Name: determination of tolerable fatty acids and cholera toxin concentrations using human intestinal epithelial cells and balb/c mouse macrophages
Uploaded: 2013-05-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of Tolerable Fatty Acids and Cholera Toxin Concentrations Using Human Intestinal Epithelial Cells and BALB/c Mouse Macrophages at JoVE.com

Vi takker Paula Cobos og Dr. Evros Vassiliou for lab assistanse og gi musen makrofager, henholdsvis. Vi takker også våre lab manager Richard Criasia for veiledning og hjelp med materialer. Til slutt, forfatterne takke Ramanpreet Kaur for å få hjelp med videoproduksjon.

En. Tissue Culture <ol><li> Bruk Mus musculus makrofager (BALB / c mus) for koleratoksin bestemmelser. Utgangspunktet kultur alle M. musculus celler etter leverandørens anvisninger. </li><li> Forplante BALB / c muse-celler i Dulbeccos modifiserte Eagles medium med L-glutamin gjennomført med 10% føtalt bovint serum og 1% antibiotika / antimykotiske eller RPMI 1640 basen media gjennomført med 10% føtalt bovint serum, 5% L-glutamin, og ett % antibiotika / antimycotic reagens. </li><li> Dyrk celler ...

<ol>
	<li>Franceur, M. L., Golden, G. M., Potts, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oleic+Acid:+Its+effects+on+stratum+corneum+in+relation+to+(trans)+dermal+drug+delivery.">Oleic Acid: Its effects on stratum corneum in relation to (trans) dermal drug delivery.</a> Pharm Res. 7 (6), 621-627 (1990).</li><li>Tandon, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+diffraction+and+spectroscopic+studies+of+oleic+acid-sodium+acetate.">X-ray diffraction and spectroscopic studies of oleic acid-sodium acetate.</a> Chem. Phys. Lipids. 109 (1), 37-45 (1990).</li><li>Kris-Etherton, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+debate+about+n-6+polyunsaturated+fatty+acid+recommendations+for+cardiovascular+health.">The debate about n-6 polyunsaturated fatty acid recommendations for cardiovascular health.</a> Journal of the American Diabetic Association. 110 (2), 201-204 (2010).</li><li>Rizzo, W. B., Phillips, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adrenoleukodystrophy:+dietary+oleic+acid+lowers+hexacosanoate+levels.">Adrenoleukodystrophy: dietary oleic acid lowers hexacosanoate levels.</a> Annals of Neurology. 21 (3), 232-239 (1987).</li><li>Bozan, B., Temelli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+composition+and+oxidative+stability+of+flax,+safflower+and+poppy+seed+and+seed+oil.">Chemical composition and oxidative stability of flax, safflower and poppy seed and seed oil.</a> Bioresource Tech. 99, 6354-6359 (2005).</li><li>Krein, S., Meldurm, H., Hawkins, S., Foy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+benefits+of+conjugated+linoleic+acid+to+3-dimensional+wrinkle+morphology.">Clinical benefits of conjugated linoleic acid to 3-dimensional wrinkle morphology.</a> J. American Academy of Dermatology. 60 (3), AB30 (2009).</li><li>Yu, Y., Correll, P. H., Heuvel, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugated+linoleic+acid+decreases+production+of+pro-inflammatory+products+in+macrophages:+Evidence+for+a+PPARy+dependent+mechanism.">Conjugated linoleic acid decreases production of pro-inflammatory products in macrophages: Evidence for a PPARy dependent mechanism.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1581 (3), 89-99 (2002).</li><li>Palombo, J., Ganguly, A., Bistrian, B., Menard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anti-proliferative+effects+of+biologically+active+isomers+of+conjugated+linoleic+acid+on+human+colorectal+and+prostatic+cancer+cells.">The anti-proliferative effects of biologically active isomers of conjugated linoleic acid on human colorectal and prostatic cancer cells.</a> Cancer Letters. 177, 163-172 (2002).</li><li>Granda, M., Sinclair, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acids+and+obesity.">Fatty acids and obesity.</a> Current Pharm. Design. 15 (36), 4117-4125 (2009).</li><li>Rosenstein, E., Kushner, L., Kramer, N., Kazandjian, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pilot+study+of+dietary+fatty+acid+supplementation+in+the+treatment+of+adult+periodontitis.">Pilot study of dietary fatty acid supplementation in the treatment of adult periodontitis.</a> Prostaglandins, Leukotrienes and Essential F.A. 68 (3), 213-218 (2003).</li><li>Ferretti, A., Flanagan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antithromboxane+activity+of+dietary+alpha-linolenic+acid:+a+pilot+study.">Antithromboxane activity of dietary alpha-linolenic acid: a pilot study.</a> Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids. 54 (6), 451-455 (1995).</li><li>Arpita, C., Pradeep, K. D., Chowdhury, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Fatty+Acids+and+Cholesterol+Present+in+Bile+on+Expression+of+Virulence+Factors+and+Motility+of+Vibrio+cholera.">Effect of Fatty Acids and Cholesterol Present in Bile on Expression of Virulence Factors and Motility of Vibrio cholera.</a> Infection and Immunity. 75 (4), 1946-1953 (2007).</li><li>Yamasaki, S., Asakura, M., Neogi, S. B., Hinenoya, A., Iwaoka, E., Aoki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+virulence+potential+of+Vibrio+cholerae+by+natural+compounds.">Inhibition of virulence potential of Vibrio cholerae by natural compounds.</a> Indian J. Med. Res. 133 (2), 232-239 (2011).</li><li>Hendriksen, R. S., Price, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+Genetics+of+Vibrio+cholerae+from+Nepal+in+2010:+Evidence+on+the+origin+of+the+Haitian+outbreak.">Population Genetics of Vibrio cholerae from Nepal in 2010: Evidence on the origin of the Haitian outbreak.</a> mBio. 2 (4), 1-6 (2011).</li><li>Schaeffler, A., Gross, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid-induced+induction+of+Toll-like+receptor-4/nuclear+factor-kappa+B+pathway+in+adipocytes+links+nutritional+signaling+with+innate+immunity.">Fatty acid-induced induction of Toll-like receptor-4/nuclear factor-kappa B pathway in adipocytes links nutritional signaling with innate immunity.</a> Immunology. 126 (2), 233-245 (2009).</li></ol>

