Name: digital inline holographic microscopy (dihm) of weakly-scattering subjects
Uploaded: 2014-02-08T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Digital Inline Holographic Microscopy DIHM of Weakly-scattering Subjects at JoVE.com

Forfatterne takker Linda Turner for at få hjælp med det mikrobiologiske forberedelse. RZ og LGW blev finansieret af Rowland Institute på Harvard og CGB blev finansieret som en CAPES Fondens lærd, Science Uden Grænser Program, Brasilien (Process # 7340-11-7)

1.. Opsætning og dataopsamling <ol><li> Dyrk en kultur af Streptococcus stamme V4051-197 (glat svømning) celler i KTY mediet fra frossen lager 22. Inkuberes i et roterende rysteapparat natten over ved 35 ° C og 150 rpm, til mætning. </li><li> Podes 10 ml frisk KTY medium med 500 ul af mættet kultur. Inkuberes i yderligere 3,5 timer ved 35 ° C og 150 rpm, indtil cellerne når en optisk densitet på ca 1,0 ved λ = 600 nm (ca. 5 x 10 8 celler / ml). </li><li> Fortyndes 1:400 i frisk ...

<ol>
	<li>Xu, W., Jericho, M. H., Meinertzhagen, I. A., Kreuzer, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+in-line+holography+for+biological+applications.">Digital in-line holography for biological applications.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (20), 11301-11305 (2001).</li><li>Sheng, J., Malkiel, E., Katz, J., Adolf, J., Belas, R., Place, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+holographic+microscopy+reveals+prey-induced+changes+in+swimming+behavior+of+predatory+dinoflagellates.">Digital holographic microscopy reveals prey-induced changes in swimming behavior of predatory dinoflagellates.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 17512-17517 (2007).</li><li>Lee, S. H., Roichman, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+and+tracking+single+colloidal+particles+with+video+holographic+microscopy.">Characterizing and tracking single colloidal particles with video holographic microscopy.</a> Opt. Express. 15 (26), 18275-18282 (2007).</li><li>Fung, J., Martin, K. E., Perry, R. W., Katz, D. M., McGorty, R., Manoharan, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+translational,+rotational,+and+vibrational+dynamics+in+colloids+with+digital+holographic+microscopy.">Measuring translational, rotational, and vibrational dynamics in colloids with digital holographic microscopy.</a> Opt. Express. 19 (9), 8051-8065 (2011).</li><li>Lee, S. H., Grier, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Holographic+microscopy+of+holographically+trapped+three-dimensional+structures.">Holographic microscopy of holographically trapped three-dimensional structures.</a> Opt. Express. 15 (4), 1505-1512 (2007).</li><li>Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+techniques+of+digital+holographic+microscopy.">Principles and techniques of digital holographic microscopy.</a> SPIE Rev. 1, 018005 (2010).</li><li>Corkidi, G., Taboada, B., Wood, C. D., Guerrero, A., Darszon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+sperm+in+three-dimensions.">Tracking sperm in three-dimensions.</a> Biochem. Biophys. Res. Comm. 373, 125-129 (2008).</li><li>Santi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+Sheet+Fluorescence+Microscopy+:+A+Review.">Light Sheet Fluorescence Microscopy : A Review.</a> J. Histochem. Cytochem. 59, 129-138 (2011).</li><li>van Blaaderen, A., Wiltzius, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Real-Space Structure of Colloidal Hard-Sphere Glasses. Science. 270, 1177-1179 (1990).</li><li>Besseling, R., Weeks, E. R., Schofield, A. B., Poon, W. C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Imaging+of+Colloidal+Glasses+under+Steady+Shear.">Three-Dimensional Imaging of Colloidal Glasses under Steady Shear.</a> Phys. Rev. Lett. 99, 028301 (2007).</li><li>Schall, P., Weitz, D., Spaepen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Rearrangements+That+Govern+Flow+in+Colloidal+Glasses.">Structural Rearrangements That Govern Flow in Colloidal Glasses.</a> Science. 318, 1895-1899 (2007).</li><li>Rosen, J., Brooker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+incoherent+color+holography.">Fluorescence incoherent color holography.</a> Opt. Exp. 15, 2244-2250 (2007).</li><li>Jericho, M. H., Kreuzer, H. J., Kanka, M., Riesenberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+phase+and+refractive+index+measurements+with+point-source+digital+in-line+holographic+microscopy.">Quantitative phase and refractive index measurements with point-source digital in-line holographic microscopy.</a> Appl. Opt. 51 (10), 1503-1515 (2012).</li><li>Mudanyali, O., Erlinger, A., Seo, S., Su, T., Ozcan, D. T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lensless+On-chip+Imaging+of+Cells+Provides+a+New+Tool+for+High-throughput+Cell-Biology+and+Medical.">Lensless On-chip Imaging of Cells Provides a New Tool for High-throughput Cell-Biology and Medical.