Name: digital inline holographic microscopy (dihm) of weakly-scattering subjects
Uploaded: 2014-02-08T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Digital Inline Holographic Microscopy DIHM of Weakly-scattering Subjects at JoVE.com

والمؤلفان بالشكر ليندا تيرنر للمساعدة في إعداد الميكروبيولوجية. وتم تمويل RZ وLGW من قبل معهد رولاند في جامعة هارفارد وCGB كما تم تمويل مؤسسة عالم الرؤوس، والعلوم بلا حدود البرنامج، البرازيل (عملية # 7340-11-7)

1. الإعداد والحصول على البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو ثقافة العقدية سلالة V4051-197 (السباحة على نحو سلس) الخلايا في كتاي المتوسطة من الأسهم المجمدة 22. احتضان في شاكر دوارة بين عشية وضحاها في 35 درجة مئوية و 150 دورة في الدقيقة، لال?...

<ol>
	<li>Xu, W., Jericho, M. H., Meinertzhagen, I. A., Kreuzer, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+in-line+holography+for+biological+applications.">Digital in-line holography for biological applications.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (20), 11301-11305 (2001).</li><li>Sheng, J., Malkiel, E., Katz, J., Adolf, J., Belas, R., Place, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+holographic+microscopy+reveals+prey-induced+changes+in+swimming+behavior+of+predatory+dinoflagellates.">Digital holographic microscopy reveals prey-induced changes in swimming behavior of predatory dinoflagellates.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 17512-17517 (2007).</li><li>Lee, S. H., Roichman, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+and+tracking+single+colloidal+particles+with+video+holographic+microscopy.">Characterizing and tracking single colloidal particles with video holographic microscopy.</a> Opt. Express. 15 (26), 18275-18282 (2007).</li><li>Fung, J., Martin, K. E., Perry, R. W., Katz, D. M., McGorty, R., Manoharan, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+translational,+rotational,+and+vibrational+dynamics+in+colloids+with+digital+holographic+microscopy.">Measuring translational, rotational, and vibrational dynamics in colloids with digital holographic microscopy.</a> Opt. Express. 19 (9), 8051-8065 (2011).</li><li>Lee, S. H., Grier, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Holographic+microscopy+of+holographically+trapped+three-dimensional+structures.">Holographic microscopy of holographically trapped three-dimensional structures.</a> Opt. Express. 15 (4), 1505-1512 (2007).</li><li>Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+techniques+of+digital+holographic+microscopy.">Principles and techniques of digital holographic microscopy.</a> SPIE Rev. 1, 018005 (2010).</li><li>Corkidi, G., Taboada, B., Wood, C. D., Guerrero, A., Darszon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+sperm+in+three-dimensions.">Tracking sperm in three-dimensions.</a> Biochem. Biophys. Res. Comm. 373, 125-129 (2008).</li><li>Santi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+Sheet+Fluorescence+Microscopy+:+A+Review.">Light Sheet Fluorescence Microscopy : A Review.</a> J. Histochem. Cytochem. 59, 129-138 (2011).</li><li>van Blaaderen, A., Wiltzius, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Real-Space Structure of Colloidal Hard-Sphere Glasses. Science. 270, 1177-1179 (1990).</li><li>Besseling, R., Weeks, E. R., Schofield, A. B., Poon, W. C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Imaging+of+Colloidal+Glasses+under+Steady+Shear.">Three-Dimensional Imaging of Colloidal Glasses under Steady Shear.</a> Phys. Rev. Lett. 99, 028301 (2007).</li><li>Schall, P., Weitz, D., Spaepen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Rearrangements+That+Govern+Flow+in+Colloidal+Glasses.">Structural Rearrangements That Govern Flow in Colloidal Glasses.</a> Science. 318, 1895-1899 (2007).</li><li>Rosen, J., Brooker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+incoherent+color+holography.">Fluorescence incoherent color holography.</a> Opt. Exp. 15, 2244-2250 (2007).</li><li>Jericho, M. H., Kreuzer, H. J., Kanka, M., Riesenberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+phase+and+refractive+index+measurements+with+point-source+digital+in-line+holographic+microscopy.">Quantitative phase and refractive index measurements with point-source digital in-line holographic microscopy.</a> Appl. Opt. 51 (10), 1503-1515 (2012).</li><li>Mudanyali, O., Erlinger, A., Seo, S., Su, T., Ozcan, D. T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lensless+On-chip+Imaging+of+Cells+Provides+a+New+Tool+for+High-throughput+Cell-Biology+and+Medical.">Lensless On-chip Imaging of Cells Provides a New Tool for High-throughput Cell-Biology and Medical.