Name: digital inline holographic microscopy (dihm) of weakly-scattering subjects
Uploaded: 2014-02-08T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Digital Inline Holographic Microscopy DIHM of Weakly-scattering Subjects at JoVE.com

Forfatterne takker Linda Turner for å få hjelp med den mikrobiologiske forberedelse. RZ og LGW ble finansiert av Rowland Institute ved Harvard og CGB ble finansiert som et CAPES stiftelsens lærd, Science Uten Grenser Program, Brasil (Process # 7340-11-7)

En. Oppsett og Data Acquisition <ol><li> Dyrk en kultur av Streptococcus belastning V4051-197 (glatt svømming) celler i KTY medium fra frossen lager 22. Inkuber i en roterende rystemaskin over natten ved 35 ° C og 150 opm, til metning. </li><li> Inokuler 10 ml av frisk KTY medium med 500 pl av den mettede kultur. Inkuber i ytterligere 3,5 timer ved 35 ° C og 150 opm inntil cellene komme frem til en optisk densitet på ca 1,0 på λ = 600 nm (omtrent 5 x 10 8 celler / ml). </li><li> Fo...

<ol>
	<li>Xu, W., Jericho, M. H., Meinertzhagen, I. A., Kreuzer, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+in-line+holography+for+biological+applications.">Digital in-line holography for biological applications.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (20), 11301-11305 (2001).</li><li>Sheng, J., Malkiel, E., Katz, J., Adolf, J., Belas, R., Place, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+holographic+microscopy+reveals+prey-induced+changes+in+swimming+behavior+of+predatory+dinoflagellates.">Digital holographic microscopy reveals prey-induced changes in swimming behavior of predatory dinoflagellates.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 17512-17517 (2007).</li><li>Lee, S. H., Roichman, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+and+tracking+single+colloidal+particles+with+video+holographic+microscopy.">Characterizing and tracking single colloidal particles with video holographic microscopy.</a> Opt. Express. 15 (26), 18275-18282 (2007).</li><li>Fung, J., Martin, K. E., Perry, R. W., Katz, D. M., McGorty, R., Manoharan, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+translational,+rotational,+and+vibrational+dynamics+in+colloids+with+digital+holographic+microscopy.">Measuring translational, rotational, and vibrational dynamics in colloids with digital holographic microscopy.</a> Opt. Express. 19 (9), 8051-8065 (2011).</li><li>Lee, S. H., Grier, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Holographic+microscopy+of+holographically+trapped+three-dimensional+structures.">Holographic microscopy of holographically trapped three-dimensional structures.</a> Opt. Express. 15 (4), 1505-1512 (2007).</li><li>Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+techniques+of+digital+holographic+microscopy.">Principles and techniques of digital holographic microscopy.</a> SPIE Rev. 1, 018005 (2010).</li><li>Corkidi, G., Taboada, B., Wood, C. D., Guerrero, A., Darszon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+sperm+in+three-dimensions.">Tracking sperm in three-dimensions.</a> Biochem. Biophys. Res. Comm. 373, 125-129 (2008).</li><li>Santi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+Sheet+Fluorescence+Microscopy+:+A+Review.">Light Sheet Fluorescence Microscopy : A Review.</a> J. Histochem. Cytochem. 59, 129-138 (2011).</li><li>van Blaaderen, A., Wiltzius, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Real-Space Structure of Colloidal Hard-Sphere Glasses. Science. 270, 1177-1179 (1990).</li><li>Besseling, R., Weeks, E. R., Schofield, A. B., Poon, W. C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Imaging+of+Colloidal+Glasses+under+Steady+Shear.">Three-Dimensional Imaging of Colloidal Glasses under Steady Shear.</a> Phys. Rev. Lett. 99, 028301 (2007).</li><li>Schall, P., Weitz, D., Spaepen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Rearrangements+That+Govern+Flow+in+Colloidal+Glasses.">Structural Rearrangements That Govern Flow in Colloidal Glasses.</a> Science. 318, 1895-1899 (2007).</li><li>Rosen, J., Brooker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+incoherent+color+holography.">Fluorescence incoherent color holography.</a> Opt. Exp. 15, 2244-2250 (2007).</li><li>Jericho, M. H., Kreuzer, H. J., Kanka, M., Riesenberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+phase+and+refractive+index+measurements+with+point-source+digital+in-line+holographic+microscopy.">Quantitative phase and refractive index measurements with point-source digital in-line holographic microscopy.</a> Appl. Opt. 51 (10), 1503-1515 (2012).</li><li>Mudanyali, O., Erlinger, A., Seo, S., Su, T., Ozcan, D. T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lensless+On-chip+Imaging+of+Cells+Provides+a+New+Tool+for+High-throughput+Cell-Biology+and+Medical.">Lensless On-chip Imaging of Cells Provides a New Tool for High-throughput Cell-Biology and Medical.