</a> J. Vis. Exp. 34, (2009).</li><li>Langehanenberg, P., Kemper, B., Dirksen, D., von Bally, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autofocusing+in+digital+holographic+phase+contrast+microscopy+on+pure+phase+objects+for+live+cell+imaging.">Autofocusing in digital holographic phase contrast microscopy on pure phase objects for live cell imaging.</a> Appl. Opt. 47 (19), (2008).</li><li>Elliot, M. S., Poon, W. C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conventional+optical+microscopy+of+colloidal+suspensions.">Conventional optical microscopy of colloidal suspensions.</a> Adv. Coll. Interf. Sci. 92, 133-194 (2001).</li><li>Agero, U., Monken, C. H., Ropert, C., Gazzinelli, R. T., Mesquita, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+fluctuations+studied+with+defocusing+microscopy.">Cell surface fluctuations studied with defocusing microscopy.</a> Phys. Rev. E. 67, 051904 (2003).</li><li>Born, M., Wolf, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Optics, 6th Ed. , (1998).</li><li>Wilson, L., Zhang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Localization+of+weak+scatterers+in+digital+holographic+microscopy+using+Rayleigh-Sommerfeld+back-propagation.">3D Localization of weak scatterers in digital holographic microscopy using Rayleigh-Sommerfeld back-propagation.</a> Opt. Express. 20, 16735-16744 (2012).</li><li>Bohren, C., Huffman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Absorption and Scattering of Light by Small Particles. , (1983).</li><li>Balaev, A. E., Dvoretski, K. N., Doubrovski, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refractive+index+of+escherichia+coli+cells.">Refractive index of escherichia coli cells.</a> Saratov Fall Meeting 2001: Optical Technologies in Biophysics and Medicine III. 4707 (1), 253-260 (2002).</li><li>Berg, H. C., Manson, M. D., Conley, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+and+Energetics+of+Flagellar+Rotation+in+Bacteria.">Dynamics and Energetics of Flagellar Rotation in Bacteria.</a> Symp. Soc. Exp. Biol. 35, 1-31 (1982).</li><li>Garcia-Sucerquia, J., Xu, W., Jericho, S. K., Klages, P., Jericho, M. H., Kreuzer, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+in-line+holographic+microscopy.">Digital in-line holographic microscopy.</a> Appl. Optics. 45 (5), 836-850 (2006).</li><li>Restrepo, J. F., Garcia-Sucerquia, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnified+reconstruction+of+digitally+recorded+holograms+by+Fresnel-Bluestein+transform.">Magnified reconstruction of digitally recorded holograms by Fresnel-Bluestein transform.</a> Appl. Optics. 49 (33), 6430-6435 (2010).</li><li>Dubois, F., Joannes, L., Legros, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+three-dimensional+imaging+with+a+digital+holography+microscope+with+a+source+of+partial+spatial+coherence.">Improved three-dimensional imaging with a digital holography microscope with a source of partial spatial coherence.</a> Appl. Optics. 38 (34), 7085-7094 (1999).</li><li>Kanka, M., Riesenberg, R., Petruck, P., Graulig, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+(NA=0.8)+in+lensless+in-line+holographic+microscopy+with+glass+sample+carriers.">High resolution (NA=0.8) in lensless in-line holographic microscopy with glass sample carriers.</a> Opt. Lett. 36 (18), 3651-3653 (2011).</li><li>Dubois, F., Requena, M. L., Minetti, C., Monnom, O., Istasse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+spatial+coherence+effects+in+digital+holographic+microscopy+with+a+laser+source.">Partial spatial coherence effects in digital holographic microscopy with a laser source.</a> Appl. Optics. 43 (5), 1131-1139 (2004).</li><li>Magariyama, Y., Sugiyama, S., Muramoto, K., Kawagishi, I., Imae, Y., Kudo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+measurement+of+bacterial+flagellar+rotation+rate+and+swimming+speed.">Simultaneous measurement of bacterial flagellar rotation rate and swimming speed.</a> Biophysical Journal. 69 (5), 2154-2162 (1995).</li><li>Berg, H. C., Brown, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+in+Escherichia+coli+analysed+by+three-dimensional+tracking.">Chemotaxis in Escherichia coli analysed by three-dimensional tracking.</a> Nature. 239 (5374), 500-504 (1972).</li><li>Brooker, G., Siegel, N., Wang, V., Rosen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+resolution+in+Fresnel+incoherent+correlation+holographic+fluorescence+microscopy.">Optimal resolution in Fresnel incoherent correlation holographic fluorescence microscopy.</a> Opt. Express. 19 (6), 5047-5062 (2011).</li></ol>