</a> J. Vis. Exp. 34, (2009).</li><li>Langehanenberg, P., Kemper, B., Dirksen, D., von Bally, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autofocusing+in+digital+holographic+phase+contrast+microscopy+on+pure+phase+objects+for+live+cell+imaging.">Autofocusing in digital holographic phase contrast microscopy on pure phase objects for live cell imaging.</a> Appl. Opt. 47 (19), (2008).</li><li>Elliot, M. S., Poon, W. C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conventional+optical+microscopy+of+colloidal+suspensions.">Conventional optical microscopy of colloidal suspensions.</a> Adv. Coll. Interf. Sci. 92, 133-194 (2001).</li><li>Agero, U., Monken, C. H., Ropert, C., Gazzinelli, R. T., Mesquita, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+fluctuations+studied+with+defocusing+microscopy.">Cell surface fluctuations studied with defocusing microscopy.</a> Phys. Rev. E. 67, 051904 (2003).</li><li>Born, M., Wolf, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Optics, 6th Ed. , (1998).</li><li>Wilson, L., Zhang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Localization+of+weak+scatterers+in+digital+holographic+microscopy+using+Rayleigh-Sommerfeld+back-propagation.">3D Localization of weak scatterers in digital holographic microscopy using Rayleigh-Sommerfeld back-propagation.</a> Opt. Express. 20, 16735-16744 (2012).</li><li>Bohren, C., Huffman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Absorption and Scattering of Light by Small Particles. , (1983).</li><li>Balaev, A. E., Dvoretski, K. N., Doubrovski, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refractive+index+of+escherichia+coli+cells.">Refractive index of escherichia coli cells.</a> Saratov Fall Meeting 2001: Optical Technologies in Biophysics and Medicine III. 4707 (1), 253-260 (2002).</li><li>Berg, H. C., Manson, M. D., Conley, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+and+Energetics+of+Flagellar+Rotation+in+Bacteria.">Dynamics and Energetics of Flagellar Rotation in Bacteria.</a> Symp. Soc. Exp. Biol. 35, 1-31 (1982).</li><li>Garcia-Sucerquia, J., Xu, W., Jericho, S. K., Klages, P., Jericho, M. H., Kreuzer, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+in-line+holographic+microscopy.">Digital in-line holographic microscopy.</a> Appl. Optics. 45 (5), 836-850 (2006).</li><li>Restrepo, J. F., Garcia-Sucerquia, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnified+reconstruction+of+digitally+recorded+holograms+by+Fresnel-Bluestein+transform.">Magnified reconstruction of digitally recorded holograms by Fresnel-Bluestein transform.</a> Appl. Optics. 49 (33), 6430-6435 (2010).</li><li>Dubois, F., Joannes, L., Legros, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+three-dimensional+imaging+with+a+digital+holography+microscope+with+a+source+of+partial+spatial+coherence.">Improved three-dimensional imaging with a digital holography microscope with a source of partial spatial coherence.</a> Appl. Optics. 38 (34), 7085-7094 (1999).</li><li>Kanka, M., Riesenberg, R., Petruck, P., Graulig, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+(NA=0.8)+in+lensless+in-line+holographic+microscopy+with+glass+sample+carriers.">High resolution (NA=0.8) in lensless in-line holographic microscopy with glass sample carriers.</a> Opt. Lett. 36 (18), 3651-3653 (2011).</li><li>Dubois, F., Requena, M. L., Minetti, C., Monnom, O., Istasse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+spatial+coherence+effects+in+digital+holographic+microscopy+with+a+laser+source.">Partial spatial coherence effects in digital holographic microscopy with a laser source.</a> Appl. Optics. 43 (5), 1131-1139 (2004).</li><li>Magariyama, Y., Sugiyama, S., Muramoto, K., Kawagishi, I., Imae, Y., Kudo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+measurement+of+bacterial+flagellar+rotation+rate+and+swimming+speed.">Simultaneous measurement of bacterial flagellar rotation rate and swimming speed.</a> Biophysical Journal. 69 (5), 2154-2162 (1995).</li><li>Berg, H. C., Brown, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+in+Escherichia+coli+analysed+by+three-dimensional+tracking.">Chemotaxis in Escherichia coli analysed by three-dimensional tracking.</a> Nature. 239 (5374), 500-504 (1972).</li><li>Brooker, G., Siegel, N., Wang, V., Rosen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+resolution+in+Fresnel+incoherent+correlation+holographic+fluorescence+microscopy.">Optimal resolution in Fresnel incoherent correlation holographic fluorescence microscopy.</a> Opt. Express. 19 (6), 5047-5062 (2011).</li></ol>

