Name: digital inline holographic microscopy (dihm) of weakly-scattering subjects
Uploaded: 2014-02-08T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Digital Inline Holographic Microscopy DIHM of Weakly-scattering Subjects at JoVE.com

Författarna tackar Linda Turner för att få hjälp med den mikrobiologiska preparat. RZ och LGW finansierades av Rowland institutet vid Harvard och CGB finansierades som en CAPES stiftelsens lärd, Vetenskap utan gränser Program, Brasilien (Process # 7340-11-7)

1. Inställning och datainsamling <ol><li> Odla en kultur av Streptococcus stam V4051-197 (jämn simning) celler i KTY medium från frysta lager 22. Inkubera i en roterande skakanordning över natten vid 35 ° C och 150 rpm, till mättnad. </li><li> Inokulera 10 ml färskt KTY-medium med 500 | il av den mättade kulturen. Inkubera under ytterligare 3,5 h vid 35 ° C och 150 rpm tills cellerna når en optisk densitet av ca 1,0 vid λ = 600 nm (cirka 5 x 10 8 celler / ml). </li><li> Späd ...

<ol>
	<li>Xu, W., Jericho, M. H., Meinertzhagen, I. A., Kreuzer, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+in-line+holography+for+biological+applications.">Digital in-line holography for biological applications.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (20), 11301-11305 (2001).</li><li>Sheng, J., Malkiel, E., Katz, J., Adolf, J., Belas, R., Place, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+holographic+microscopy+reveals+prey-induced+changes+in+swimming+behavior+of+predatory+dinoflagellates.">Digital holographic microscopy reveals prey-induced changes in swimming behavior of predatory dinoflagellates.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 17512-17517 (2007).</li><li>Lee, S. H., Roichman, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+and+tracking+single+colloidal+particles+with+video+holographic+microscopy.">Characterizing and tracking single colloidal particles with video holographic microscopy.</a> Opt. Express. 15 (26), 18275-18282 (2007).</li><li>Fung, J., Martin, K. E., Perry, R. W., Katz, D. M., McGorty, R., Manoharan, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+translational,+rotational,+and+vibrational+dynamics+in+colloids+with+digital+holographic+microscopy.">Measuring translational, rotational, and vibrational dynamics in colloids with digital holographic microscopy.</a> Opt. Express. 19 (9), 8051-8065 (2011).</li><li>Lee, S. H., Grier, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Holographic+microscopy+of+holographically+trapped+three-dimensional+structures.">Holographic microscopy of holographically trapped three-dimensional structures.</a> Opt. Express. 15 (4), 1505-1512 (2007).</li><li>Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+techniques+of+digital+holographic+microscopy.">Principles and techniques of digital holographic microscopy.</a> SPIE Rev. 1, 018005 (2010).</li><li>Corkidi, G., Taboada, B., Wood, C. D., Guerrero, A., Darszon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+sperm+in+three-dimensions.">Tracking sperm in three-dimensions.</a> Biochem. Biophys. Res. Comm. 373, 125-129 (2008).</li><li>Santi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+Sheet+Fluorescence+Microscopy+:+A+Review.">Light Sheet Fluorescence Microscopy : A Review.</a> J. Histochem. Cytochem. 59, 129-138 (2011).</li><li>van Blaaderen, A., Wiltzius, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Real-Space Structure of Colloidal Hard-Sphere Glasses. Science. 270, 1177-1179 (1990).</li><li>Besseling, R., Weeks, E. R., Schofield, A. B., Poon, W. C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Imaging+of+Colloidal+Glasses+under+Steady+Shear.">Three-Dimensional Imaging of Colloidal Glasses under Steady Shear.</a> Phys. Rev. Lett. 99, 028301 (2007).</li><li>Schall, P., Weitz, D., Spaepen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Rearrangements+That+Govern+Flow+in+Colloidal+Glasses.">Structural Rearrangements That Govern Flow in Colloidal Glasses.</a> Science. 318, 1895-1899 (2007).</li><li>Rosen, J., Brooker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+incoherent+color+holography.">Fluorescence incoherent color holography.</a> Opt. Exp. 15, 2244-2250 (2007).</li><li>Jericho, M. H., Kreuzer, H. J., Kanka, M., Riesenberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+phase+and+refractive+index+measurements+with+point-source+digital+in-line+holographic+microscopy.">Quantitative phase and refractive index measurements with point-source digital in-line holographic microscopy.</a> Appl. Opt. 51 (10), 1503-1515 (2012).</li><li>Mudanyali, O., Erlinger, A., Seo, S., Su, T., Ozcan, D. T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lensless+On-chip+Imaging+of+Cells+Provides+a+New+Tool+for+High-throughput+Cell-Biology+and+Medical.">Lensless On-chip Imaging of Cells Provides a New Tool for High-throughput Cell-Biology and Medical.