Name: digital inline holographic microscopy (dihm) of weakly-scattering subjects
Uploaded: 2014-02-08T17:00:00
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Os autores agradecem Linda Turner para obter ajuda com a preparação microbiológica. RZ e LBV foram financiados pelo Instituto Rowland em Harvard e CGB foi financiado como um estudioso da Fundação CAPES, Ciência sem Fronteiras Programa, Brasil (Processo n º 7340-11-7)

1. Configuração e Aquisição de Dados <ol><li> Crescer uma cultura de Streptococcus tensão V4051-197 (natação liso) células em meio KTY do estoque congelado 22. Incubar em um agitador rotativo, durante a noite a 35 ° C e 150 rpm, até à saturação. </li><li> Inocular 10 ml de meio fresco com KTY 500 ul de cultura saturada. Incubar durante mais 3,5 horas a 35 ° C e 150 rpm até as células atingirem uma densidade óptica de cerca de 1,0 a λ = 600 nm (aproximadamente 5 x 10 8 c...

<ol>
	<li>Xu, W., Jericho, M. H., Meinertzhagen, I. A., Kreuzer, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+in-line+holography+for+biological+applications.">Digital in-line holography for biological applications.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (20), 11301-11305 (2001).</li><li>Sheng, J., Malkiel, E., Katz, J., Adolf, J., Belas, R., Place, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+holographic+microscopy+reveals+prey-induced+changes+in+swimming+behavior+of+predatory+dinoflagellates.">Digital holographic microscopy reveals prey-induced changes in swimming behavior of predatory dinoflagellates.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 17512-17517 (2007).</li><li>Lee, S. H., Roichman, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+and+tracking+single+colloidal+particles+with+video+holographic+microscopy.">Characterizing and tracking single colloidal particles with video holographic microscopy.</a> Opt. Express. 15 (26), 18275-18282 (2007).</li><li>Fung, J., Martin, K. E., Perry, R. W., Katz, D. M., McGorty, R., Manoharan, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+translational,+rotational,+and+vibrational+dynamics+in+colloids+with+digital+holographic+microscopy.">Measuring translational, rotational, and vibrational dynamics in colloids with digital holographic microscopy.</a> Opt. Express. 19 (9), 8051-8065 (2011).</li><li>Lee, S. H., Grier, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Holographic+microscopy+of+holographically+trapped+three-dimensional+structures.">Holographic microscopy of holographically trapped three-dimensional structures.</a> Opt. Express. 15 (4), 1505-1512 (2007).</li><li>Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+techniques+of+digital+holographic+microscopy.">Principles and techniques of digital holographic microscopy.</a> SPIE Rev. 1, 018005 (2010).</li><li>Corkidi, G., Taboada, B., Wood, C. D., Guerrero, A., Darszon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+sperm+in+three-dimensions.">Tracking sperm in three-dimensions.</a> Biochem. Biophys. Res. Comm. 373, 125-129 (2008).</li><li>Santi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+Sheet+Fluorescence+Microscopy+:+A+Review.">Light Sheet Fluorescence Microscopy : A Review.</a> J. Histochem. Cytochem. 59, 129-138 (2011).</li><li>van Blaaderen, A., Wiltzius, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Real-Space Structure of Colloidal Hard-Sphere Glasses. Science. 270, 1177-1179 (1990).</li><li>Besseling, R., Weeks, E. R., Schofield, A. B., Poon, W. C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Imaging+of+Colloidal+Glasses+under+Steady+Shear.">Three-Dimensional Imaging of Colloidal Glasses under Steady Shear.</a> Phys. Rev. Lett. 99, 028301 (2007).</li><li>Schall, P., Weitz, D., Spaepen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Rearrangements+That+Govern+Flow+in+Colloidal+Glasses.">Structural Rearrangements That Govern Flow in Colloidal Glasses.</a> Science. 318, 1895-1899 (2007).</li><li>Rosen, J., Brooker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+incoherent+color+holography.">Fluorescence incoherent color holography.</a> Opt. Exp. 15, 2244-2250 (2007).</li><li>Jericho, M. H., Kreuzer, H. J., Kanka, M., Riesenberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+phase+and+refractive+index+measurements+with+point-source+digital+in-line+holographic+microscopy.">Quantitative phase and refractive index measurements with point-source digital in-line holographic microscopy.</a> Appl. Opt. 51 (10), 1503-1515 (2012).</li><li>Mudanyali, O., Erlinger, A., Seo, S., Su, T., Ozcan, D. T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lensless+On-chip+Imaging+of+Cells+Provides+a+New+Tool+for+High-throughput+Cell-Biology+and+Medical.">Lensless On-chip Imaging of Cells Provides a New Tool for High-throughput Cell-Biology and Medical.