Forslag av Konsentrasjon av fettsyrer og koleratoksin Mens den eksakte mekanismen for hvordan fettsyrer styrke slimhinnene immunitet er ukjent, har flere studier forsøkt å undersøke sine gunstige virkninger. Vår undersøkelse som mål å gi metode for å bestemme den maksimale konsentrasjon av fettsyrer som celler kan tåle, så vel som den maksimale konsentrasjonen av koleratoksin at cellene kan tolerere uten en betydelig innflytelse på celle-overlevelse. For ...

De helsemessige fordeler av fettsyrer, som oljesyre, linolsyre og linolensyre har vært og fortsetter å være dokumentert. For eksempel bidrar oljesyre lette penetrering av lipofile legemidler i kroppen 1,2, reduserer koronar hjertesykdom med 24% når erstatte mettede fettsyrer 3, og benyttes for å behandle metabolske sykdommer slik som Adrenoleukodystrophy 4 som er en X-bundet genetisk forstyrrelse av fettsyremetabolisme. . Mens et nødvendig forstadium for arakidonsyre hos pattedyr, linolsyre (i motsetning oljesyre) ikke syntetiseres av kroppen og må innhentes gjennom eksterne kilder som for eksempel ved linfrø forbruk 5 Studier viser flere gunstige helseeffekter av linolsyre slik som: anti-aging egenskaper for huden, 6 anti-inflammatoriske egenskaper, 7 redusert spredning av colorectal og prostata karcinomceller, 8 og evnen til å bekjempe fedme og markedsføring of kardiovaskulær helse. 9. linolensyre spiller en rolle i å redusere periodontal inflammasjon, 10 og modulering av tromboksan og prostacyclin biosyntese. 11. Arpita 12 studert påvirkning av galle fettsyrer og kolesterol på V. cholerae &#39;s uttrykk for virulens faktorer og bevegelighet. Yamasaki 13 indikerte at metanol ekstrakt fra rød chili peppers, og andre naturlig utvunnet forbindelser, kan potensielt redusere kolera toksin produksjon. Det er tenkelig å vurdere bruken av næringsmidler som er rike på de ovennevnte fettsyrer (slik som linfrø) i forebygging og bekjempelse av infeksjonssykdommer som kolera gjennom gi mukosal immunitet. Vi har utført undersøkelser for å oppløseliggjøre fettsyrer og å bestemme, ved hjelp av celleproliferasjon analyser, den maksimale konsentrasjonen av fettsyrer som humane intestinale epitelceller kan tolerere uten uheldige virkninger på cell levedyktighet. Vi antok at oljesyre, linolsyre og linolensyre og gi en gunstig effekt på cellelevedyktighet ved lavere konsentrasjoner, men at ved høyere konsentrasjoner vil de være toksisk for cellene. Vi har også solubilisert koleratoksin og bestemmes den maksimale konsentrasjonen av koleratoksin som BALB / C-mus-makrofager kan tolerere uten en betydelig reduksjon i cellelevedyktighet. Vi hypotese en toksisk effekt av koleratoksin på cellelevedyktighet selv ved svært lavt nivå. Fremgangsmåten til å oppløseliggjøre en koleratoksin og bruke den til å bestemme den maksimale mengde av det giftstoff som cellene kan tolerere uten en betydelig reduksjon i overlevelsesevne gir en fordel for fremtidige studier. For eksempel kan en kombinasjon av de ovennevnte metoder anvendes for å bestemme hvorvidt fettsyrer gir celler med mukosal immunitet mot kolera infeksjoner. Så langt vi kjenner til, har denne rasjonelle og metodikk ikke blitt utforsket. Vi discuss hvordan våre foreløpige data som kan brukes i senere undersøkelser for å bestemme om oljesyre, linolsyre og linolensyre og gir celler med mukosal immunitet mot kolera-infeksjon.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cells/Reagent</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mus musculus macrophages</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC RAW 264.7</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2002</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2115</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fetal bovine serum </td>
