-avledet nerveceller som en cellekulturmodell for å bestemme mekanismen for nevrodegenerasjon er ikke blitt fullt utnyttet. Tidligere studier har generelt brukt post-mitotiske neuroner isolert fra gnager hjernevev som må være isolert for hvert forsøk som de ikke erselvfornyende. Selv om menneskelig neuroblastom cellelinjer inkludert SH-SY5Y og SK-N-MC celler kan utvides, de har ikke de samme egenskapene av primære nevroner. Menneskelige NPC, på den annen side, gir både fordeler fordi de kan utvides for flere passeringer, og kan differensieres for å generere en cellepopulasjon med egenskapene til primære neuroner 4,5. I den aktuelle studien, beskriver vi en ny differensiering protokollen for å oppnå en konsistent nevron-rik befolkningen fra kommersielt tilgjengelige NPCer isolert fra menneskelig fosterets hjerne. Fordi disse kulturene inneholder en liten prosent av gliaceller, trenger vi flere metoder for å isolere en ren populasjon av nevroner for molekylær karakterisering. Laser-fangst microdissection (LCM) er en ny metode der en homogen populasjon av celler fra en vev delen kan være selektivt fanget genekspresjonsanalyser 6 for. Hjernen er et heterogent vev bestående av nerveceller, gliaceller og andre celle types. LCM er blitt brukt til å bestemme neuron-spesifikk genekspresjon analyser 7-10. Vi har tidligere utført LCM av hippocampus nevroner fra AD (Tg2576) mus hjerne seksjoner for å vise redusert uttrykk av syklisk AMP respons element bindende protein (CREB) og BDNF spesielt i hippocampus nevroner 11. I den foreliggende studien, beskriver vi prosedyrer for utvidelse av menneskelige NPCer, neuronal differensiering, immunofluorescent farging for nevronale markører og LCM for isolering av nerveceller dyrket på PEN membran sklier.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Neuroprogenitor cells (NPCs) </td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-2599</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Neurocult NS-A human basal medium</td>
			<td>Stem cell technology</td>
			<td>5750</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Neurocult NS-A Proliferation supplement</td>
			<td>Stem cell technology</td>
			<td>5753</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Neurocult NS-A Differentiation supplement</td>
			<td>Stem cell technology</td>
			<td>5754</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>B-27 Supplement (50x) </td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Human epidermal growth factor</td>
			<td>Stem cell technology</td>
			<td>2633</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fibroblast growth factor </td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0291</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Brain Derived Neurotrophic Factor </td>
			<td>Cell signaling </td>
			<td>3897S</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Nerve Growth Factor </td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13257-019</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dibutyryl cyclic AMP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D-0627</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>poly-L-lysine </td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-5899</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mouse laminin </td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L-2020</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R-2625</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>STAT3 antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>9132</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>GFAP antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>3670</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>GAP43 antibody</td>
			<td>Transduction laboratories</td>
			<td>612262</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>BDNF antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB1534SP</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Acetyl cholinesterase antibody </td>
			<td>Santz cruz</td>
			<td>Sc-11409</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Synaptophysin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab18008-50</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>NeuN antibody</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>MAB377</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Synapsin antibody</td>
			<td>Novus</td>
			<td>NB300-104</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti mouse FITC</td>
			<td>Jackson Immuno </td>
			<td>115-095-146</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td>Research Laboratories</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti Rabbit Cy3</td>
			<td>Jackson Immuno </td>
			<td>711-165-152</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td>Research Laboratories</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1653</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Triton-X 100</td>
			<td>Acros</td>
			<td>21568-2500</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Paraformaldehye </td>
			<td>Fisher</td>
			<td>4042</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Coverslip (Big circle cover slip)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-545-102</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mounting medium (Prolong Gold)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pen membrane</td>
			<td>Applied biosystems</td>
			<td>LCM0521</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Histogene LCM frozen section staining kit</td>
			<td>Applied biosystems</td>
			<td>KIT0401</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>RiboAmp RNA Amplification kit</td>
			<td>Applied biosystems</td>
			<td>KIT0201</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Picopure RNA Isolation kit</td>
			<td>Applied biosystems</td>
			<td>KIT0202</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>CapsureMacro LCM caps</td>
			<td>Applied biosystems</td>
			<td>LCM0211</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

laser capture microdissection of neurons from differentiated human neuroprogenitor cells in culture