</a> J. Vis. Exp. 34, (2009).</li><li>Langehanenberg, P., Kemper, B., Dirksen, D., von Bally, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autofocusing+in+digital+holographic+phase+contrast+microscopy+on+pure+phase+objects+for+live+cell+imaging.">Autofocusing in digital holographic phase contrast microscopy on pure phase objects for live cell imaging.</a> Appl. Opt. 47 (19), (2008).</li><li>Elliot, M. S., Poon, W. C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conventional+optical+microscopy+of+colloidal+suspensions.">Conventional optical microscopy of colloidal suspensions.</a> Adv. Coll. Interf. Sci. 92, 133-194 (2001).</li><li>Agero, U., Monken, C. H., Ropert, C., Gazzinelli, R. T., Mesquita, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+fluctuations+studied+with+defocusing+microscopy.">Cell surface fluctuations studied with defocusing microscopy.</a> Phys. Rev. E. 67, 051904 (2003).</li><li>Born, M., Wolf, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Optics, 6th Ed. , (1998).</li><li>Wilson, L., Zhang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Localization+of+weak+scatterers+in+digital+holographic+microscopy+using+Rayleigh-Sommerfeld+back-propagation.">3D Localization of weak scatterers in digital holographic microscopy using Rayleigh-Sommerfeld back-propagation.</a> Opt. Express. 20, 16735-16744 (2012).</li><li>Bohren, C., Huffman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Absorption and Scattering of Light by Small Particles. , (1983).</li><li>Balaev, A. E., Dvoretski, K. N., Doubrovski, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refractive+index+of+escherichia+coli+cells.">Refractive index of escherichia coli cells.</a> Saratov Fall Meeting 2001: Optical Technologies in Biophysics and Medicine III. 4707 (1), 253-260 (2002).</li><li>Berg, H. C., Manson, M. D., Conley, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+and+Energetics+of+Flagellar+Rotation+in+Bacteria.">Dynamics and Energetics of Flagellar Rotation in Bacteria.</a> Symp. Soc. Exp. Biol. 35, 1-31 (1982).</li><li>Garcia-Sucerquia, J., Xu, W., Jericho, S. K., Klages, P., Jericho, M. H., Kreuzer, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+in-line+holographic+microscopy.">Digital in-line holographic microscopy.</a> Appl. Optics. 45 (5), 836-850 (2006).</li><li>Restrepo, J. F., Garcia-Sucerquia, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnified+reconstruction+of+digitally+recorded+holograms+by+Fresnel-Bluestein+transform.">Magnified reconstruction of digitally recorded holograms by Fresnel-Bluestein transform.</a> Appl. Optics. 49 (33), 6430-6435 (2010).</li><li>Dubois, F., Joannes, L., Legros, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+three-dimensional+imaging+with+a+digital+holography+microscope+with+a+source+of+partial+spatial+coherence.">Improved three-dimensional imaging with a digital holography microscope with a source of partial spatial coherence.</a> Appl. Optics. 38 (34), 7085-7094 (1999).</li><li>Kanka, M., Riesenberg, R., Petruck, P., Graulig, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+(NA=0.8)+in+lensless+in-line+holographic+microscopy+with+glass+sample+carriers.">High resolution (NA=0.8) in lensless in-line holographic microscopy with glass sample carriers.</a> Opt. Lett. 36 (18), 3651-3653 (2011).</li><li>Dubois, F., Requena, M. L., Minetti, C., Monnom, O., Istasse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+spatial+coherence+effects+in+digital+holographic+microscopy+with+a+laser+source.">Partial spatial coherence effects in digital holographic microscopy with a laser source.</a> Appl. Optics. 43 (5), 1131-1139 (2004).</li><li>Magariyama, Y., Sugiyama, S., Muramoto, K., Kawagishi, I., Imae, Y., Kudo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+measurement+of+bacterial+flagellar+rotation+rate+and+swimming+speed.">Simultaneous measurement of bacterial flagellar rotation rate and swimming speed.</a> Biophysical Journal. 69 (5), 2154-2162 (1995).</li><li>Berg, H. C., Brown, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+in+Escherichia+coli+analysed+by+three-dimensional+tracking.">Chemotaxis in Escherichia coli analysed by three-dimensional tracking.</a> Nature. 239 (5374), 500-504 (1972).</li><li>Brooker, G., Siegel, N., Wang, V., Rosen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+resolution+in+Fresnel+incoherent+correlation+holographic+fluorescence+microscopy.">Optimal resolution in Fresnel incoherent correlation holographic fluorescence microscopy.</a> Opt. Express. 19 (6), 5047-5062 (2011).</li></ol>

