Name: digital inline holographic microscopy (dihm) of weakly-scattering subjects
Uploaded: 2014-02-08T17:00:00
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Die Autoren danken Linda Turner für die Unterstützung bei mikrobiologischen Herstellung. RZ und LGW wurden vom Rowland Institute der Harvard und CGB finanziert wurde als CAPES Stiftung Gelehrte, Wissenschaft ohne Grenzen Programm, Brasilien (Verfahren Nr. 7340-11-7) gefördert

1. Setup-und Datenkommunikation <ol><li> Wachsen einer Kultur von Streptococcus-Stamm V4051-197 (glatte Schwimmen) Zellen in KTY Medium aus der Tiefkühl 22. Inkubieren in einem Rundschüttler über Nacht bei 35 ° C und 150 UpM bis zur Sättigung. </li><li> Beimpfen von 10 ml frischem KTY Medium mit 500 &amp;mgr; l der gesättigten Kultur. Inkubation für weitere 3,5 h bei 35 ° C und 150 Upm, bis die Zellen erreichen eine optische Dichte von etwa 1,0 bei λ = 600 nm (etwa 5 x 10 8 Zell...

<ol>
	<li>Xu, W., Jericho, M. H., Meinertzhagen, I. A., Kreuzer, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+in-line+holography+for+biological+applications.">Digital in-line holography for biological applications.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (20), 11301-11305 (2001).</li><li>Sheng, J., Malkiel, E., Katz, J., Adolf, J., Belas, R., Place, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+holographic+microscopy+reveals+prey-induced+changes+in+swimming+behavior+of+predatory+dinoflagellates.">Digital holographic microscopy reveals prey-induced changes in swimming behavior of predatory dinoflagellates.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 17512-17517 (2007).</li><li>Lee, S. H., Roichman, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+and+tracking+single+colloidal+particles+with+video+holographic+microscopy.">Characterizing and tracking single colloidal particles with video holographic microscopy.</a> Opt. Express. 15 (26), 18275-18282 (2007).</li><li>Fung, J., Martin, K. E., Perry, R. W., Katz, D. M., McGorty, R., Manoharan, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+translational,+rotational,+and+vibrational+dynamics+in+colloids+with+digital+holographic+microscopy.">Measuring translational, rotational, and vibrational dynamics in colloids with digital holographic microscopy.</a> Opt. Express. 19 (9), 8051-8065 (2011).</li><li>Lee, S. H., Grier, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Holographic+microscopy+of+holographically+trapped+three-dimensional+structures.">Holographic microscopy of holographically trapped three-dimensional structures.</a> Opt. Express. 15 (4), 1505-1512 (2007).</li><li>Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+techniques+of+digital+holographic+microscopy.">Principles and techniques of digital holographic microscopy.</a> SPIE Rev. 1, 018005 (2010).</li><li>Corkidi, G., Taboada, B., Wood, C. D., Guerrero, A., Darszon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+sperm+in+three-dimensions.">Tracking sperm in three-dimensions.</a> Biochem. Biophys. Res. Comm. 373, 125-129 (2008).</li><li>Santi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+Sheet+Fluorescence+Microscopy+:+A+Review.">Light Sheet Fluorescence Microscopy : A Review.</a> J. Histochem. Cytochem. 59, 129-138 (2011).</li><li>van Blaaderen, A., Wiltzius, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Real-Space Structure of Colloidal Hard-Sphere Glasses. Science. 270, 1177-1179 (1990).</li><li>Besseling, R., Weeks, E. R., Schofield, A. B., Poon, W. C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Imaging+of+Colloidal+Glasses+under+Steady+Shear.">Three-Dimensional Imaging of Colloidal Glasses under Steady Shear.</a> Phys. Rev. Lett. 99, 028301 (2007).</li><li>Schall, P., Weitz, D., Spaepen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Rearrangements+That+Govern+Flow+in+Colloidal+Glasses.">Structural Rearrangements That Govern Flow in Colloidal Glasses.</a> Science. 318, 1895-1899 (2007).</li><li>Rosen, J., Brooker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+incoherent+color+holography.">Fluorescence incoherent color holography.</a> Opt. Exp. 15, 2244-2250 (2007).</li><li>Jericho, M. H., Kreuzer, H. J., Kanka, M., Riesenberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+phase+and+refractive+index+measurements+with+point-source+digital+in-line+holographic+microscopy.">Quantitative phase and refractive index measurements with point-source digital in-line holographic microscopy.</a> Appl. Opt. 51 (10), 1503-1515 (2012).</li><li>Mudanyali, O., Erlinger, A., Seo, S., Su, T., Ozcan, D. T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lensless+On-chip+Imaging+of+Cells+Provides+a+New+Tool+for+High-throughput+Cell-Biology+and+Medical.">Lensless On-chip Imaging of Cells Provides a New Tool for High-throughput Cell-Biology and Medical.