أهم خطوة في هذا البروتوكول التجريبي هو التقاط دقيقة من الصور من الإعداد التجريبية مستقرة. مع البيانات الأساسية الفقراء والتعمير الدقة العالية هو أقرب إلى المستحيل. من المهم أيضا لتجنب العدسات الهدف مع عنصر النقيض من المرحلة الداخلية (مرئية كما بالطوق الظلام عندما ت?...

مضمنة الرقمية المجهر الثلاثية الأبعاد (DIHM) يسمح بسرعة التصوير ثلاثي الأبعاد للعينات مجهرية، مثل الكائنات الحية الدقيقة السباحة 1،2 و 3،4 أنظمة المسألة لينة، مع الحد الأدنى من التعديل لإعداد المجهر القياسية. في هذه الورقة يتم توفير مظاهرة تربوية من DIHM، تتمحور حول برنامج تم تطويره في المختبر. وتشمل هذه الورقة وصفا لكيفية إعداد المجهر، وتحسين الحصول على البيانات، ومعالجة الصور المسجلة لإعادة بناء البيانات ثلاثية الأبعاد. برنامج (مقرها في جزء منه على البرامج التي وضعتها المديرية العامة جرير وغيرهم 5) والمثال الصور هي متاحة بحرية على موقعنا. ويرد وصف الخطوات اللازمة لتكوين المجهر، وإعادة بناء ثلاثة مجلدات الأبعاد من الصور المجسمة وتقديم وحدات التخزين الناتجة من الاهتمام باستخدام شعاع الحرة تتبع حزمة البرامج. تخلص الورقة مع مناقشة العوامل التي تؤثر على جودة إعادة الإعمار، ومقارنة مع طرق DIHM المتنافسة. على الرغم من DIHM وصفت منذ بعض الوقت (لاستعراض عام للمبادئ وتطورها، انظر كيم 6)، والقدرة الحاسوبية المطلوبة وصورة الخبرة تجهيز وحتى الآن تقتصر إلى حد كبير استخدامه لمجموعات بحثية متخصصة مع التركيز على تطوير الصك. هذا الوضع يتغير في ضوء التطورات الحديثة في مجال الحوسبة والتكنولوجيا الكاميرا. يمكن لأجهزة الكمبيوتر المكتبية الحديثة التعامل بسهولة مع تجهيز ومتطلبات تخزين البيانات؛ CCD أو CMOS الكاميرات موجودة في معظم مختبرات الفحص المجهري، وتبذل البرنامج المطلوبة متاحة بحرية على شبكة الانترنت من قبل الجماعات الذين استثمروا الوقت في تطوير هذه التقنية. وقد اقترحت عدة مخططات لتصوير تكوين الكائنات المجهرية في حجم العينة ثلاثية الأبعاد. العديد من هذه التقنيات يتم مسح 7،8، والتي يتم تسجيلها في كومة من الصور عن طريق مترجمة echanically الطائرة الصورة من خلال العينة. المسح المجهري متحد البؤر مضان وربما كان المثال الأكثر دراية. عادة، يتم إضافة صبغة الفلورسنت إلى كائن المرحلة من أجل تحقيق مستوى مقبول من عينة النقيض من ذلك، وترتيب متحد البؤر تستخدم لتوطين مكانيا الانبعاثات الفلورسنت. وقد أدى هذا الأسلوب إلى تقدم كبير، على سبيل المثال في العلوم الغروي، حيث سمح لها الوصول إلى ديناميكية ثلاثية الأبعاد للأنظمة مزدحمة 9-11. استخدام الوسم هو الفرق المهم بين المجهري متحد البؤر مضان وDIHM، ولكن ميزات أخرى من التقنيات اثنين تستحق المقارنة. DIHM لديه ميزة سرعة كبيرة في هذا الجهاز ليس لها أجزاء متحركة. المرايا المسح الميكانيكية في أنظمة متحد البؤر وضع حد أعلى لمعدل الحصول على البيانات - عادة حوالي 30 لقطة / ثانية للحصول على صورة بكسل 512 X 512. وتستخدم مجموعة من مثل هذه الصور من طائرات التنسيق المختلفة التي يمكن أن يحصل عليها جسديا translating المرحلة عينة أو عدسة الهدف بين الإطارات، مما أدى إلى معدل التقاط النهائية حول حجم واحد في الثانية لمدة 30 إطار المكدس. في المقابل، يمكن لنظام الثلاثية الأبعاد استنادا على كاميرا CMOS الحديثة التقاط 2،000 لقطة / ثانية في نفس حجم الصورة والقرار؛ تتم معالجة كل إطار `حاليا &#39;لإعطاء لقطة مستقلة من حجم العينة. أن أكرر: ليس مطلوبا من عينات الفلورسنت لDIHM، على الرغم من أن النظام تم تطويره الذي ينفذ إعادة الإعمار الثلاثية الأبعاد للموضوع الفلورسنت 12. فضلا عن معلومات وحدة التخزين ثلاثي الأبعاد، DIHM يمكن أن