</a> J. Vis. Exp. 34, (2009).</li><li>Langehanenberg, P., Kemper, B., Dirksen, D., von Bally, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autofocusing+in+digital+holographic+phase+contrast+microscopy+on+pure+phase+objects+for+live+cell+imaging.">Autofocusing in digital holographic phase contrast microscopy on pure phase objects for live cell imaging.</a> Appl. Opt. 47 (19), (2008).</li><li>Elliot, M. S., Poon, W. C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conventional+optical+microscopy+of+colloidal+suspensions.">Conventional optical microscopy of colloidal suspensions.</a> Adv. Coll. Interf. Sci. 92, 133-194 (2001).</li><li>Agero, U., Monken, C. H., Ropert, C., Gazzinelli, R. T., Mesquita, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+fluctuations+studied+with+defocusing+microscopy.">Cell surface fluctuations studied with defocusing microscopy.</a> Phys. Rev. E. 67, 051904 (2003).</li><li>Born, M., Wolf, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Optics, 6th Ed. , (1998).</li><li>Wilson, L., Zhang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Localization+of+weak+scatterers+in+digital+holographic+microscopy+using+Rayleigh-Sommerfeld+back-propagation.">3D Localization of weak scatterers in digital holographic microscopy using Rayleigh-Sommerfeld back-propagation.</a> Opt. Express. 20, 16735-16744 (2012).</li><li>Bohren, C., Huffman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Absorption and Scattering of Light by Small Particles. , (1983).</li><li>Balaev, A. E., Dvoretski, K. N., Doubrovski, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refractive+index+of+escherichia+coli+cells.">Refractive index of escherichia coli cells.</a> Saratov Fall Meeting 2001: Optical Technologies in Biophysics and Medicine III. 4707 (1), 253-260 (2002).</li><li>Berg, H. C., Manson, M. D., Conley, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+and+Energetics+of+Flagellar+Rotation+in+Bacteria.">Dynamics and Energetics of Flagellar Rotation in Bacteria.</a> Symp. Soc. Exp. Biol. 35, 1-31 (1982).</li><li>Garcia-Sucerquia, J., Xu, W., Jericho, S. K., Klages, P., Jericho, M. H., Kreuzer, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+in-line+holographic+microscopy.">Digital in-line holographic microscopy.</a> Appl. Optics. 45 (5), 836-850 (2006).</li><li>Restrepo, J. F., Garcia-Sucerquia, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnified+reconstruction+of+digitally+recorded+holograms+by+Fresnel-Bluestein+transform.">Magnified reconstruction of digitally recorded holograms by Fresnel-Bluestein transform.</a> Appl. Optics. 49 (33), 6430-6435 (2010).</li><li>Dubois, F., Joannes, L., Legros, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+three-dimensional+imaging+with+a+digital+holography+microscope+with+a+source+of+partial+spatial+coherence.">Improved three-dimensional imaging with a digital holography microscope with a source of partial spatial coherence.</a> Appl. Optics. 38 (34), 7085-7094 (1999).</li><li>Kanka, M., Riesenberg, R., Petruck, P., Graulig, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+(NA=0.8)+in+lensless+in-line+holographic+microscopy+with+glass+sample+carriers.">High resolution (NA=0.8) in lensless in-line holographic microscopy with glass sample carriers.</a> Opt. Lett. 36 (18), 3651-3653 (2011).</li><li>Dubois, F., Requena, M. L., Minetti, C., Monnom, O., Istasse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+spatial+coherence+effects+in+digital+holographic+microscopy+with+a+laser+source.">Partial spatial coherence effects in digital holographic microscopy with a laser source.</a> Appl. Optics. 43 (5), 1131-1139 (2004).</li><li>Magariyama, Y., Sugiyama, S., Muramoto, K., Kawagishi, I., Imae, Y., Kudo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+measurement+of+bacterial+flagellar+rotation+rate+and+swimming+speed.">Simultaneous measurement of bacterial flagellar rotation rate and swimming speed.</a> Biophysical Journal. 69 (5), 2154-2162 (1995).</li><li>Berg, H. C., Brown, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+in+Escherichia+coli+analysed+by+three-dimensional+tracking.">Chemotaxis in Escherichia coli analysed by three-dimensional tracking.</a> Nature. 239 (5374), 500-504 (1972).</li><li>Brooker, G., Siegel, N., Wang, V., Rosen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+resolution+in+Fresnel+incoherent+correlation+holographic+fluorescence+microscopy.">Optimal resolution in Fresnel incoherent correlation holographic fluorescence microscopy.</a> Opt. Express. 19 (6), 5047-5062 (2011).</li></ol>