</a> J. Vis. Exp. 34, (2009).</li><li>Langehanenberg, P., Kemper, B., Dirksen, D., von Bally, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autofocusing+in+digital+holographic+phase+contrast+microscopy+on+pure+phase+objects+for+live+cell+imaging.">Autofocusing in digital holographic phase contrast microscopy on pure phase objects for live cell imaging.</a> Appl. Opt. 47 (19), (2008).</li><li>Elliot, M. S., Poon, W. C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conventional+optical+microscopy+of+colloidal+suspensions.">Conventional optical microscopy of colloidal suspensions.</a> Adv. Coll. Interf. Sci. 92, 133-194 (2001).</li><li>Agero, U., Monken, C. H., Ropert, C., Gazzinelli, R. T., Mesquita, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+fluctuations+studied+with+defocusing+microscopy.">Cell surface fluctuations studied with defocusing microscopy.</a> Phys. Rev. E. 67, 051904 (2003).</li><li>Born, M., Wolf, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Optics, 6th Ed. , (1998).</li><li>Wilson, L., Zhang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Localization+of+weak+scatterers+in+digital+holographic+microscopy+using+Rayleigh-Sommerfeld+back-propagation.">3D Localization of weak scatterers in digital holographic microscopy using Rayleigh-Sommerfeld back-propagation.</a> Opt. Express. 20, 16735-16744 (2012).</li><li>Bohren, C., Huffman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Absorption and Scattering of Light by Small Particles. , (1983).</li><li>Balaev, A. E., Dvoretski, K. N., Doubrovski, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refractive+index+of+escherichia+coli+cells.">Refractive index of escherichia coli cells.</a> Saratov Fall Meeting 2001: Optical Technologies in Biophysics and Medicine III. 4707 (1), 253-260 (2002).</li><li>Berg, H. C., Manson, M. D., Conley, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+and+Energetics+of+Flagellar+Rotation+in+Bacteria.">Dynamics and Energetics of Flagellar Rotation in Bacteria.</a> Symp. Soc. Exp. Biol. 35, 1-31 (1982).</li><li>Garcia-Sucerquia, J., Xu, W., Jericho, S. K., Klages, P., Jericho, M. H., Kreuzer, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+in-line+holographic+microscopy.">Digital in-line holographic microscopy.</a> Appl. Optics. 45 (5), 836-850 (2006).</li><li>Restrepo, J. F., Garcia-Sucerquia, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnified+reconstruction+of+digitally+recorded+holograms+by+Fresnel-Bluestein+transform.">Magnified reconstruction of digitally recorded holograms by Fresnel-Bluestein transform.</a> Appl. Optics. 49 (33), 6430-6435 (2010).</li><li>Dubois, F., Joannes, L., Legros, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+three-dimensional+imaging+with+a+digital+holography+microscope+with+a+source+of+partial+spatial+coherence.">Improved three-dimensional imaging with a digital holography microscope with a source of partial spatial coherence.</a> Appl. Optics. 38 (34), 7085-7094 (1999).</li><li>Kanka, M., Riesenberg, R., Petruck, P., Graulig, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+(NA=0.8)+in+lensless+in-line+holographic+microscopy+with+glass+sample+carriers.">High resolution (NA=0.8) in lensless in-line holographic microscopy with glass sample carriers.</a> Opt. Lett. 36 (18), 3651-3653 (2011).</li><li>Dubois, F., Requena, M. L., Minetti, C., Monnom, O., Istasse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+spatial+coherence+effects+in+digital+holographic+microscopy+with+a+laser+source.">Partial spatial coherence effects in digital holographic microscopy with a laser source.</a> Appl. Optics. 43 (5), 1131-1139 (2004).</li><li>Magariyama, Y., Sugiyama, S., Muramoto, K., Kawagishi, I., Imae, Y., Kudo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+measurement+of+bacterial+flagellar+rotation+rate+and+swimming+speed.">Simultaneous measurement of bacterial flagellar rotation rate and swimming speed.</a> Biophysical Journal. 69 (5), 2154-2162 (1995).</li><li>Berg, H. C., Brown, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+in+Escherichia+coli+analysed+by+three-dimensional+tracking.">Chemotaxis in Escherichia coli analysed by three-dimensional tracking.</a> Nature. 239 (5374), 500-504 (1972).</li><li>Brooker, G., Siegel, N., Wang, V., Rosen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+resolution+in+Fresnel+incoherent+correlation+holographic+fluorescence+microscopy.">Optimal resolution in Fresnel incoherent correlation holographic fluorescence microscopy.</a> Opt. Express. 19 (6), 5047-5062 (2011).</li></ol>