تستخدم أيضا لتوفير الكمية المرحلة على النقيض من الصور 13، ولكن هذا خارج نطاق المناقشة هنا. الصور DIHM البيانات الخام هي ثنائية الأبعاد، وفي بعض النواحي تبدو وكأنها صور المجهر القياسية، وإن كان خارج التركيز. والفرق الرئيسي بين DIHM ومعيار المجهر حقل مشرق يكمن في حلقات حيود التي تحيط الأجسام طن مجال الرؤية، وهذه هي نتيجة لطبيعة الإضاءة. يتطلب DIHM مصدر أكثر تماسكا من حقل مشرق - عادة ما يكون LED أو ليزر. حلقات حيود في صورة ثلاثية الأبعاد تحتوي على المعلومات الضرورية لإعادة بناء صورة ثلاثية الأبعاد. هناك نوعان من الأساليب الرئيسية لتفسير البيانات DIHM؛ المباشر المناسب وإعادة تركيز العددية. النهج الأول هو المعمول بها في الحالات التي يعرف الشكل الرياضي للنمط حيود مقدما 3،4؛ يتحقق هذا الشرط من قبل حفنة صغيرة من أشياء بسيطة مثل المجالات، واسطوانات، والعقبات نصف الطائرة. تركيب المباشرة ينطبق أيضا في الحالات التي يعرف الموقف المحوري للكائن، والصورة يمكن تركيبها باستخدام ننظر إلى أعلى الجدول من القوالب صورة 14. النهج الثاني (إعادة تركيز العددية) بل هي أعم وتعتمد على استخدام حلقات حيود في صورة ثلاثية الأبعاد ثنائي الأبعاد لإعادة بناء المجال البصري عدديا فيعدد من طائرات التنسيق (متباعدة بشكل تعسفي) في جميع أنحاء حجم العينة. توجد العديد من الطرق ذات الصلة للقيام بذلك 6؛ يستخدم هذا العمل رايلي-سمرفلد الظهر تقنية إكثار كما وصفها لي وجرير 5. نتائج هذا الإجراء هو كومة من الصور التي تحاكي تأثير تغيير البؤري المجهر (ومن هنا جاء اسم `إعادة تركيز العددية &#39;) يدويا. مرة واحدة تم إنشاؤها كومة من الصور، يجب الحصول على موقف من هذا الموضوع في الحجم البؤري. ، وقد تم عرض عدد من الاستدلال تحليل الصور، مثل التباين كثافة المحلية أو محتوى التردد المكاني لتحديد من حدة التركيز في نقاط مختلفة في العينة 15. في كل حالة، عندما يتم تكبير الصورة متري معين (أو التقليل منها)، ويعتبر الكائن ليكون في التركيز. خلافا لغيرها من البرامج التي تسعى إلى تحديد المستوى البؤري خاص حيث هو كائن &quot;في التركيز&quot;، وطريقة في هذا العمل يختار من عoints التي تقع داخل الكائن من الفائدة، والتي قد تمتد عبر مجموعة واسعة من طائرات التنسيق. هذا النهج ينطبق على طائفة واسعة من المواضيع ومناسبة خاصة للمدد، وعينات من نثر ضعيفة (كائنات المرحلة)، مثل الغرويات على شكل قضيب، وسلاسل من البكتيريا أو سياط حقيقية النواة. في مثل هذه العينات يغير الصورة النقيض عندما يمر جسم من خلال البؤري؛ صورة امتبائر بها مركز الضوء إذا كان الكائن على جانب واحد من الطائرة ومركز التنسيق الظلام إذا كان من جهة أخرى. كائنات مرحلة نقية ليس لديهم أي النقيض عندما تقع بالضبط في المستوى البؤري. وقد تمت مناقشة هذه الظاهرة من انعكاس على النقيض من قبل مؤلفين آخرين 16،17 هو في نهاية المطاف وبسبب المرحلة GOUY الشذوذ 18. وقد تم وضع هذا على أساس أكثر صرامة في سياق تصوير ثلاثي الأبعاد في أي مكان آخر، حيث يتم تقييم حدود التقنية، وعدم اليقين في موقف نموذجي هو من أجل من 150 نانومتر (ما يقرب من واحد بكسل) في مجموعة شرق افريقياح 19 اتجاه. على طريقة GOUY مرحلة الشذوذ هو واحد من عدد قليل من مخططات DIHM واضحة المعالم لتحديد بنية الكائنات الموسعة في ثلاثة أبعاد، ولكن مع ذلك بعض الكائنات هي إشكالية لإعادة بناء. الكائنات التي تقع مباشرة على طول المحور البصري (مشيرا في الكاميرا) يصعب إعادة بناء بدقة؛ الشكوك في طول وموضع الكائن تصبح كبيرة. هذا القيد هو في جزء منه نتيجة لعمق بت محدود من وحدات البكسل تسجيل الهولوغرام (عدد مستويات الرمادي المتميزة التي يمكن أن تسجل الكاميرا). يحدث التكوين إشكالية أخرى