O passo mais importante neste protocolo experimental é a captação precisa das imagens de uma instalação experimental estável. Com pobres dados de fundo, alta fidelidade de reconstrução é quase impossível. Também é importante para evitar as lentes objectivas com um elemento interno de contraste de fase (visíveis como um anel escuro quando se olha através da parte de trás do objectivo), como este pode degradar a imagem reconstruída. O objeto de interesse deve ser longe o suficiente do plano focal que algun...

Linha Digital microscopia holográfica (Dihm) permite rápido imagens tridimensionais de amostras microscópicas, tais como microorganismos natação 1,2 e sistemas de matéria mole 3,4, com modificações mínimas para uma configuração de microscópio padrão. Neste trabalho uma demonstração pedagógica da Dihm é fornecido, centrada em torno de um software desenvolvido em nosso laboratório. Este trabalho inclui uma descrição de como configurar o microscópio, otimizar a aquisição de dados e processar as imagens gravadas para reconstruir dados tridimensionais. O software (baseado em parte no software desenvolvido pela DG Grier e outros 5) e imagens de exemplo estão disponíveis gratuitamente em nosso site. A descrição é fornecida dos passos necessários para configurar o microscópio, reconstruir volumes tridimensionais a partir de hologramas e tornam os volumes resultantes de interesse usando um raio livre rastreamento pacote de software. O artigo conclui com uma discussão sobre os fatores que afetam a qualidade da reconstrução, E uma comparação com os métodos de Dihm concorrentes. Embora Dihm foi descrito há algum tempo (para uma revisão geral de seus princípios e de desenvolvimento, ver Kim 6), o poder de computação necessário e imagem perícia processamento até então muito restrito o seu uso para grupos de pesquisa especializados com foco no desenvolvimento de instrumentos. Esta situação está mudando à luz dos recentes avanços na computação e tecnologia de câmera. Computadores modernos podem facilmente lidar com o processamento e os requisitos de armazenamento de dados; CCD ou CMOS câmeras estão presentes na maioria dos laboratórios de microscopia, eo software necessário está sendo disponibilizado gratuitamente na internet por grupos que investiram tempo no desenvolvimento da técnica. Vários esquemas têm sido propostos para a imagem da configuração de objectos microscópicos em um volume de amostra tridimensional. Muitos destes são digitalizando técnicas 7,8, em que uma pilha de imagens é gravada por mechanically traduzindo o plano de imagem através da amostra. Microscopia de fluorescência confocal é talvez o exemplo mais conhecido. Tipicamente, um corante fluorescente é adicionado a um objecto de fase, a fim de alcançar um nível aceitável de contraste da amostra, e a disposição confocal utilizados para localizar espacialmente emissão fluorescente. Este método tem levado a avanços significativos, como por exemplo na ciência coloidal onde tem permissão para acessar a dinâmica tridimensional de sistemas lotados 9-11. O uso de rotulagem é uma importante diferença entre a microscopia de fluorescência confocal e Dihm, mas outras características das duas técnicas podem ser comparados. Dihm tem uma vantagem significante na velocidade em que o aparelho não tem partes móveis. Os espelhos de varredura mecânica em sistemas confocal colocar um limite superior para a taxa de aquisição de dados - geralmente cerca de 30 frames / seg a imagem de pixel 512 x 512 para. Uma pilha de tais imagens em diferentes planos focais pode ser obtido por fisicamente translAting o estágio da amostra ou lente objetiva entre os quadros, o que leva a uma taxa de captura final de cerca de um volume por segundo para um quadro de pilha 30. Em comparação, um sistema holográfico com base em uma câmara moderna CMOS pode capturar 2000 quadros / seg para o mesmo tamanho e a resolução da imagem, cada imagem é processada `off-line&quot; para dar um