Det viktigaste steget i denna experimentella protokollet är det exakt fånga bilder från en stabil experimentuppställning. Med dålig bakgrundsdata, är hifi rekonstruktion intill omöjligt. Det är också viktigt att undvika objektiv med en intern fas kontrastelement (syns som en mörk ring när man tittar genom baksidan av målet), eftersom detta kan försämra den rekonstruerade bilden. Föremål för intresse bör vara tillräckligt långt från fokalplanet att några par diffraktion fransar är synliga i bilden ...

Digital inline holografisk mikroskopi (DIHM) möjliggör snabb tredimensionell avbildning av mikroskopiska prover, såsom simning mikroorganismer 1,2 och mjuka material system 3,4, med minimal modifiering till en standard mikroskop setup. I denna uppsats en pedagogisk demonstration av DIHM tillhandahålls, centrerad kring mjukvara som utvecklats i vårt labb. Detta dokument innehåller en beskrivning av hur du ställer in mikroskopet, optimera datainsamling, och bearbeta de inspelade bilderna för att rekonstruera tredimensionella data. Mjukvaran (delvis baserad på programvara utvecklad av GD Grier och övriga 5) och exempelbilder är fritt tillgängliga på vår hemsida. En beskrivning ges av de åtgärder som krävs för att konfigurera mikroskopet, rekonstruera tredimensionella volymer från hologram och gör de resulterande volymerna av intresse med hjälp av en fri ray tracing programpaket. Dokumentet avslutas med en diskussion om faktorer som påverkar kvaliteten på återuppbyggnad, Och en jämförelse av DIHM med konkurrerande metoder. Även DIHM beskrevs för en tid sedan (för en allmän översyn av dess principer och utveckling, se Kim 6), har det som krävs datorkraft och bildbehandling expertis hittills till stor del begränsat dess användning till specialiserade forskargrupper med fokus på instrumentutveckling. Denna situation förändras mot bakgrund av de senaste framstegen inom data-och kamerateknik. Moderna datorer kan lätt klara av kraven datalagring bearbetning och, CCD eller CMOS-kameror finns i de flesta mikroskopi labb, och den nödvändiga mjukvaran görs fritt tillgänglig på internet av grupper som har investerat tid i att utveckla tekniken. Olika system har föreslagits för avbildning av utformningen av mikroskopiska objekt i en tredimensionell provvolymen. Många av dessa skannar tekniker 7,8, där en bunt bilder i följd med mechanically översätta bildplanet genom provet. Scanning konfokala fluorescensmikroskopi är kanske det mest kända exemplet. Typiskt är ett fluorescerande färgämne sattes till en fas-objektet för att uppnå en godtagbar nivå av provet kontrast och konfokala arrangemang användas för att rumsligt lokalisera fluorescerande emission. Denna metod har lett till betydande framsteg, till exempel i kolloid vetenskap där man har tillstånd att ha tillgång till de tredimensionella dynamiken i trånga system 9-11. Användningen av märkningen är en viktig skillnad mellan fluorescens konfokalmikroskopi och DIHM, men andra funktioner i de två teknikerna är värt att jämföra. DIHM har en betydande hastighet fördel av att apparaten inte har några rörliga delar. De mekaniska skanning speglar i konfokala system sätta en övre gräns för datainsamling hastighet - vanligtvis runt 30 bilder / sek för en 512 x 512 pixel bild. En stapel av sådana bilder från olika fokalplan kan erhållas genom att fysiskt translrande provstadiet eller objektiv mellan ramar, vilket leder till en slutlig fånga på cirka en volym per sekund för en 30 ram stack. Som jämförelse kan ett holografiskt system baserat på en modern CMOS-kamera fånga 2.000 bilder / sek vid samma bildstorlek och upplösning, varje ram bearbetas `offline&quot; för att ge en oberoende bild av provvolymen. För