عند موضع اهتمام هو قريب جدا من المستوى البؤري. في هذه الحالة، يتم بناؤها الصور الحقيقية والافتراضية للكائن على مقربة، مما أدى إلى الحقول البصرية المعقدة التي يصعب تفسيرها. ثانيا، والقلق قليلا أقل أهمية هنا هو أن هامش حيود الناتجة تشغل أقل من صورة الاستشعار، وهذا الوقود النووي المشع الحبيبات الخشنةormation يؤدي إلى إعادة بناء ذات جودة الفقيرة. في الممارسة العملية، يتم تطبيق مرشح التدرج إلى وحدات تخزين بسيطة أعيد بناؤها ثلاثي الأبعاد للكشف عن ظاهرة الانقلاب كثافة قوية على طول اتجاه الإضاءة. المناطق التي يتغير بسرعة شدة من الضوء إلى الظلام، أو العكس، ثم يتم المرتبطة المناطق نثر. موصوفة جيدا الأجسام نثر ضعيفة، كمجموعة noninteracting من هذه العناصر 20، وهذه المساهمات الفردية المبلغ لإعطاء مجموع الحقل متناثرة الذي هو مقلوب بسهولة باستخدام رايلي-سمرفلد أسلوب ظهر الانتشار. في هذه الورقة، يتم تطبيق كثافة المحوري تقنية الانحدار إلى سلسلة من الخلايا العقدية. أجسام الخلايا هي كائنات المرحلة (الأنواع كولاي ديها معامل الانكسار قياس 21 ليكون 1.384 في الطول الموجي λ = 589 نانومتر؛ من المرجح أن تكون مماثلة سلالة العقدية) وتبدو وكأنها سلسلة عالية الكثافة من النقط المتصلة في اله حجم العينة بعد التصفية التدرج تم تطبيقه. عتبة وميزة أساليب الاستخراج القياسية المطبقة على وحدة التخزين هذه تصفيتها تسمح استخراج بكسل الحجمي (voxels) المقابلة لمنطقة داخل الخلايا. وهناك ميزة خاصة لهذا الأسلوب هو أنه يتيح إعادة الإعمار لا لبس فيه من موقف كائن في الاتجاه المحوري. أساليب مماثلة (على الأقل، وتلك التي الهولوغرام سجل على مقربة من وجوه، من خلال تصويرها الهدف المجهر) يعانون من عدم القدرة على تحديد علامة على هذا النزوح. على الرغم من أن طريقة إعادة الإعمار رايلي-سمرفلد هو أيضا التوقيع مستقلة في هذا المعنى، فإن عملية التدرج يتيح لنا أن تميز بين الكائنات المرحلة ضعيفة فوق وتحت المستوى البؤري.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="780">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:180px;">Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope</td>
			<td style="width:187px;">Nikon Corp.</td>
			<td style="width:147px;"> </td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:180px;">LED</td>
			<td style="width:187px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:147px;">M660L3</td>
			<td style="width:267px;">emission wavelength &#955;=660 nm, linewidth approximately 20 nm </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:180px;">LED power supply</td>
			<td style="width:187px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:147px;">LEDD1B</td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:180px;">Thread Adapter</td>
			<td style="width:187px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:147px;">SM2T2</td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:180px;">Thread Adapter</td>
			<td style="width:187px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:147px;">SM1A2</td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:180px;">Frame Grabber board</td>
			<td style="width:187px;">EPIX </td>
			<td style="width:147px;">PIXCI E4 </td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:180px;">High-Speed CMOS camera</td>
			<td style="width:187px;">Mikrotron</td>
			<td style="width:147px;">MC-1362</td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