</a> J. Vis. Exp. 34, (2009).</li><li>Langehanenberg, P., Kemper, B., Dirksen, D., von Bally, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autofocusing+in+digital+holographic+phase+contrast+microscopy+on+pure+phase+objects+for+live+cell+imaging.">Autofocusing in digital holographic phase contrast microscopy on pure phase objects for live cell imaging.</a> Appl. Opt. 47 (19), (2008).</li><li>Elliot, M. S., Poon, W. C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conventional+optical+microscopy+of+colloidal+suspensions.">Conventional optical microscopy of colloidal suspensions.</a> Adv. Coll. Interf. Sci. 92, 133-194 (2001).</li><li>Agero, U., Monken, C. H., Ropert, C., Gazzinelli, R. T., Mesquita, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+fluctuations+studied+with+defocusing+microscopy.">Cell surface fluctuations studied with defocusing microscopy.</a> Phys. Rev. E. 67, 051904 (2003).</li><li>Born, M., Wolf, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Optics, 6th Ed. , (1998).</li><li>Wilson, L., Zhang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Localization+of+weak+scatterers+in+digital+holographic+microscopy+using+Rayleigh-Sommerfeld+back-propagation.">3D Localization of weak scatterers in digital holographic microscopy using Rayleigh-Sommerfeld back-propagation.</a> Opt. Express. 20, 16735-16744 (2012).</li><li>Bohren, C., Huffman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Absorption and Scattering of Light by Small Particles. , (1983).</li><li>Balaev, A. E., Dvoretski, K. N., Doubrovski, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refractive+index+of+escherichia+coli+cells.">Refractive index of escherichia coli cells.</a> Saratov Fall Meeting 2001: Optical Technologies in Biophysics and Medicine III. 4707 (1), 253-260 (2002).</li><li>Berg, H. C., Manson, M. D., Conley, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+and+Energetics+of+Flagellar+Rotation+in+Bacteria.">Dynamics and Energetics of Flagellar Rotation in Bacteria.</a> Symp. Soc. Exp. Biol. 35, 1-31 (1982).</li><li>Garcia-Sucerquia, J., Xu, W., Jericho, S. K., Klages, P., Jericho, M. H., Kreuzer, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+in-line+holographic+microscopy.">Digital in-line holographic microscopy.</a> Appl. Optics. 45 (5), 836-850 (2006).</li><li>Restrepo, J. F., Garcia-Sucerquia, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnified+reconstruction+of+digitally+recorded+holograms+by+Fresnel-Bluestein+transform.">Magnified reconstruction of digitally recorded holograms by Fresnel-Bluestein transform.</a> Appl. Optics. 49 (33), 6430-6435 (2010).</li><li>Dubois, F., Joannes, L., Legros, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+three-dimensional+imaging+with+a+digital+holography+microscope+with+a+source+of+partial+spatial+coherence.">Improved three-dimensional imaging with a digital holography microscope with a source of partial spatial coherence.</a> Appl. Optics. 38 (34), 7085-7094 (1999).</li><li>Kanka, M., Riesenberg, R., Petruck, P., Graulig, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+(NA=0.8)+in+lensless+in-line+holographic+microscopy+with+glass+sample+carriers.">High resolution (NA=0.8) in lensless in-line holographic microscopy with glass sample carriers.</a> Opt. Lett. 36 (18), 3651-3653 (2011).</li><li>Dubois, F., Requena, M. L., Minetti, C., Monnom, O., Istasse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+spatial+coherence+effects+in+digital+holographic+microscopy+with+a+laser+source.">Partial spatial coherence effects in digital holographic microscopy with a laser source.</a> Appl. Optics. 43 (5), 1131-1139 (2004).</li><li>Magariyama, Y., Sugiyama, S., Muramoto, K., Kawagishi, I., Imae, Y., Kudo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+measurement+of+bacterial+flagellar+rotation+rate+and+swimming+speed.">Simultaneous measurement of bacterial flagellar rotation rate and swimming speed.</a> Biophysical Journal. 69 (5), 2154-2162 (1995).</li><li>Berg, H. C., Brown, D. 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Der wichtigste Schritt in diesem Versuchsprotokoll ist die genaue Erfassung von Bildern von einer stabilen experimentellen Aufbau. Bei schlechten Hintergrunddaten, ist High-Fidelity-Rekonstruktion unmöglich. Es ist auch wichtig, Objektivlinsen mit einer internen Phasenkontrastelement (als dunkler Kreisring beim Blick durch die Rückseite des Ziels sichtbar ist) zu vermeiden, da dies das rekonstruierte Bild verschlechtern. Das Objekt des Interesses sollte weit genug von der Brennebene, die ein paar Paare von Beugungsstr...