att upprepa: fluorescerande prov krävs inte för DIHM, även om ett system har utvecklats som utför holografisk rekonstruktion av ett fluorescerande ämne 12. Förutom tredimensionell volyminformation kan DIHM också användas för att åstadkomma kvantitativa faskontrast bilder 13, men det är utanför ramen för diskussionen här. Raw DIHM databilder är tvådimensionell, och i vissa avseenden ser ut som vanliga mikroskop bilder, om än ur fokus. Den huvudsakliga skillnaden mellan DIHM och standard ljusfältsmikroskopi ligger i de diffraktions ringar som omger föremålen in synfältet, och dessa är på grund av utformningen av belysningen. DIHM kräver en mer koherent källa än ljusa fält - vanligtvis en LED eller laser. De diffraktion ringarna i hologrammet innehålla de uppgifter som behövs för att rekonstruera en tredimensionell bild. Det finns två huvudsakliga metoder för att tolka DIHM uppgifter, direkt montering och numerisk omfokusering. Det första är tillämplig i de fall då den matematiska formen av diffraktionsmönster är känd på förhand 3,4, detta villkor är uppfyllt med en liten handfull enkla föremål som sfärer, cylindrar och halvplans hinder. Direkt montering gäller även i de fall där objektets axiella läge är känt, och bilden kan monteras med hjälp av en uppslagstabell i bildmallar 14. Den andra metoden (numerisk omfokusering) är något mer allmänt och förlitar sig på att använda diffraktion ringarna i den tvådimensionella hologram bilden för att numeriskt rekonstruera det optiska fältet vidett antal (godtyckligt placerade) fokalplan hela provvolymen. Flera relaterade metoder finns för att göra detta 6, detta arbete använder Rayleigh-Sommerfeld tillbaka förökning teknik som beskrivs av Lee och Grier 5. Resultatet av detta förfarande är en bunt bilder som efterliknar effekten av att manuellt ändra mikroskopets fokalplan (därav namnet `numeriska omfokusering&quot;). När en stapel av bilder har genererats, måste positionen hos objektet i fokalvolymen erhållas. Ett antal bildanalys heuristik, såsom lokal intensitet varians eller innehåll spatial frekvens, har lagts fram för att kvantifiera skärpan i fokus vid olika punkter i provet 15. I samtliga fall när en viss bild metrisk är maximerad (eller minimeras) är objektet anses vara i fokus. Till skillnad från andra system som syftar till att identifiera en viss fokalplan där ett objekt är &quot;i fokus&quot;, den metod som i detta arbete plockar ut points som ligger i objektet av intresse, som kan sträcka sig över ett brett spektrum av fokalplan. Denna metod kan tillämpas på ett brett spektrum av ämnen och är särskilt lämplig för längre, svagt-spridnings prover (fas objekt), såsom stavformiga kolloider, kedjor av bakterier eller eukaryota flageller. I sådana prover som förändrar bildkontrast när objektet passerar genom fokalplanet, en defokuserad bild har en ljuscentrum om objektet är på ena sidan av fokalplanet och en mörk centrum om den är på den andra. Rena fas objekt har liten eller ingen skillnad när de ligger precis i fokalplanet. Detta fenomen av kontrast inversion har diskuterats av andra författare 16,17 och är i slutändan beror på Gouy fasen anomali 18. Detta har lagts på en strängare villkor i samband med holografi annat håll, där gränserna för tekniken utvärderas, den typiska osäkerheten i position är i storleksordningen 150 nm (ungefär en pixel) i each riktning 19. Den Gouy fas anomali metoden är en av de få väldefinierade DIHM system för att bestämma strukturen för utökade objekt i tre dimensioner, men ändå vissa objekt är problematiskt att rekonstruera. Objekt som ligger direkt längs den optiska axeln (pekar på kameran) är svåra att rekonstruera exakt, osäkerheter i längden och