digital inline holographic microscopy (dihm) of weakly-scattering subjects

كائنات نثر ضعيفة، مثل الجسيمات الغروية الصغيرة ومعظم الخلايا البيولوجية، كثيرا ما واجه في المجهر. في الواقع، تم تطوير مجموعة من التقنيات لتصور أفضل هذه الكائنات المرحلة؛ الطوري ومدينة دبي للإنترنت هي من بين الأساليب الأكثر شعبية لتعزيز التباين. ومع ذلك، وتسجيل موقف والشكل في الاتجاه خارج التصوير الطائرة لا تزال صعبة. يقدم هذا التقرير المنهج التجريبي بسيطة لتحديد دقيق لمكان وهندسة الكائنات في ثلاثة أبعاد، وذلك باستخدام المجهر مضمنة الرقمية الثلاثية الأبعاد (DIHM). بشكل عام، يتم تعريف حجم العينة الوصول إليها عن طريق حجم مستشعر الكاميرا في الاتجاه الجانبي، وتماسك الإضاءة في الاتجاه المحوري. وتتراوح أحجام عينة نموذجية من 200 ميكرون × 200 ميكرون × 200 ميكرون باستخدام الإضاءة LED، ل5 مم × 5 مم × 5 مم أو أكبر باستخدام إضاءة الليزر. يتم تكوين هذا الضوء الإضاءة بحيث موجات الطائرة هي الحادثة على العينة. الكائنات في حجم العينة ثم تبعثر الضوء، والتي تتعارض مع ضوء unscattered لتشكيل أنماط التدخل عمودي على اتجاه الإضاءة. هذه الصورة (الهولوغرام) يحتوي على المعلومات المطلوبة لإعادة الإعمار عمق ثلاثي الأبعاد، ويمكن أن يتم القبض على جهاز التصوير القياسية مثل CMOS أو كاميرا CCD. يعمل على رايلي-سمرفلد طريقة الانتشار مرة أخرى إلى إعادة تركيز عدديا الصور المجهر، والكشف عن مجريات الأمور التصوير البسيط القائم على المرحلة GOUY الشذوذ يستخدم لتحديد نثر الكائنات ضمن حجم أعيد بناؤها. النتائج هذه الطريقة بسيطة ولكنها قوية في لا لبس فيها، خالية من نموذج قياس موقع وشكل الأشياء في عينات مجهرية.