Det viktigste skrittet i denne eksperimentelle protokollen er nøyaktig fangst av bilder fra en stabil eksperimentelle oppsettet. Med dårlige bakgrunnsdata, er high fidelity rekonstruksjon nesten umulig. Det er også viktig å unngå objektiv med en intern fase kontrast element (synlig som en mørk ringrommet når vi leter gjennom baksiden av målet), da dette kan forringe den rekonstruerte bildet. Den objekt av interesse bør være langt nok fra fokalplanet at noen få par av diffraksjon frynser er synlige i sin bilde...

Digital inline holografisk mikroskopi (DIHM) gir rask tredimensjonal avbildning av mikroskopiske prøver, slik som svømmemikroorganismer 1,2 og myke materie systemer 3,4, med minimal endring til en standard mikroskop oppsett. I denne utredningen en pedagogisk demonstrasjon av DIHM er gitt, sentrert rundt programvare utviklet i vår lab. Denne artikkelen inneholder en beskrivelse av hvordan du setter opp mikroskopet, optimalisere datainnsamling, og behandle de lagrede bilder for å rekonstruere tredimensjonale data. Programvaren (delvis basert på programvare utviklet av DG Grier og andre 5) og eksempel bilder er fritt tilgjengelig på våre nettsider. En beskrivelse er gitt av de nødvendige skritt for å konfigurere mikroskopet, rekonstruere tredimensjonale volumer fra hologrammer og gjengi de resulterende volum av interesse å bruke en gratis ray tracing programvarepakken. Notatet avsluttes med en diskusjon av faktorer som påvirker kvaliteten på gjenoppbygging, Og en sammenligning av DIHM med konkurrerende metoder. Selv DIHM ble beskrevet for en tid siden (for en generell gjennomgang av sine prinsipper og utvikling, se Kim 6), har den nødvendige datakraft og bildebehandling kompetanse hittil i stor grad begrenset bruken til spesialist forskningsgrupper med fokus på instrumentutvikling. Denne situasjonen er i endring i lys av nylige fremskritt innen databehandling og kamerateknologi. Moderne stasjonære datamaskiner kan lett takle behandling og datalagringsbehov; CCD eller CMOS-kameraer er til stede i de fleste mikros laboratorier, og den nødvendige programvaren blir gjort fritt tilgjengelig på internett ved grupper som har investert tid i å utvikle teknikken. Forskjellige ordninger har blitt foreslått for å avbilde konfigurasjonen av mikroskopiske objekter i et tredimensjonalt prøvevolum. Mange av disse skanner teknikker 7,8, hvori en stabel av bilder er registrert av mechanically sette bildeplanet gjennom prøven. Scanning confocal fluorescens mikroskopi er kanskje det mest kjente eksempelet. Typisk blir et fluorescerende fargestoff tilsatt til en fase objekt for å oppnå et akseptabelt nivå av prøve kontrast og confocal arrangement som brukes til å lokalisere romlig fluorescensemisjon. Denne metoden har ført til betydelige fremskritt, for eksempel i kolloid vitenskap hvor det har gitt tilgang til de tre-dimensjonale dynamikken i overfylte systemer 9-11. Bruken av merking er en viktig forskjell mellom fluorescens konfokal mikroskopi og DIHM, men også andre funksjoner i de to teknikkene er verdt å sammenligne. DIHM har en betydelig hastighet fordel i at anordningen ikke har noen bevegelige deler. De mekaniske skanning speil i confocal systemer plassere en øvre grense for datainnsamling rate - typisk rundt 30 bilder / sek for en 512 x 512 piksler. En bunke med slike bilder fra ulike fokus flyene kan fås ved fysisk Translkende prøven scenen eller objektiv mellom rammer, som fører til en endelig fangstrate på rundt ett volum per sekund for en 30 ramme stabelen. Til sammenligning kan en holografisk system basert på en moderne CMOS kamera fanger 2000 bilder / sek på samme bildestørrelsen og oppløsningen, hver ramme er behandlet &#39;offline &quot;for å gi en uavhengig bilde av prøvevolumet. For