Neuroprogenitor celler (NPC) isolert fra human fetal hjerne ble ekspandert i henhold proliferative tilstander i nærvær av epidermal vekstfaktor (EGF), og fibroblast vekstfaktor (FGF) for å tilveiebringe en rikelig tilførsel av cellene. NPC ble differensiert i nærvær av en ny kombinasjon av nervevekstfaktor (NGF), hjerne-avledet neurotrop faktor (BDNF), dibutyryl cAMP (DBC), og retinsyre på skåler belagt med poly-L-lysin og mus laminin å skaffe neuron rike kulturer. NPC ble også differensieres i fravær av neurotrophins, DBC og retinsyre og i nærvær av ciliær neurotrofisk faktor (CNTF), hvorved astrocyte rike kulturer. Differensierte NPCer ble preget av immunfluorescens farging for et panel av nevrale markører inkludert Neun, synapsin, acetylkolinesterase, synaptophysin og GAP43. Glial fibrillary surt protein (GFAP) og STAT3, astrocyte markører, ble påvist i 10-15% av differensierte NPCer. For å lettecelle-type spesifikke molekylære karakterisering, laser capture microdissection ble utført for å isolere nerveceller dyrket på polyetylen naphthalate (PEN) membran sklier. Metodene som beskrives i denne undersøkelsen gir verdifulle verktøy for å fremme forståelsen av den molekylære mekanismen for neurodegenerering.

Utvidelse av NPC (figur 1) Når neurospheres er brutt ned til en enkelt cellesuspensjon ved triturering, må pipettespissen til å berøre bunnen av røret, slik at det ikke er noen motstand når suspensjonen blir pipettert opp og ned. Antall ganger av utgnidning vil variere mellom individer og må avgjøres ved prøving og feiling ved å undersøke den resulterende cellesuspensjon under et mikroskop. Det er viktig å sørge for tilstrekkelig tetthet av cellesuspensjonen på gr...

Watch this Scientific Journal Video about Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture at JoVE.com

Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture

Menneske neuroprogenitor celler (NPC) ble utvidet i henhold prolifererende forhold. NPC ble differensiert i neuron rike kulturer i nærvær av en kombinasjon av neurotrophins. Nevrale markører ble oppdaget av immunfluorescens farging. Å isolere en ren populasjon av nevroner, ble NPCer differensiert på PEN membran sklier og laser capture microdissection ble utført.

Laser Capture microdissection av nerveceller fra Differensiert Menneskelig Neuroprogenitor celler i kultur

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Effektiv Utledning av Human nevrale stamceller og nevroner fra pluripotent humane embryonale stamceller med lite molekyl Induksjon

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Laser Capture mikrodisseksjon av anriket Bestander av neuroner eller Enslige nevroner for genekspresjonsanalyse etter traumatisk hjerneskade

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

Produksjon av RNA for transkripsjonsanalyse fra mus ryggmargsmotor neuroncellelegemer ved laserfangst mikrodeseksjon

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or ...

Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disorders

Olfactory Nevroner innhentet gjennom Nasal Biopsi Kombinert med Laser-Capture mikrodisseksjon: En Potential tilnærming til Study Behandling Response i psykiske lidelser

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium ...

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Laser Capture mikrodisseksjon - En demonstrasjon av Isolering av Individuell dopaminneuroner og hele Ventral tegmentale området

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal rotganglier Nerveceller og Differensiert Adipose-avledet stamceller: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Co-kultur modell for å studere Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury

Stereotactic Atlas-guidede Laser fange Microdissection av hjernen regionene påvirkes av traumatisk skade

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

Enkel generasjon av en høy avkastning kultur indusert neurons fra menneskelige voksne huden fibroblaster

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...