instantâneo independente do volume de amostra. Para reiterar: amostras fluorescentes não são necessários para Dihm, embora o sistema foi desenvolvido que executa a reconstrução holográfica de um objecto fluorescente 12. , Bem como informações sobre o volume tridimensional, Dihm também pode ser utilizado para obter imagens de contraste de fase quantitativos 13, mas que está fora do âmbito da discussão aqui. Imagens de dados Raw Dihm são bidimensionais e, em alguns aspectos parecido com imagens de microscópio padrão, ainda que fora de foco. A principal diferença entre Dihm e microscopia de campo claro padrão encontra-se em anéis de difração que cercam objetos in o campo de visão, que são devido à natureza da iluminação. Dihm requer uma fonte mais coerente do campo claro - geralmente um LED ou laser. Os anéis de difração do holograma contém a informação necessária para reconstruir uma imagem tridimensional. Existem duas abordagens principais para interpretar os dados Dihm; reorientar montagem e numérica direta. A primeira abordagem é aplicável nos casos em que a forma matemática do padrão de difração é conhecido com antecedência 3,4; esta condição é satisfeita por um pequeno punhado de objetos simples, como esferas, cilindros e obstáculos semi-plano. Montagem direta também é aplicável nos casos em que posição axial do objeto é conhecido, ea imagem pode ser equipado com uma tabela look-up de modelos de imagem 14. A segunda abordagem (reorientação numérico) é um pouco mais geral e se baseia na utilização dos anéis de difracção na imagem de holograma bidimensional para numericamente reconstruir o campo óptico deum número de (arbitrariamente) espaçados planos focais ao longo do volume da amostra. Existem vários métodos relacionados para fazer isto 6, o trabalho utiliza o Rayleigh-Sommerfeld para trás técnica de propagação, como descrito por Lee e Grier 5. O resultado deste procedimento é uma pilha de imagens que reproduzem o efeito de mudar manualmente o plano focal microscópio (daí o nome `reorientação numérica&quot;). Depois de uma pilha de imagens tiver sido gerada, a posição do objecto do volume focal deve ser obtida. Uma série de heurísticas de análise de imagem, como a variação da intensidade local ou conteúdo de freqüência espacial, foram apresentados para quantificar a nitidez de foco em diferentes pontos na amostra 15. Em cada caso, quando uma determinada imagem métrica é maximizada (ou minimizado), o objecto é considerado como estando em foco. Ao contrário de outros sistemas que procuram identificar um plano focal especial quando um objeto está &quot;em foco&quot;, o método neste trabalho escolhe pontos que se encontram no interior do objeto de interesse, que podem se estender através de uma ampla gama de planos focais. Esta abordagem é aplicável a uma ampla gama de sujeitos e é particularmente adequado para a estendida, amostras fracamente espalhamento (objectos de fase), tais como coloides de forma cilíndrica, as cadeias de bactérias ou flagelos eucariótica. Nestas amostras o contraste de imagem muda quando o objecto passa através do plano focal, uma imagem desfocada tem um centro de luz, se o objecto é, por um lado do plano focal e um centro escuro, se for por outro. Objetos puros têm pouco ou nenhum contraste quando mentem exatamente no plano focal. Este fenômeno de inversão de contraste tem sido discutido por outros autores 16,17 e é em última análise, devido à fase de Gouy anomalia 18. Este foi colocado em uma posição mais rigorosa no contexto da holografia em outros lugares, onde os limites da técnica são avaliados, a incerteza típica posição é da ordem de 150 nm (cerca de um pixel) em each Direcção 19. O método anomalia fase Gouy é um dos poucos sistemas Dihm bem definidos para determinar a estrutura de objetos estendidos em três dimensões, mas, no entanto, alguns objetos são problemáticas para reconstruir. Objetos que estão diretamente ao longo do eixo óptico (apontando para a câmera) são