Det vigtigste skridt i denne eksperimentelle protokol er den præcis indsamling af billeder fra en stabil forsøgsopstilling. Med dårlige baggrundsdata, high fidelity genopbygning er næste umuligt. Det er også vigtigt at undgå objektivlinser med en intern fasekontrast element (synlig som et mørkt annulus, når man ser gennem bagsiden af ​​målet), da dette kan forringe rekonstruerede billede. Formålet med interesse bør være langt nok fra brændplanet at nogle få par af diffraktion frynser er synlige i sit i...

Digital inline holografisk mikroskopi (DIHM) giver mulighed for hurtig tre-dimensionelle billeder af mikroskopiske prøver, såsom svømning mikroorganismer 1,2 og bløde stof systemer 3,4, med minimal modifikation til en standard mikroskop setup. I dette papir gives en pædagogisk demonstration af DIHM, centreret omkring software udviklet i vores laboratorium. Dette papir indeholder en beskrivelse af, hvordan du opsætter mikroskopet, optimere datafangst, og behandle de optagede billeder til rekonstruere tredimensionelle data. Den software (delvist baseret på software udviklet af GD Grier og andre 5), og Billederne er frit tilgængelige på vores hjemmeside. Der gives en beskrivelse af de nødvendige skridt for at konfigurere mikroskopet rekonstruere tredimensionelle mængder fra hologrammer og gør de resulterende mængder af interesse ved hjælp af en gratis raytracing softwarepakke. Artiklen slutter med en diskussion af faktorer, der påvirker kvaliteten af ​​genopbygning, Og en sammenligning af DIHM med konkurrerende metoder. Selvom DIHM blev beskrevet for nogen tid siden (for en generel gennemgang af sine principper og udvikling, se Kim 6), har den nødvendige computerkraft og billedbehandling ekspertise hidtil stort set begrænset brugen til specialiserede forskergrupper med fokus på instrument udvikling. Denne situation ændrer sig i lyset af de seneste fremskridt inden for computer-og kamera-teknologi. Moderne stationære computere kan nemt klare behandling og krav til opbevaring af data; CCD-eller CMOS-kameraer er til stede i de fleste mikroskopi laboratorier, og den nødvendige software bliver gjort frit tilgængelige på internettet af grupper, der har investeret tid i at udvikle teknikken. Der er blevet foreslået forskellige ordninger til afbildning af konfigurationen af ​​mikroskopiske objekter i en tredimensionel prøvevolumen. Mange af disse er scanning teknikker 7,8, hvor en stabel af billeder er optaget af mechanically oversætte billedplanet gennem prøven. Konfokal fluorescens mikroskopi er måske den mest kendte eksempel. Typisk er et fluorescerende farvestof tilsættes til en fase objekt for at opnå et acceptabelt niveau af prøve kontrast og konfokal arrangement bruges til rumligt lokalisere fluorescerende emission. Denne metode har ført til betydelige fremskridt, for eksempel i kolloid videnskab, hvor det har givet adgang til de tre-dimensionelle dynamik overfyldte systemer 9-11. Brugen af ​​mærkningen er en vigtig forskel mellem fluorescens konfokal mikroskopi og DIHM, men andre elementer i de to teknikker er værd at sammenligne. DIHM har en betydelig hastighed fordel, at apparatet ikke har nogen bevægelige dele. De mekaniske scanning spejle i konfokal systemer placerer en øvre grænse for datafangst sats - typisk omkring 30 billeder / sek for en 512 x 512 pixel billede. En stak af sådanne billeder fra forskellige fokale planer kan opnås ved fysisk translating prøven scenen eller objektiv mellem rammer, der fører til et endeligt fange på omkring ét volumen pr sekund for en 30 rammestak. Til sammenligning kan et holografisk system baseret på en moderne CMOS kamera indfange 2.000 billeder / sek ved samme billedstørrelse og opløsning hver frame behandles `offline &#39;at give en uafhængig øjebliksbillede