Inline-Digital-holographische Mikroskopie (Dihm) ermöglicht die schnelle dreidimensionale Bildgebung von mikroskopischen Proben, wie Schwimmen Mikroorganismen 1,2 und Soft Matter 3,4 Systeme mit minimalen Änderungen an einer Standard-Mikroskop-Setup. In diesem Papier eine pädagogische Demonstration Dihm vorgesehen ist, um Software in unserem Labor entwickelt zentriert. Dieses Papier enthält eine Beschreibung, wie Sie das Mikroskop, Optimierung der Datenerfassung und Verarbeitung der aufgenommenen Bilder zu dreidimensionalen Daten zu rekonstruieren. Das Software-und beispielsweise Bilder (zum Teil auf Software von der GD Grier und andere entwickelten fünf) sind auf unserer Website frei verfügbar. Eine Beschreibung der notwendigen Schritte, um das Mikroskop zu konfigurieren, zu rekonstruieren dreidimensionale Volumen von Hologrammen und machen die daraus resultierenden Volumina von Interesse mit einem kostenlosen Ray-Tracing-Software-Paket zur Verfügung gestellt. Der Beitrag schließt mit einer Diskussion der Faktoren, die die Qualität der RekonstruktionUnd ein Vergleich der Dihm mit konkurrierenden Verfahren. Obwohl Dihm wurde vor einiger Zeit beschrieben (für eine allgemeine Überprüfung der Grundlagen und Entwicklung, siehe Kim 6), die erforderliche Rechenleistung und Bildverarbeitung Know-how hat sich bisher weitgehend seine Verwendung an Facharbeitsgruppen mit Fokus auf Instrumentenentwicklung beschränkt. Diese Situation ändert sich im Licht der jüngsten Fortschritte in der Computer-und Kameratechnik. Moderne Desktop-Computer kann problemlos mit der Verarbeitung und Datenspeicheranforderungen zu bewältigen; CCD-oder CMOS-Kameras sind in den meisten Labors Mikroskopie vorhanden ist und die erforderliche Software wird frei verfügbar im Internet von Gruppen, die sich Zeit für die Entwicklung, die Technik investiert haben. Verschiedene Schemata sind für die Abbildung der Konfiguration von mikroskopischen Objekten in einem dreidimensionalen Probenvolumen vorgeschlagen. Viele davon sind 7,8-Scan-Techniken, bei dem ein Stapel von Bildern aufgezeichnet wird, indem mechanically Übersetzen der Bildebene durch die Probe. Konfokalen Fluoreszenzmikroskopie ist vielleicht das bekannteste Beispiel. Typischerweise wird ein Fluoreszenzfarbstoff an ein Phasenobjekt, um ein akzeptables Niveau der Probe Kontrast zu erzielen zugegeben und die konfokalen Anordnung verwendet werden, um räumlich zu lokalisieren Fluoreszenzemission. Dieses Verfahren hat erhebliche Fortschritte, beispielsweise in Kolloid-Wissenschaft, wo es Zugang zu den dreidimensionalen Dynamik voll Systeme 9-11 erlaubt geführt. Die Nutzung der Kennzeichnung ist ein wichtiger Unterschied zwischen der konfokalen Mikroskopie und Fluoreszenz Dihm, aber auch andere Merkmale der beiden Techniken sind ein Vergleich lohnt sich. Dihm hat einen erheblichen Geschwindigkeitsvorteil, dass die Vorrichtung keine beweglichen Teile. Mechanischen Abtastspiegeln in Konfokalsystemen platzieren eine Obergrenze Datenerfassungsrate - typischerweise um 30 Frames / sec für Pixelbild 512 x 512. Ein Stapel solcher Bilder aus verschiedenen Fokusebenen kann durch physikalisches transl erhalten werdentriebs der Probentisch oder Objektivlinse zwischen den Bildern, die zu einer endgültigen Erfassungsrate von etwa einem Volumen pro Sekunde für eine 30-Frame-Stack. Im Vergleich dazu kann ein holographisches System basierend auf einem modernen CMOS-Kamera 2000 Bildern / sec bei der gleichen Bildqualität und Auflösung zu erfassen, wobei jeder Frame &#39;offline&#39; verarbeitet, um eine unabhängige Snapshot des Volumens der Probe zu geben. Um es zu wiederholen: fluoreszierende Proben nicht für Dihm erforderlich, obwohl ein System entwickelt worden, das holographische Rekonstruktion eines fluoreszierenden Gegenstand 12 führt. Sowie dreidimensionaler Volumeninformation, Dihm kann auch verwendet