difíceis de reconstruir com precisão; incertezas no comprimento e posição do objeto se tornam grandes. Essa limitação é, em parte, devido à profundidade pouco restrito dos pixels de gravação do holograma (o número de níveis de cinza distintos que a câmera pode gravar). Outra configuração problemática ocorre quando o objeto de interesse é muito próximo do plano focal. Neste caso, as imagens reais e virtuais do objecto são reconstruídos em grande proximidade, dando origem a campos ópticos complicadas que são difíceis de interpretar. Uma segunda preocupação ligeiramente menos importante aqui é que as franjas de difracção resultantes ocupam menos do sensor de imagem, e deste inf granulação mais grossaormação conduz a uma reconstrução de pior qualidade. Na prática, um filtro simples gradiente é aplicado a volumes tridimensionais reconstruídos para detectar fortes inversões de intensidade ao longo da direcção de iluminação. Regiões onde a intensidade muda rapidamente do claro ao escuro, ou vice-versa, são, então, associada a regiões de dispersão. Objetos fracamente espalhamento são bem descrito como uma coleção de tais elementos não interagem 20; estes soma as contribuições individuais para dar ao campo espalhado total que pode ser facilmente invertida com o Rayleigh-Sommerfeld volta método de propagação. Neste papel, a intensidade da técnica de gradiente axial é aplicada a uma cadeia de células de Streptococcus. Os corpos celulares são objectos de fase (a espécie de E. coli tem um índice de refracção medido 21 a ser 1,384 a um comprimento de onda λ = 589 nm, a estirpe de Streptococcus é provável que seja semelhante) e aparecem como uma corrente de alta intensidade de bolhas ligados entre si em ºvolume da amostra e depois do filtro de gradiente de ter sido aplicada. Limiar e da característica de métodos padrão de extracção aplicados a este volume filtrado permitir a extracção de pixels volumétricos (voxels) que correspondem à região no interior das células. Uma vantagem particular deste método é que ele permite a reconstrução não ambígua da posição de um objecto, na direcção axial. Métodos similares (pelo menos, os que registram hologramas perto do objeto, fotografada através de uma objetiva de microscópio) sofrem de ser incapaz de determinar o sinal deste deslocamento. Embora o método de reconstrução de Rayleigh-Sommerfeld é também independente de sinal neste sentido, a operação de gradiente permite discriminar entre fracas objectos de fase acima e abaixo do plano focal.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="780">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:180px;">Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope</td>
			<td style="width:187px;">Nikon Corp.</td>
			<td style="width:147px;"> </td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:180px;">LED</td>
			<td style="width:187px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:147px;">M660L3</td>
			<td style="width:267px;">emission wavelength &#955;=660 nm, linewidth approximately 20 nm </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:180px;">LED power supply</td>
			<td style="width:187px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:147px;">LEDD1B</td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:180px;">Thread Adapter</td>
			<td style="width:187px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:147px;">SM2T2</td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:180px;">Thread Adapter</td>
			<td style="width:187px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:147px;">SM1A2</td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:180px;">Frame Grabber board</td>
			<td style="width:187px;">EPIX </td>
			<td style="width:147px;">PIXCI E4 </td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:180px;">High-Speed CMOS camera</td>
			<td style="width:187px;">Mikrotron</td>
			<td style="width:147px;">MC-1362</td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