af prøvens volumen. At gentage: kræves ikke fluorescerende prøver til DIHM, selvom et system er blevet udviklet, der udfører holografisk rekonstruktion af et fluorescerende emne 12. Samt tre-dimensionelle information volumen kan DIHM også bruges til at give kvantitative fasekontrast billeder 13, men det er uden for rammerne af diskussionen her. Raw DIHM data billeder er to-dimensionelle, og i nogle henseender ligner standard mikroskop billeder, omend ude af fokus. Den væsentligste forskel mellem DIHM og standard lysfeltmikroskopi ligger i diffraktion ringe, der omgiver objekter in synsfeltet, og disse er på grund af karakteren af ​​belysningen. DIHM kræver en mere sammenhængende kilde end lyse felt - typisk en LED eller laser. De diffraktion ringe i hologrammet indeholde de nødvendige oplysninger til at rekonstruere et tredimensionelt billede. Der er to primære tilgange til tolkning DIHM data, direkte montering og numerisk Nyt fokus. Den første metode er anvendelig i tilfælde, hvor den matematiske form diffraktionsmønstret er kendt på forhånd, 3,4, denne betingelse er opfyldt af en lille håndfuld enkle genstande som kugler, cylindre, og halv-plane forhindringer. Direkte montering gælder også i tilfælde, hvor objektets aksial position er kendt, og billedet kan monteres ved hjælp af en look-up tabel billedfiler skabeloner 14. Den anden metode (numerisk refokusering) er noget mere generelt og er afhængig af hjælp af diffraktion ringene i det todimensionale hologram billede til numerisk rekonstruere det optiske felt påen række (vilkårligt fordelte) brændplaner hele prøvevolumen. Der findes flere tilhørende metoder til at gøre dette 6; dette arbejde bruger Rayleigh-Sommerfeld tilbage formering teknik som beskrevet af Lee og Grier 5.. Resultatet af denne procedure er en stak billeder, der kopierer effekten af ​​manuelt at ændre mikroskop fokusplan (deraf navnet `numeriske refokusering&quot;). Når en stak billeder er blevet genereret, skal motivets placering i centrum volumen opnås. Et antal billedanalyse heuristikker, såsom lokal intensitet varians eller indhold rumlig frekvens, er blevet præsenteret for kvantificere skarpheden af fokus på forskellige punkter i prøven 15. I hvert tilfælde, når et bestemt billede metrisk er maksimeret (eller minimeret), er det objekt, anses for at være i fokus. I modsætning til andre ordninger, der søger at identificere en bestemt fokalplan hvor en genstand er &quot;i fokus&quot;, metoden i dette arbejde henter ud points, der ligger inde i objektet af interesse, som kan strække sig over en bred vifte af fokusplaner. Denne fremgangsmåde er anvendelig for en bred vifte af fag og er især velegnet til forlænget, svagt spredning prøver (fase objekter), såsom stavformede kolloider, kæder af bakterier eller eukaryot flageller. I sådanne prøver ændrer billedets kontrast, når genstanden passerer gennem brændplanet, en sløret billede har en lys center hvis objektet er på den ene side af brændplanet og en mørk center, hvis det er på den anden. Pure fase objekter har lidt at ingen kontrasten, når de ligger netop i brændplanet. Dette fænomen kontrast inversion er blevet diskuteret af andre forfattere 16,17 og er i sidste ende skyldes den Gouy fase anomali 18. Dette er blevet sat på en mere stringent fod i forbindelse med holografi andetsteds, hvor grænserne for teknik evalueres, den typiske usikkerhed i position er i størrelsesordenen 150 nm (ca. én pixel) i EACh retning 19.. Den Gouy fase anomali metode er en af ​​de få veldefinerede DIHM ordninger til bestemmelse af strukturen af ​​udvidede objekter i tre dimensioner, men ikke desto mindre nogle objekter er problematisk at rekonstruere. Objekter, der ligger direkte langs den optiske akse (peger på kameraet) er vanskelig at rekonstruere