å gjenta: fluorescerende prøvene er ikke nødvendig for DIHM, selv om et system har blitt utviklet som utfører holografisk rekonstruksjon av et fluorescerende emne 12. I tillegg til tre-dimensjonal informasjon volum kan DIHM også brukes til å gi kvantitative fasekontrastbilder 13, men det ligger utenfor rammen av diskusjonen her. Raw DIHM data bilder er todimensjonal, og i noen henseender ser ut som vanlige mikroskop bilder, om enn ut av fokus. Den største forskjellen mellom DIHM og standard lyse felt mikros ligger i diffraksjon ringene som omgir gjenstander in synsfeltet, og disse er på grunn av naturen av belysningen. DIHM krever en mer sammenhengende kilde enn lyse felt - typisk en LED eller laser. De diffraksjon ringer i hologrammet inneholder informasjon som er nødvendig for å rekonstruere et tredimensjonalt bilde. Det er to hovedtilnærminger til å tolke DIHM data, direkte montering og numerisk omstilling. Den første metode er anvendelig i tilfeller hvor den matematiske form av diffraksjonsmønsteret er kjent på forhånd, 3,4; denne betingelsen er oppfylt av et lite knippe av enkle gjenstander som kuler, sylindre, og en halv-plane hindringer. Direkte montering er også anvendelig i de tilfeller hvor objektets aksielle posisjon er kjent, og bildet kan monteres ved hjelp av en oppslagstabell for bilderammer 14. Den andre metoden (numerisk refokusering) er noe mer generell og er avhengig av bruk av diffraksjon ringene i de to-dimensjonale hologram bilde i numerisk rekonstruere det optiske feltet påen rekke (vilkårlig fordelte) fokale plan i hele prøvevolumet. Flere relaterte metoder finnes for å gjøre dette 6, dette arbeidet bruker Rayleigh-Sommerfeld tilbake forplantning teknikk som beskrevet av Lee og Grier fem. Utfallet av denne prosedyren er en bunke bilder som gjenskaper effekten av å manuelt endre mikroskop fokusplanet (derav navnet `numerisk omstilling &#39;). Når en stabel bilder som har blitt generert, må innhentes posisjonen av emnet i det sentrale volum. En rekke bildeanalyse heuristikk, som lokal intensitet varians eller romlig frekvens innhold, har blitt presentert for å kvantifisere skarpheten i fokus på ulike punkter i utvalget 15. I hvert tilfelle, når et bestemt bilde metrisk maksimeres (eller minimal), er objektet betraktes å være i fokus. I motsetning til andre ordninger som søker å identifisere en bestemt fokusplan der et objekt er &quot;i fokus &#39;, metoden i dette arbeidet plukker ut points som ligger inne i objektet av interesse, som kan strekker seg over et bredt spekter av fokale plan. Denne fremgangsmåten kan anvendes på et bredt spekter av fag, og er spesielt egnet for stor, svakt-spredning prøver (fase objekter), for eksempel stavformede kolloider, kjeder av bakterier eller eukaryote flag. I slike prøver kontrasten i bildet endrer seg når objektet passerer gjennom fokalplan, en defokusert bilde har lys hvis objektet er på den ene side av midtplanet, og et mørkt senter hvis den er på den andre siden. Pure fase objekter har liten eller ingen kontrast når de ligger akkurat i fokusplanet. Dette fenomenet kontrast inversjon har vært diskutert av andre forfattere 16,17 og er i siste instans på grunn av Gouy fase anomali 18. Dette har blitt satt på en mer stringent fotfeste i sammenheng med holografi andre steder, hvor grensene av teknikken blir evaluert, og den typiske usikkerhet i posisjonen er av størrelsesorden 150 nm (omtrent en piksel) på each retning 19. Den Gouy fase anomali metoden er en av de få veldefinerte DIHM ordninger for å bestemme strukturen til utvidede objekter i tre dimensjoner, men likevel noen objekter er problematisk å rekonstruere. Objekter som ligger direkte langs den optiske aksen (peker på kameraet) er vanskelig å rekonstruere