للتدليل على قدرات DIHM، أجريت التجارب على سلسلة من البكتيريا العقدية. سلسلة نفسها قياس 10.5 مم طويل، وكان يتألف من 6-7 خلايا اسطوانية الكروية (اثنين من الخلايا في سلسلة هي قريبة من تقسيم) بأقطار في نطاق 0،6-1 ميكرون. أرقام 1A 1B وتظهر الواجهة الرئيسية إعادة الإعم?...

Watch this Scientific Journal Video about Digital Inline Holographic Microscopy DIHM of Weakly-scattering Subjects at JoVE.com

Digital Inline Holographic Microscopy DIHM of Weakly-scattering Subjects

المواقع الثلاثة الأبعاد للأجسام نثر ضعيفة ويمكن تحديدها بشكل فريد باستخدام مضمنة الرقمية المجهر الثلاثية الأبعاد (DIHM)، والذي ينطوي على تعديلات طفيفة على المجهر القياسية. برنامجنا يستخدم ارشادي التصوير بسيطة إلى جانب رايلي-سمرفلد العودة الانتشار لانتاج موقف ثلاثي الأبعاد والهندسة لكائن المرحلة المجهرية.

الرقمية المضمنة المجسم مجهرية (DIHM) من الموضوعات وكلي نثر

Weakly-scattering objects, such as small colloidal particles and most biological cells, are frequently encountered in microscopy. Indeed, a range of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Digital Inline Holographic Microscopy (DIHM) of Weakly-scattering Subjects

Determining heat and mechanical pain threshold in inflamed skin of human subjects

تحديد حرارة والميكانيكية عتبة الألم في الجلد ملتهبة من الموضوعات البشرية

In a previous article in the Journal of Visualized Experiments we have demonstrated skin microdialysis techniques for the collection of tissue-specific ...

Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing

الرقمية على microfluidics لتصنيع البروتين الآلي

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

الوقت الفاصل بين التصوير من الانقسام الميتوزي بعد ترنسفكأيشن سيرنا

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

في الجسم الحي تتبع نسيلي من الخلايا الجذعية المكونة للدم والسلف تميزت خمسة البروتينات الفلورية باستخدام الميكروسكوب متحد البؤر وMultiphoton

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

في فيفو تتبع 4 الأبعاد للالجذعية المكونة للدم والسلف الكبار في خلايا الفأر قبي نخاع العظم

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

قراءات السائبة بسيطة الرقمية نوكليك حمض الكمي فحوصات

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

مغناطيسية تنشيط الخلية فرز الاستراتيجيات الرامية إلى عزل وتنقية الزليلي المستمدة من سائل الخلايا الجذعية الوسيطة من طراز الأرنب

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

Micron-scale Phenotyping Techniques of Maize Vascular Bundles Based on X-ray Microcomputed Tomography

تقنيات Phenotyping ميكرون-مقياس الذرة حزم وعائية استناداً إلى التصوير المقطعي بالأشعة السينية ميكروكومبوتيد

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

إعداد العينات البيولوجية بالتجميد ذات الضغط العالي، وتعزيز النقيض ساعدت الموجات الدقيقة، والحد الأدنى راتنج التضمين لتصوير حجم

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...