			<td>Bio-west</td>
			<td>S0250</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Antibiotic/antimycotic </td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV3007901</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Human intestinal epithelial cells </td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATTC CCL-241</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>HybriCare media </td>
			<td>ATCC</td>
			<td>46-X</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Oleic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O1008</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Linoleic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L-1376</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Linolenic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L-2376</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cholera toxin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8052</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>BD Falcon 96-Well Cell Culture Plates</td>
			<td>BD Biosciences </td>
			<td>351172</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Spectrophotometer with Dynex Revelations 4.22 software</td>
			<td>Dynex</td>
			<td>91000101</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

determination of tolerable fatty acids and cholera toxin concentrations using human intestinal epithelial cells and balb/c mouse macrophages

Den positive rolle av fettsyrer i forebygging og lindring av humane og ikke-menneskelige sykdommer har vært og fortsetter å bli omfattende dokumentert. Disse roller inkluderer påvirkninger på infeksiøse og ikke-infeksiøse sykdommer, inkludert forebyggelse av betennelser samt mukosal immunitet mot infeksjonssykdommer. Cholera er en akutt intestinal sykdom forårsaket av bakterien Vibrio cholerae. Det forekommer i utviklingsland, og hvis venstre ubehandlet, kan føre til døden. Mens vaksiner for kolera eksisterer, er de ikke alltid effektive og andre forebyggende metoder er nødvendig. Vi ville finne ut tålelig konsentrasjoner av tre fettsyrer (oljesyre, linolsyre og linolensyre syrer) og kolera toksin ved hjelp av musen BALB / C makrofager og menneskelige intestinal epitelceller, henholdsvis. Vi solubilisert de ovennevnte fettsyrer og celleproliferasjon assays som brukes for å bestemme de konsentrasjonsområder og spesifikke konsentrasjoner av de fettsyrer som er not skadelige for menneskers tarmepitel celle levedyktighet. Vi solubilisert koleratoksin og brukt det i en analyse for å bestemme de konsentrasjonsområder og spesifikke konsentrasjoner av koleratoksin som ikke statistisk redusere cellenes levedyktighet i BALB / C-makrofager. Vi fant de optimale fettsyrekonsentrasjoner å være mellom 1-5 ng / mL, og at det for koleratoksin å være &lt;30 ng per behandling. Disse dataene kan hjelpe fremtidige studier som tar sikte på å finne en beskyttende slimhinne rolle for fettsyrer i forebygging eller lindring av kolera infeksjoner.