nøyaktig; usikkerheter i lengden og plasseringen av objektet blir store. Denne begrensningen er delvis på grunn av den begrensede bitdybde av pikslene opptak hologrammet (antall forskjellige gråtoner som kameraet kan tas opp). Et annet problem konfigurasjon oppstår når objektet av interesse er svært nær til fokalplanet. I dette tilfellet er de virkelige og virtuelle bilder av objektet rekonstrueres i umiddelbar nærhet, noe som gir opphav til kompliserte optiske felt som er vanskelige å tolke. En annen, litt mindre viktig bekymring her er at de resulterende diffraksjon frynser opptar mindre av bildesensoren, og dette grovere kornet informasjon fører til en dårligere kvalitet på rekonstruksjon. I praksis blir en enkel gradient filter anvendt på tre-dimensjonale rekonstruerte volumer for å detektere sterk intensitet inversjoner langs belysningsretningen. Regioner hvor intensiteten endringer raskt fra lys til mørk, eller vice versa, er så forbundet med spredning regioner. Svakt-spredningsobjekter blir også beskrevet som en noninteracting samling av slike elementer 20, og disse individuelle bidrag sum for å gi det totale spredte felt som lett kan inverteres ved bruk av Rayleigh-Sommerfeld tilbake forplantning metode. I dette dokumentet blir det aksiale intensitet gradient teknikk anvendt på en kjede av streptokokk-celler. Cellen organer er fase objekter (arten E. coli har en brytningsindeks målt 21 til å være 1,384 ved en bølgelengde λ = 589 nm, den Streptococcus stamme er sannsynlig å være lignende) og vises som en høyintensiv kjede av sammenhengende punkter i the prøve volum etter graderingen filteret er brukt. Standard terskel og har uttrekksmetoder anvendt på denne filtrert volum tillate utvinning av volumetriske piksler (voxel) tilsvarende regionen inne i cellene. En spesiell fordel med denne metoden er at den tillater entydig rekonstruksjon av et objekts posisjon i den aksielle retning. Lignende metoder (minst, de som rekord hologrammer nær objektet, avbildes gjennom et mikroskop mål) lider av å være ute av stand til å bestemme fortegnet til denne forskyvningen. Selv om Rayleigh-Sommerfeld gjenoppbygging metoden er også registrere uavhengig i denne forstand, lar gradient operasjonen oss å skille mellom svake fase gjenstander over og under fokusplanet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="780">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:180px;">Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope</td>
			<td style="width:187px;">Nikon Corp.</td>
			<td style="width:147px;"> </td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:180px;">LED</td>
			<td style="width:187px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:147px;">M660L3</td>
			<td style="width:267px;">emission wavelength &#955;=660 nm, linewidth approximately 20 nm </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:180px;">LED power supply</td>
			<td style="width:187px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:147px;">LEDD1B</td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:180px;">Thread Adapter</td>
			<td style="width:187px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:147px;">SM2T2</td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:180px;">Thread Adapter</td>
			<td style="width:187px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:147px;">SM1A2</td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:180px;">Frame Grabber board</td>
			<td style="width:187px;">EPIX </td>
			<td style="width:147px;">PIXCI E4 </td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:180px;">High-Speed CMOS camera</td>
			<td style="width:187px;">Mikrotron</td>
			<td style="width:147px;">MC-1362</td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