objektets position blir stora. Denna begränsning är delvis på grund av den begränsade bitdjup pixlarna inspelnings hologrammet (antalet distinkta gråskalor som kameran kan spela in). En annan problematisk konfiguration uppstår när objektet av intresse är mycket nära fokalplanet. I detta fall är de reella och virtuella bilder av objektet rekonstrueras i omedelbar närhet, vilket ger upphov till komplicerade optiska fält som är svåra att tolka. En andra, något mindre viktig fråga här är att de resulterande diffraktion fransar upptar mindre av bildsensorn, och denna grövre korniga information leder till en sämre kvalitet rekonstruktion. I praktiken är en enkel gradient filter tillämpas på tredimensionella rekonstruerade volymer för att upptäcka starka intensitet inversioner längs belysningsriktningen. Regioner där intensitet ändras snabbt från ljust till mörkt, eller vice versa, är sedan associerad med spridnings regioner. Svagt spridande föremål är väl beskrivas som ett icke-interagerande samling av sådana element 20, och dessa individuella bidrag summa att ge den totala spridda fält som lätt kan inverteras med hjälp av Rayleigh-Sommerfeld back propagation metod. I detta dokument är den axiella intensitets gradient teknik tillämpas på en kedja av Streptococcus-celler. Cell kroppar är fas objekt (arten E. coli har ett brytningsindex mätt 21 för att vara 1.384 vid en våglängd λ = 589 nm, den Streptococcus stammen är sannolikt är liknande) och visas som en högintensiv kedja anslutna blobbar i the provvolym efter gradientfiltret har tillämpats. Standard tröskel-och feature extraction metoder som tillämpas på denna filtrerade volymen tillåta extraktionen av volymetriska pixlar (voxlar) som motsvarar regionen inuti cellerna. En särskild fördel med denna metod är att den tillåter otvetydig rekonstruktion av ett objekts position i den axiella riktningen. Liknande metoder (åtminstone de som rekord hologram nära objektet, avbildas genom ett mikroskop objektiv) lider av att inte kunna bestämma tecknet på denna förskjutning. Trots att Rayleigh-Sommerfeld rekonstruktion metod är också anmäla oberoende i denna mening tillåter lutning operationen oss att skilja mellan svaga fas föremål ovanför och nedanför fokalplanet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="780">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:180px;">Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope</td>
			<td style="width:187px;">Nikon Corp.</td>
			<td style="width:147px;"> </td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:180px;">LED</td>
			<td style="width:187px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:147px;">M660L3</td>
			<td style="width:267px;">emission wavelength &#955;=660 nm, linewidth approximately 20 nm </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:180px;">LED power supply</td>
			<td style="width:187px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:147px;">LEDD1B</td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:180px;">Thread Adapter</td>
			<td style="width:187px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:147px;">SM2T2</td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:180px;">Thread Adapter</td>
			<td style="width:187px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:147px;">SM1A2</td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:180px;">Frame Grabber board</td>
			<td style="width:187px;">EPIX </td>
			<td style="width:147px;">PIXCI E4 </td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:180px;">High-Speed CMOS camera</td>
			<td style="width:187px;">Mikrotron</td>
			<td style="width:147px;">MC-1362</td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