werden, um quantitative Phasenkontrastaufnahmen 13 vorzusehen, aber das ist nicht Gegenstand des hier diskutierten. Raw-Daten Dihm Bilder sind zweidimensional, und in mancher Hinsicht aussehen wie Standard-Mikroskopbilder, wenn auch unscharf. Der Hauptunterschied zwischen Standard-und Dihm Hellfeldmikroskopie liegt in den Beugungsringen umgeben, die Objekte in das Sichtfeld, das sind durch die Art der Beleuchtung. Dihm erfordert eine kohärentere Quelle als helles Feld - in der Regel eine LED oder Laser. Die Beugungsringe im Hologramm enthält die notwendigen Informationen, um ein dreidimensionales Bild zu rekonstruieren. Es gibt zwei Hauptansätze zur Interpretation Dihm Daten; direkte Montage und numerische Neuausrichtung. Der erste Ansatz ist in Fällen, in denen die mathematische Form des Beugungsmusters wird im Voraus bekannt 3,4 anwendbar, wird dieser Zustand durch eine kleine Handvoll einfache Objekte wie Kugeln, Zylinder und Halbebene Scheide. Direkte Montage ist auch in Fällen, in denen das Objekt axialen Position bekannt ist zutreffend, und das Bild kann unter Verwendung einer Look-up-Tabelle von Bildvorlagen 14 ausgestattet werden. Der zweite Ansatz (numerische Refokussierung) ist eher allgemein und beruht auf der Verwendung der Beugungsringe in dem zweidimensionalen Bildhologramm zur numerischen Rekonstruktion des optischen Feldes aneine Anzahl von (willkürlich) beabstandet Brennebenen der gesamten Probenvolumen. Mehrere verwandte Methoden existieren, dies zu tun 6; diese Arbeit verwendet die Rayleigh-Sommerfeld-Back-Propagation-Technik, wie von Lee und Grier 5 beschrieben. Das Ergebnis dieses Verfahrens ist ein Stapel von Bildern, die die Wirkung der Brennebene des Mikroskops (daher der Name `numerische Neuausrichtung &#39;) manuell ändern zu replizieren. Sobald ein Stapel von Bildern erzeugt worden ist, muss die Position des Objekts in der Brennvolumen erhalten werden. Eine Anzahl von Bildanalyseheuristiken, wie lokale Intensitätsvarianz oder räumliche Frequenzgehalt, wurden vorgestellt, um die Bildschärfe an verschiedenen Stellen in der Probe 15 zu quantifizieren. In jedem Fall, wenn ein bestimmtes Bildmetrik maximiert (oder minimiert), wird das Objekt als im Mittelpunkt. Im Gegensatz zu anderen Systemen, die auf eine bestimmte Brennebene, wo sich ein Objekt &quot;im Fokus&quot; identifizieren zu suchen, das Verfahren in dieser Arbeit holt sich punkte, die in das Objekt von Interesse liegen, die in einem breiten Spektrum von Brennebenen erstrecken kann. Dieser Ansatz ist auf ein breites Spektrum von Themen und eignet sich besonders für ausgedehnte, schwach streuenden Proben (Phase-Objekte), wie stabförmige Kolloide, Ketten von Bakterien oder eukaryotischen Flagellen. In diesen Proben ändert sich die Bildkontrast, wenn das Objekt durch die Fokusebene verläuft, eine defokussierte Bild hat ein Lichtzentrum, wenn das Objekt auf einer Seite der Bildebene und einer dunklen Mitte, wenn es auf der anderen. Reine Phasenobjekte haben wenig bis keinen Kontrast, wenn sie genau in der Brennebene liegen. Dieses Phänomen der Kontrastinversion von anderen Autoren 16,17 diskutiert und letztlich aufgrund der Gouy-Phase Anomalie 18. Dies wurde auf einer strengeren berechtigt im Kontext der Holographie setzen an anderer Stelle, wo die Grenzen der Technik ausgewertet, die typische Unsicherheit in der Position ist, in der Größenordnung von 150 nm (ca. ein Pixel) in each Richtung 19. Die Gouy-Phase Anomalie-Methode ist eine der wenigen gut definierten Dihm Systeme zur Bestimmung der Struktur ausgedehnter Objekte in drei Dimensionen, aber dennoch einige Objekte problematisch zu rekonstruieren sind. Objekte, die direkt entlang der optischen Achse (die auf die Kamera) liegen, sind schwierig genau zu rekonstruieren; Unsicherheiten in der Länge und der Position des Objektes groß werden. Diese Einschränkung ist zum