digital inline holographic microscopy (dihm) of weakly-scattering subjects

Objetos fracamente dispersão, tais como pequenas partículas coloidais ea maioria das células biológicas, são encontrados com freqüência em microscopia. Na verdade, uma série de técnicas têm sido desenvolvidas para melhor visualizar esses objetos de fase; contraste de fase e DIC estão entre os métodos mais populares para melhorar o contraste. No entanto, a posição de gravação e forma na direção out-of-imaging-plano continua sendo um desafio. Este relatório apresenta um método experimental simples para determinar com precisão a localização e geometria dos objetos em três dimensões, utilizando linha digitais microscopia holográfica (Dihm). De um modo geral, o volume da amostra é definido acessíveis por o tamanho do sensor de câmara na direcção lateral, e a coerência de iluminação na direcção axial. Volumes de amostras típicas variam de 200 um x 200 um x 200 fim usando iluminação por LED, para5 mm x 5 mm x 5 mm ou maior usando iluminação por laser. Esta luz de iluminação está configurado de tal modo que as ondas planas são incidente sobre a amostra. Objetos no volume da amostra, em seguida, dispersam a luz, o que interfere com a luz unscattered para formar padrões de interferência perpendicular à direção de iluminação. Esta imagem (holograma) contém a informação de profundidade necessária para a reconstrução tridimensional, e pode ser capturada num dispositivo de imagem padrão tais como CMOS ou CCD. O Rayleigh-Sommerfeld método propagação de volta é empregada para reorientar numericamente imagens de microscópio, e uma heurística de imagens simples, baseada na fase Gouy anomalia é utilizado para identificar espalhando objetos dentro do volume reconstruído. Este método simples, mas robusto resulta em uma medida inequívoca, sem modelo de localização e forma dos objetos em amostras microscópicas.

Para demonstrar as capacidades do Dihm, os experimentos foram realizados em uma cadeia de bactéria Streptococcus. A cadeia em si medido 10,5 milímetros de comprimento, e era composto por 6-7 células esférico-cilíndrica (duas das células na cadeia estão perto dividindo), com diâmetros na gama de 0,6-1 um. Figuras 1a e 1b mostram a interface principal da reconstrução e software de renderização. Exemplos do procedimento numérico reorientação são vistos na F...

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Digital Inline Holographic Microscopy DIHM of Weakly-scattering Subjects

As localizações tridimensionais dos objectos fracamente espalhamento pode ser identificada exclusivamente com linha digital de microscopia holográfica (Dihm), que envolve uma modificação menor para um microscópio padrão. Nosso software utiliza uma heurística de imagens simples juntamente com Rayleigh-Sommerfeld back-propagação para ceder a posição tridimensional e geometria de um objeto fase microscópica.

Digital em linha Holographic Microscopy (Dihm) de Assuntos Fracamente de dispersão

Weakly-scattering objects, such as small colloidal particles and most biological cells, are frequently encountered in microscopy. Indeed, a range of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Digital Inline Holographic Microscopy (DIHM) of Weakly-scattering Subjects

Determining heat and mechanical pain threshold in inflamed skin of human subjects

Determinar o calor e limiar de dor mecânica em pele inflamada de seres humanos

In a previous article in the Journal of Visualized Experiments we have demonstrated skin microdialysis techniques for the collection of tissue-specific ...

Biologia

Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing

A microfluídica digital para processamento automatizado Proteômica

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Lapso de tempo de imagens de Mitose Depois de Transfection siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Rastreamento de Stem hematopoiéticas e células progenitoras Marcado por cinco proteínas fluorescentes usando confocal e microscopia multifotônica

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo Rastreamento 4-Dimensional de tronco hematopoéticas e células progenitoras em adultos mouse na calota craniana de Medula Óssea

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Simples massa de Leitura Digital de Ácido Nucleico Quantificação Assays

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Magnético-ativado da pilha classificação estratégias para isolar e purificar sinovial fluidos derivados mesenquimais células-tronco de um modelo de coelho

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

Micron-scale Phenotyping Techniques of Maize Vascular Bundles Based on X-ray Microcomputed Tomography

Técnicas de fenotipagem mícron-escala de milho feixes vasculares, com base na tomografia computadorizada de Microcomputed de raio-x

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Preparação de amostras biológicas por congelamento de alta pressão, realce de contraste assistida por microondas e resina mínima incorporação para a imagem latente de Volume

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...