digital inline holographic microscopy (dihm) of weakly-scattering subjects

Svakt-spredning objekter, for eksempel små kolloidale partikler og de fleste biologiske celler er ofte oppstått i mikroskopi. Faktisk har en rekke teknikker blitt utviklet for å bedre visualisere disse fase objekter; fasekontrast og DIC er blant de mest populære metoder for å øke kontrasten. Men innspillingen posisjon og form i out-of-imaging-flyet retning er fortsatt utfordrende. Denne rapporten presenterer en enkel eksperimentell metode for å fastslå nøyaktig plassering og geometri av objekter i tre dimensjoner ved hjelp av digital inline holografisk mikroskopi (DIHM). Generelt sett, er tilgjengelige prøvevolum definert av kamerasensoren størrelsen i sideretningen, og belysnings koherens i aksial retning. Typiske prøvevolumer varierer fra 200 mikrometer x 200 mikrometer x 200 mikrometer ved hjelp av LED-belysning, til5 mm x 5 mm x 5 mm eller større ved hjelp av laser-lys. Denne belysningslampen konfigurert slik at plane bølger som faller inn på prøven. Objekter i prøvevolumet og sprer lyset, noe som forstyrrer den unscattered lys for å danne interferensmønstre perpendikulær på belysningsretningen. Dette bildet (hologram) inneholder detaljert informasjon som kreves for tredimensjonal rekonstruksjon, og kan fanges opp på en standard bildeenhet, for eksempel en CMOS eller CCD-kamera. Den Rayleigh-Sommerfeld tilbake forplantning metode som anvendes for å numerisk refokusere mikroskop-bilder, og en enkel avbildning heuristisk basert på Gouy fase anomali blir brukt til å identifisere spredningsobjekter i det rekonstruerte volum. Denne enkle, men robust metode resulterer i en entydig, model-fri måling av beliggenheten og formen av objekter i mikroskopiske prøver.

For å demonstrere egenskapene til DIHM, ble eksperimenter utført på en kjede av Streptococcus bakterier. Kjeden selv målte 10,5 mm lang, og er sammensatt av 6-7 Sphero-sylindrisk celler (to av cellene i kjeden er nær delende) med diameter i området 0,6-1 um. Figurene 1a og 1b viser de viktigste grensesnitt av gjenoppbygging og rendering programvare. Eksempler på den numeriske omstilling prosedyren er sett i figur 2, hvor en romlig båndpassfilter er inst...

Watch this Scientific Journal Video about Digital Inline Holographic Microscopy DIHM of Weakly-scattering Subjects at JoVE.com

Digital Inline Holographic Microscopy DIHM of Weakly-scattering Subjects

Den tre-dimensjonale steder av svakt-spredningsobjekter kan identifiseres entydig ved hjelp av digital inline holografiske mikroskopi (DIHM), som innebærer en mindre modifikasjon av en vanlig mikroskop. Vår programvaren bruker en enkel avbildning heuristisk kombinert med Rayleigh-Sommerfeld tilbake-forplantning, hvorved den tredimensjonale posisjon og geometri av et mikroskopisk objekt fase.

Digital Inline Holografisk Mikros (DIHM) av Weakly-spredning Emner

Weakly-scattering objects, such as small colloidal particles and most biological cells, are frequently encountered in microscopy. Indeed, a range of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Digital Inline Holographic Microscopy (DIHM) of Weakly-scattering Subjects

Determining heat and mechanical pain threshold in inflamed skin of human subjects

In a previous article in the Journal of Visualized Experiments we have demonstrated skin microdialysis techniques for the collection of tissue-specific ...

Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Klonal Sporing av Hematopoetiske Stem og stamceller Preget av fem Fluorescent Proteiner bruker Confocal og multiphoton Mikros

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Sporing av Hematopoietiske Stem og stamceller i Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Enkelt Bulk Avlesning av digitale Nukleinsyre Kvantifisering Analyser

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Magnetisk-aktivert celle sortering strategier for å isolere og rense Synovial Fluid-avledet Mesenchymal stamceller fra en kanin modell

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

Micron-scale Phenotyping Techniques of Maize Vascular Bundles Based on X-ray Microcomputed Tomography

Micron skala Phenotyping teknikker av mais vaskulær pakker basert på X-ray Microcomputed tomografi

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Biologiske utvalg forberedelse av høytrykks fryser, mikrobølgeovn-assistert kontrast ekstrautstyr og Minimal harpiks innebygging volum Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...