Teil auf die eingeschränkte Farbtiefe der Pixel Aufzeichnung des Hologramms (die Anzahl der verschiedenen Graustufen, die die Kamera aufnehmen kann). Ein weiterer problematischer Konfiguration tritt auf, wenn das Objekt von Interesse ist sehr nahe an der Brennebene. In diesem Fall werden die reale und virtuelle Bilder des Objekts in unmittelbarer Nähe wieder aufgebaut, was zu komplizierte optische Felder, die schwer zu interpretieren sind. Eine zweite, etwas weniger wichtiges Anliegen dabei ist, dass die daraus resultierenden Beugungsstreifen besetzen weniger von der Bildsensor, und das gröbere informationen führt zu einer schlechteren Qualität Wiederaufbau. In der Praxis wird ein einfacher Farbverlauf-Filter, um dreidimensionale rekonstruierten Volumen angewendet starke bis Inversionen entlang der Beleuchtungsrichtung zu erkennen. Regionen, in denen Intensitätsänderungen schnell von hell nach dunkel oder umgekehrt, werden dann mit Streubereiche verbunden. Diese einzelnen Beiträge Summe, um die Gesamtstreufeld, das einfach mit dem Rayleigh-Sommerfeld-Backpropagation-Verfahren invertiert geben; schwach streuenden Objekte sowie eine nicht wechselwirkenden Erhebung solcher Elemente 20 beschrieben. In dieser Arbeit wird die axiale Intensitätsverlauf Technik mit einer Kette von Streptococcus Zellen angelegt. Die Zellkörper sind Phasenobjekte (der Spezies E. coli hat einen Brechungsindex, gemessen 21 bis 1,384 bei einer Wellenlänge λ = 589 nm sein, der Streptococcus-Stamm dürfte ähnlich sein) und erscheinen als ein Hochintensität-Kette von verbundenen Blobs the Probenvolumens nach dem Gradienten-Filter aufgebracht wurde. Standard auf diesem gefilterten Volumen angewendet Schwelle und Merkmalsextraktion Methoden ermöglichen die Extraktion von volumetrischen Pixel (Voxel), die der Region in den Zellen. Ein besonderer Vorteil dieses Verfahrens ist, dass es eine eindeutige Rekonstruktion der Position eines Objekts in der axialen Richtung. Ähnliche Verfahren (zumindest diejenigen, die Aufzeichnung von Hologrammen in der Nähe des Objekts durch ein Mikroskopobjektiv abgebildet) leiden darunter, nicht in der Lage, die Zeichen für diese Verschiebung zu bestimmen. Obwohl die Rayleigh-Sommerfeld-Rekonstruktionsverfahren ist auch Zeichen-unabhängige in diesem Sinne ermöglicht die Gradientenbetrieb uns, zwischen schwacher Phasenobjekte oberhalb und unterhalb der Fokusebene zu unterscheiden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="780">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:180px;">Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope</td>
			<td style="width:187px;">Nikon Corp.</td>
			<td style="width:147px;"> </td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:180px;">LED</td>
			<td style="width:187px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:147px;">M660L3</td>
			<td style="width:267px;">emission wavelength &#955;=660 nm, linewidth approximately 20 nm </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:180px;">LED power supply</td>
			<td style="width:187px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:147px;">LEDD1B</td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:180px;">Thread Adapter</td>
			<td style="width:187px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:147px;">SM2T2</td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:180px;">Thread Adapter</td>
			<td style="width:187px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:147px;">SM1A2</td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:180px;">Frame Grabber board</td>
			<td style="width:187px;">EPIX </td>
			<td style="width:147px;">PIXCI E4 </td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:180px;">High-Speed CMOS camera</td>
			<td style="width:187px;">Mikrotron</td>
			<td style="width:147px;">MC-1362</td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