nøjagtigt, at usikkerhed i længden og positionen af ​​objektet bliver store. Denne begrænsning er dels på grund af den begrænsede bit dybde af pixels optager hologrammet (antallet af forskellige gråtoner, at kameraet kan optage). Et andet problematisk konfiguration opstår, når genstanden af ​​interesse er meget tæt til brændplanet. I dette tilfælde er de reelle og virtuelle billeder af objektet rekonstrueret i umiddelbar nærhed, hvilket giver anledning til komplicerede optiske felter, der er vanskelige at fortolke. En anden, lidt mindre vigtig bekymring her er, at de resulterende diffraktion frynser optager mindre af billedsensoren, og dette grovere kornet information fører til en dårligere kvalitet genopbygning. I praksis er en simpel gradient filter anvendt tredimensionelle rekonstruerede volumener til at opdage stærke intensitet inversioner langs belysning retning. Områder, hvor intensitet skifter hurtigt fra lys til mørk, eller omvendt, bliver så forbundet med spredning regioner. Svagt-spredning objekter er godt beskrevet som en vekselvirkende samling af sådanne elementer 20; disse individuelle bidrag sum for at give den totale spredte område, der er nemt vendes ved hjælp af Rayleigh-Sommerfeld tilbage formering metode. I dette papir, er den aksiale intensitet gradient teknik anvendt til en kæde af Streptococcus-celler. Cellen organer er fase objekter (arten E. coli har et brydningsindeks målt 21 til at være 1.384 ved en bølgelængde λ = 589 nm; Streptococcus stammen sandsynligvis være lignende) og fremstår som en høj intensitet kæde af forbundne klatter i the prøvevolumen efter gradientfiltret er blevet anvendt. Standard tærskel-og feature extraction, der anvendes for det filtrerede volumen tillader udvinding af volumetriske pixels (voxels) svarende til regionen inde i cellerne. En særlig fordel ved denne metode er, at den muliggør entydig rekonstruktion af et objekts position i den aksiale retning. Lignende metoder (i det mindste de at pladeselskaberne hologrammer tæt på objektet, filmede gennem et mikroskop målsætning) lider af at være i stand til at bestemme tegnet af denne forskydning. Selvom Rayleigh-Sommerfeld genopbygning metode er også tilmelde uafhængige i den forstand, hældning operation tillader os at skelne mellem svage fase objekter over og under brændplanet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="780">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:180px;">Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope</td>
			<td style="width:187px;">Nikon Corp.</td>
			<td style="width:147px;"> </td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:180px;">LED</td>
			<td style="width:187px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:147px;">M660L3</td>
			<td style="width:267px;">emission wavelength &#955;=660 nm, linewidth approximately 20 nm </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:180px;">LED power supply</td>
			<td style="width:187px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:147px;">LEDD1B</td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:180px;">Thread Adapter</td>
			<td style="width:187px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:147px;">SM2T2</td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:180px;">Thread Adapter</td>
			<td style="width:187px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:147px;">SM1A2</td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:180px;">Frame Grabber board</td>
			<td style="width:187px;">EPIX </td>
			<td style="width:147px;">PIXCI E4 </td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:180px;">High-Speed CMOS camera</td>
			<td style="width:187px;">Mikrotron</td>
			<td style="width:147px;">MC-1362</td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