digital inline holographic microscopy (dihm) of weakly-scattering subjects

Svagt spridande föremål, såsom små kolloidala partiklar och de flesta biologiska celler, är ofta påträffas i mikroskopi. I själva verket har en rad tekniker utvecklats för att bättre visualisera dessa fas föremål, faskontrast och DIC är bland de mest populära metoderna för att öka kontrasten. Dock återstår att spela in position och form i out-of-imaging-planet riktning utmanande. Denna rapport presenterar en enkel experimentell metod för att exakt bestämma läge och geometri av objekt i tre dimensioner, med hjälp av digital inline holografisk mikroskopi (DIHM). I stort sett är den tillgängliga provvolym som definieras av kamerans sensor storlek i sidoriktningen, och belysningens enhetlighet i den axiella riktningen. Typiska provvolymer varierar från 200 ìm x 200 ìm x 200 ìm med hjälp av LED-belysning, till5 mm x 5 mm x 5 mm eller större med användning av laserbelysning. Denna belysningsljus är konfigurerad så att plana vågor infaller på provet. Objekt i provvolymen sprider sedan ljus, som stör den ospridda ljus bildar interferensmönster vinkelrätt mot belysningsriktningen. Detta avbildar (hologrammet) innehåller den djupinformation som krävs för tredimensionell rekonstruktion, och kan fångas upp på en standard avbildningsanordning, såsom en CMOS-eller CCD-kamera. Rayleigh-Sommerfeld back propagation metod används för att numeriskt refocus mikroskopbilder, och en enkel avbildning heuristisk baserad på Gouy fas anomali används för att identifiera scattering objekt inom den rekonstruerade volymen. Denna enkla men robust metod resulterar i en otvetydig, modell-fri mätning av läge och form av föremål i mikroskopiska prover.

För att visa möjligheterna med DIHM, utfördes experiment på en kedja av Streptococcus-bakterier. Kedjan själv mätte 10,5 mm lång, och bestod av 6-7 sfärens och cylindriska celler (två av cellerna i kedjan är nära att dela) med diametrar i intervallet 0,6-1 um. Figurerna 1a och 1b visar de viktigaste gränssnittet för återuppbyggnad och renderingsprogram. Exempel på den numeriska omfokusering förfarandet ses i figur 2, där en spatial bandpassfilt...

Watch this Scientific Journal Video about Digital Inline Holographic Microscopy DIHM of Weakly-scattering Subjects at JoVE.com

Digital Inline Holographic Microscopy DIHM of Weakly-scattering Subjects

De tredimensionella platser för svagt spridande objekt kan identifieras med hjälp av digital inline holografisk mikroskopi (DIHM), vilket innebär en mindre ändring av ett standardmikroskop. Vår programvara använder en enkel avbildning heuristisk kopplas med Rayleigh-Sommerfeld back-förökning för att ge det tredimensionella positionen och geometrin hos en mikroskopisk fas objektet.

Digital Inline Holographic mikroskopi (DIHM) av svagt-spridnings Ämnen

Weakly-scattering objects, such as small colloidal particles and most biological cells, are frequently encountered in microscopy. Indeed, a range of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Digital Inline Holographic Microscopy (DIHM) of Weakly-scattering Subjects

Determining heat and mechanical pain threshold in inflamed skin of human subjects

Fastställande värme och mekanisk smärttröskel i inflammerade human hud

In a previous article in the Journal of Visualized Experiments we have demonstrated skin microdialysis techniques for the collection of tissue-specific ...

Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing

Digital Mikrofluidik för automatiserad proteomik Processing

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Time-lapse avbildning av Mitos Efter siRNA Transfektion

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Klon Spårning av hematopoetiska stam och progenitorceller märkta med fem fluorescerande proteiner med hjälp Konfokal och multifoton mikroskopi

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Spårning av Hematopoietic Stem och stamceller i vuxen mus calvarial Benmärg

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Enkel Bulk Avläsning av digitala Nucleic Acid Kvantifiering Analyser

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Magnetisk-aktiverad Cell sortering strategier för att isolera och rena Synovial vätska-Derived mesenkymala stamceller från en kanin-modell

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

Micron-scale Phenotyping Techniques of Maize Vascular Bundles Based on X-ray Microcomputed Tomography

Micron-skala fenotypning tekniker för majs kärlknippena baserat på röntgen Microcomputed tomografi

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Biologiska provberedning genom högtrycks frysning, mikrovågsugn-assisted kontrastförbättring, och Minimal harts inbäddning för volym Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...