digital inline holographic microscopy (dihm) of weakly-scattering subjects

Schwach streuende Objekte, wie beispielsweise kleine kolloidale Partikel und die meisten biologischen Zellen, sind in der Mikroskopie häufig angetroffen. In der Tat eine Reihe von Techniken entwickelt worden, um diese Phase Objekte besser zu visualisieren, Phasenkontrast und DIC gehören zu den beliebtesten Methoden zur Verbesserung der Kontrast. Jedoch bleibt Aufzeichnungs Position und Form in der Richtung außerhalb der Abbildungsebene herausfordernd. Dieser Bericht stellt eine einfache experimentelle Methode, um die Position und Geometrie der Objekte in drei Dimensionen genau zu bestimmen, mit digitalen Inline-holographische Mikroskopie (Dihm). Grob gesagt, ist die zugängliche Probenvolumen von der Kamera Sensorgröße in der seitlichen Richtung und der Beleuchtungskohärenz in axialer Richtung definiert. Typische Probenvolumina reichen von 200 um x 200 um x 200 um unter Verwendung LED-Beleuchtung, um5 mm x 5 mm x 5 mm oder mehr unter Verwendung von Laserbeleuchtung. Dieses Beleuchtungslicht wird so konfiguriert, daß ebene Wellen treffen auf die Probe. Objekte im Probenvolumen dann streuen Licht, das mit dem nicht gestreuten Licht stört den Interferenzmuster senkrecht zur Beleuchtungsrichtung bilden. Dieses Bild (das Hologramm) enthält den Tiefeninformationen für dreidimensionale Rekonstruktion erforderlich und kann auf einem Standard-Bildgebungsvorrichtung, wie eine CMOS-oder CCD-Kamera aufgenommen werden. Die Rayleigh-Sommerfeld-Backpropagation-Verfahren wird eingesetzt, um numerisch konzentrieren Mikroskopbilder, und eine einfache Heuristik Bildgebung auf der Grundlage der Gouy-Phase Anomalie wird verwendet, um zu identifizieren Streuobjekten im rekonstruierten Volumen. Diese einfache, aber robuste Methode ergibt sich eine eindeutige, Modell freie Messung der Lage und Form von Objekten in mikroskopischen Proben.