digital inline holographic microscopy (dihm) of weakly-scattering subjects

Svagt-spredning genstande, såsom små kolloide partikler og de fleste biologiske celler, ofte stødt på mikroskopi. Faktisk har en række teknikker er udviklet til bedre at visualisere disse fase objekter fasekontrast og DIC er blandt de mest populære metoder til at øge kontrasten. Men optagelse stilling og form i out-of-imaging-plane retning forbliver udfordrende. Denne rapport introducerer en simpel eksperimentel metode til præcist at bestemme placeringen og geometri af objekter i tre dimensioner, ved hjælp af digital inline holografisk mikroskopi (DIHM). Groft sagt er den tilgængelige prøvevolumen defineret af kameraets sensor størrelse i den laterale retning, og belysningen sammenhæng i den aksiale retning. Typiske prøvevolumener spænder fra 200 um x 200 um x 200 um ved anvendelse af LED-belysning til5 mm x 5 mm x 5 mm eller større ved hjælp af laser belysning. Denne belysning lys er konfigureret, så plane bølger er hændelse på prøven. Objekter i målevoluminet derefter spreder lys, der interfererer med unscattered lys til at danne interferensmønstre vinkelret på belysningen retning. Dette billede (hologrammet) indeholder de oplysninger dybde, der kræves til tredimensionel rekonstruktion, og kan fanges på en standard imaging enhed, såsom en CMOS eller CCD-kamera. Rayleigh-Sommerfeld tilbage formeringsmetode er ansat til at numerisk koncentrere mikroskopbilleder, og en enkel billedbehandling heuristisk baseret på Gouy fasen anomali bruges til at identificere spredning objekter i den rekonstruerede volumen. Denne enkle, men robust metode resulterer i en entydig, model-fri måling af placering og udformning af objekter i mikroskopiske prøver.

For at demonstrere mulighederne i DIHM blev eksperimenter udført på en kæde af Streptococcus bakterier. Selve kæden målte 10,5 mm lang og var sammensat af 6-7 sfærisk-cylindriske celler (to af cellerne i kæden er tæt på at dividere) med diametre i området fra 0,6 til 1 um. Figurerne 1a og 1b viser den primære grænseflade af genopbygningen og rendering software. Eksempler på den numeriske recentrering procedure ses i figur 2, hvor en rumlig båndpas...

Watch this Scientific Journal Video about Digital Inline Holographic Microscopy DIHM of Weakly-scattering Subjects at JoVE.com

Digital Inline Holographic Microscopy DIHM of Weakly-scattering Subjects

De tre-dimensionelle placeringer af svagt spredning objekter kan identificeres entydigt ved hjælp af digital inline holografisk mikroskopi (DIHM), der indebærer en mindre ændring til en standard mikroskop. Vores software bruger en simpel imaging heuristisk kombineret med Rayleigh-Sommerfeld back-propagation til opnåelse af den tredimensionale position og geometri af en mikroskopisk fase objekt.

Digital Inline Holografisk Microscopy (DIHM) af svagt-sprednings Emner

Weakly-scattering objects, such as small colloidal particles and most biological cells, are frequently encountered in microscopy. Indeed, a range of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Digital Inline Holographic Microscopy (DIHM) of Weakly-scattering Subjects

Determining heat and mechanical pain threshold in inflamed skin of human subjects

In a previous article in the Journal of Visualized Experiments we have demonstrated skin microdialysis techniques for the collection of tissue-specific ...

Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Klonale Sporing af hæmatopoietisk stamcelletransplantation og progenitorceller Præget af Fem fluorescerende proteiner ved hjælp af konfokal og multiphoton mikroskopi

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional sporing af hæmatopoietisk stamcelletransplantation og stamcelle i Voksen Mouse calvarie knoglemarv

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Enkel Bulk Udlæsning af digitale Nucleic Acid Kvantificering Analyser

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Magnetisk aktiveret celle sortering strategier for at isolere og rense Synovial væske-afledte mesenkymale stamceller fra en kanin Model

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

Micron-scale Phenotyping Techniques of Maize Vascular Bundles Based on X-ray Microcomputed Tomography

Micron-skala fænotyper teknikker af majs kardiovaskulære bundter baseret på X-ray Microcomputed tomografi

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Biologiske prøveforberedelse højtryks frysebehandling, mikrobølgeovn-assisteret kontrastforbedring og Minimal harpiks indlejring for volumen Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...