Fastsettelse av Optimum Konsentrasjon av fettsyrer Den optimale konsentrasjon for fettsyrer er definert som den maksimale konsentrasjon ved hvilken cellevekst er sammenlignbar med eller høyere enn for kontroll-celler, med relativt lav variasjon i resultatene. For å bestemme den optimale konsentrasjon av oljesyre, linolsyre og linolensyre ble syrer celler innledningsvis behandlet med varierende konsentrasjoner av hver fettsyre i store trinn og senere med mindre trinn. Figur 1 ...

Watch this Scientific Journal Video about Determination of Tolerable Fatty Acids and Cholera Toxin Concentrations Using Human Intestinal Epithelial Cells and BALB/c Mouse Macrophages at JoVE.com

Determination of Tolerable Fatty Acids and Cholera Toxin Concentrations Using Human Intestinal Epithelial Cells and BALB/c Mouse Macrophages

Vi ville finne ut tålelig konsentrasjoner av tre fettsyrer (oljesyre, linolsyre og linolensyre) og kolera toksin som ikke betydelig negativ innvirkning celle overlevelse ved oppløsning av de fettsyrer og toksin og bruke dem i celle overlevelse analyser.

Fastsettelse av tolerable fettsyrer og koleratoksin Konsentrasjoner med humane Intestinal Epitelceller og BALB / c mus makrofager

The positive role of fatty acids in the prevention and alleviation of non-human and  human diseases have been and continue to be extensively documented. ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Anvendelse av en Mouse Ligated Peyer er Patch Intestinal Loop Assay å evaluere Bakteriell Opptak av M celler

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

Isolering og karakterisering av dendrittiske celler og makrofager fra musen Intestine

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Visualisering av bakteriell Toxin Utførte Responses ved hjelp av Live Cell fluorescensmikroskopi

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

Enteriske Bakteriell invasjon av intestinal Epitelceller<em&gt; In Vitro</em&gt; Er dramatisk forbedret ved hjelp av en vertikal Diffusion Chamber Model

The interactions of bacterial pathogens with host cells have been investigated extensively using in vitro cell culture methods. However as such cell ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

Isolering av myeloid dendrittiske celler og Epitelceller fra Menneskelig Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Ved hjelp av RNA-interferens for å undersøke det medfødte immunrespons i Musemakrofager

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

Immunofluorescence Analysis of Stress Granule Formation After Bacterial Challenge of Mammalian Cells

Immunofluorescensanalyse av stress-granulatdannelse etter bakteriell utfordring av mammalceller

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of ...

Saturated Fatty Acids Induce Ceramide-associated Macrophage Cell Death

Mettede fettsyrer indusere celledød Ceramide-assosiert Macrophage

Macrophages highly express epidermal fatty acid-binding protein and adipose fatty acid-binding protein. They actively uptake saturated and unsaturated ...

Mouse- and Human-derived Primary Gastric Epithelial Monolayer Culture for the Study of Regeneration

Mus - og menneske-avledet primære mage Epithelial Monolayer kultur for studier av gjenfødelse

In vitro studies of gastric wound repair typically involves the use of gastric cancer cell lines in a scratch-wound assay of cellular proliferation and ...

Induction of Drug-Induced, Autoimmune Hepatitis in BALB/c Mice for the Study of Its Pathogenic Mechanisms

Induksjon av legemiddelindusert, autoimmun hepatitt hos BALB/c mus for studier av dets patogene mekanismer

Drug-induced autoimmune hepatitis (DIH) is the most common hepatic drug-induced hypersensitization process observed in approximately 9 to 12% of patients ...