Um die Funktionen des Dihm zu demonstrieren, wurden Versuche an einer Kette von Streptococcus-Bakterien durchgeführt. Die Kette selbst gemessen 10,5 mm lang und wurde von 6-7 sphärozylindrische Zellen (zwei der Zellen in der Kette sind in der Nähe Division) mit Durchmessern im Bereich von 0,6 bis 1 um zusammen. 1a und 1b die wichtigste Schnittstelle zeigen des Wiederaufbaus und der Rendering-Software. Beispiele der numerischen Refokussierung Verfahrens sind in Fig. 2...

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Digital Inline Holographic Microscopy DIHM of Weakly-scattering Subjects

Die dreidimensionalen Positionen der schwach streuende Objekte eindeutig mit digitalen Inline holografische Mikroskopie (Dihm), die eine geringfügige Modifikation an einem Standardmikroskop umfasst identifiziert werden. Unsere Software verwendet eine einfache Heuristik Bildgebung verbunden mit Rayleigh-Sommerfeld-Back-Propagation, um die dreidimensionale Position und Geometrie eines mikroskopischen Phasenobjekt zu erhalten.

Digitale Inline Holographic Microscopy (Dihm) von Schwach-Streuung Themen

Weakly-scattering objects, such as small colloidal particles and most biological cells, are frequently encountered in microscopy. Indeed, a range of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Digital Inline Holographic Microscopy (DIHM) of Weakly-scattering Subjects

Determining heat and mechanical pain threshold in inflamed skin of human subjects

Bestimmen Hitze und mechanische Schmerzschwelle in entzündeten Haut von Probanden

In a previous article in the Journal of Visualized Experiments we have demonstrated skin microdialysis techniques for the collection of tissue-specific ...

Forschung

Biologie

Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing

Digitale Mikrofluidik für die automatisierte Verarbeitung Proteomic

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Zeitraffer-Imaging der Mitose Nach siRNA-Transfektion

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Klonale Verfolgung von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen durch Fünf Fluoreszierende Proteine ​​mit Hilfe der konfokalen und Multiphotonen Mikroskopie Markierte

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In-vivo-4-Dimensional-Tracking von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen im erwachsenen Maus Schädeldachknochenmark

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Einfache Massen Auslesen des digitalen Nukleinsäure Quantifizierung Assays

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Magnetische aktiviert Zelle Sortieren Strategien zu isolieren und reinigen Synovial Flüssigkeit abgeleitet mesenchymalen Stammzellen aus einem Kaninchen-Modell

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

Micron-scale Phenotyping Techniques of Maize Vascular Bundles Based on X-ray Microcomputed Tomography

Mikron-Skala Phänotypisierung Techniken der Mais Leitbündel basierend auf Microcomputed Röntgentomographie

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Biologische Probenvorbereitung durch Hochdruck gefrieren, Mikrowellen-gestützte Kontrastverstärkung und minimale Harz einbetten für Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...