Name: determination of tolerable fatty acids and cholera toxin concentrations using human intestinal epithelial cells and balb/c mouse macrophages
Uploaded: 2013-05-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of Tolerable Fatty Acids and Cholera Toxin Concentrations Using Human Intestinal Epithelial Cells and BALB/c Mouse Macrophages at JoVE.com

Vi tackar Paula Cobos och Dr Evros Vassiliou för lab stöd och tillhandahålla musmakrofager, respektive. Vi vill också tacka våra lab manager Richard Criasia för vägledning och hjälp med material. Slutligen författarna tackar Ramanpreet Kaur för hjälp med videoproduktion.

Ett. Tissue Culture <ol><li> Använd Mus musculus makrofager (BALB / c-möss) för koleratoxin bestämningar. Initialt kultur hela M. musculus celler efter leverantörens anvisningar. </li><li> Propagera BALB / c-möss celler i Dulbeccos modifierade Eagles medium med L-glutamin kompletterat med 10% fetalt bovint serum, och 1% antibiotika / antimykotisk eller RPMI 1640 basmedium kompletterat med 10% fetalt bovinserum, 5% L-glutamin, och 1 % antibiotika / antimykotika reagens. </li><li> Odla celler i 7...

<ol>
	<li>Franceur, M. L., Golden, G. M., Potts, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oleic+Acid:+Its+effects+on+stratum+corneum+in+relation+to+(trans)+dermal+drug+delivery.">Oleic Acid: Its effects on stratum corneum in relation to (trans) dermal drug delivery.</a> Pharm Res. 7 (6), 621-627 (1990).</li><li>Tandon, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+diffraction+and+spectroscopic+studies+of+oleic+acid-sodium+acetate.">X-ray diffraction and spectroscopic studies of oleic acid-sodium acetate.</a> Chem. Phys. Lipids. 109 (1), 37-45 (1990).</li><li>Kris-Etherton, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+debate+about+n-6+polyunsaturated+fatty+acid+recommendations+for+cardiovascular+health.">The debate about n-6 polyunsaturated fatty acid recommendations for cardiovascular health.</a> Journal of the American Diabetic Association. 110 (2), 201-204 (2010).</li><li>Rizzo, W. B., Phillips, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adrenoleukodystrophy:+dietary+oleic+acid+lowers+hexacosanoate+levels.">Adrenoleukodystrophy: dietary oleic acid lowers hexacosanoate levels.</a> Annals of Neurology. 21 (3), 232-239 (1987).</li><li>Bozan, B., Temelli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+composition+and+oxidative+stability+of+flax,+safflower+and+poppy+seed+and+seed+oil.">Chemical composition and oxidative stability of flax, safflower and poppy seed and seed oil.</a> Bioresource Tech. 99, 6354-6359 (2005).</li><li>Krein, S., Meldurm, H., Hawkins, S., Foy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+benefits+of+conjugated+linoleic+acid+to+3-dimensional+wrinkle+morphology.">Clinical benefits of conjugated linoleic acid to 3-dimensional wrinkle morphology.</a> J. American Academy of Dermatology. 60 (3), AB30 (2009).</li><li>Yu, Y., Correll, P. H., Heuvel, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugated+linoleic+acid+decreases+production+of+pro-inflammatory+products+in+macrophages:+Evidence+for+a+PPARy+dependent+mechanism.">Conjugated linoleic acid decreases production of pro-inflammatory products in macrophages: Evidence for a PPARy dependent mechanism.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1581 (3), 89-99 (2002).</li><li>Palombo, J., Ganguly, A., Bistrian, B., Menard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anti-proliferative+effects+of+biologically+active+isomers+of+conjugated+linoleic+acid+on+human+colorectal+and+prostatic+cancer+cells.">The anti-proliferative effects of biologically active isomers of conjugated linoleic acid on human colorectal and prostatic cancer cells.</a> Cancer Letters. 177, 163-172 (2002).</li><li>Granda, M., Sinclair, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acids+and+obesity.">Fatty acids and obesity.</a> Current Pharm. Design. 15 (36), 4117-4125 (2009).</li><li>Rosenstein, E., Kushner, L., Kramer, N., Kazandjian, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pilot+study+of+dietary+fatty+acid+supplementation+in+the+treatment+of+adult+periodontitis.">Pilot study of dietary fatty acid supplementation in the treatment of adult periodontitis.</a> Prostaglandins, Leukotrienes and Essential F.A. 68 (3), 213-218 (2003).</li><li>Ferretti, A., Flanagan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antithromboxane+activity+of+dietary+alpha-linolenic+acid:+a+pilot+study.">Antithromboxane activity of dietary alpha-linolenic acid: a pilot study.</a> Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids. 54 (6), 451-455 (1995).</li><li>Arpita, C., Pradeep, K. D., Chowdhury, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Fatty+Acids+and+Cholesterol+Present+in+Bile+on+Expression+of+Virulence+Factors+and+Motility+of+Vibrio+cholera.">Effect of Fatty Acids and Cholesterol Present in Bile on Expression of Virulence Factors and Motility of Vibrio cholera.</a> Infection and Immunity. 75 (4), 1946-1953 (2007).</li><li>Yamasaki, S., Asakura, M., Neogi, S. B., Hinenoya, A., Iwaoka, E., Aoki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+virulence+potential+of+Vibrio+cholerae+by+natural+compounds.">Inhibition of virulence potential of Vibrio cholerae by natural compounds.</a> Indian J. Med. Res. 133 (2), 232-239 (2011).</li><li>Hendriksen, R. S., Price, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+Genetics+of+Vibrio+cholerae+from+Nepal+in+2010:+Evidence+on+the+origin+of+the+Haitian+outbreak.">Population Genetics of Vibrio cholerae from Nepal in 2010: Evidence on the origin of the Haitian outbreak.</a> mBio. 2 (4), 1-6 (2011).</li><li>Schaeffler, A., Gross, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid-induced+induction+of+Toll-like+receptor-4/nuclear+factor-kappa+B+pathway+in+adipocytes+links+nutritional+signaling+with+innate+immunity.">Fatty acid-induced induction of Toll-like receptor-4/nuclear factor-kappa B pathway in adipocytes links nutritional signaling with innate immunity.</a> Immunology. 126 (2), 233-245 (2009).</li></ol>

Förslag på koncentration av fettsyror och koleratoxin Även om den exakta mekanismen för hur fettsyror ökar slemhinneimmunitet är okänd, har flera studier försökt att undersöka de positiva effekterna. Vår studie syftar till att ge metoder för att bestämma den maximala koncentrationen av fettsyror som cellerna tål såväl som den högsta koncentration av kolera toxin som celler kan tolerera utan ett betydande inflytande på cellens överlevnad. För att ...

De positiva hälsoeffekterna av fettsyror, såsom oljesyra, linolsyra och linolensyra har varit och fortsätter att dokumenteras. Till exempel hjälper oljesyra underlätta penetrering av lipofila läkemedel i kroppen 1,2, minskar kranskärlssjukdom med 24% när den är substituerad för mättade fettsyror 3, och används för att behandla metabola sjukdomar såsom adrenoleukodystrophy 4 vilken är en X-länkade genetisk störning i fettsyra metabolismen. . Medan en nödvändig förelöpare för arakidonsyra i däggdjur, linolsyra (till skillnad oljesyra) inte syntetiseras av kroppen och måste erhållas genom externa källor såsom av linfrön konsumtion 5 Studier visar flera positiva hälsoeffekter av linolsyra, såsom: anti-åldrande egenskaper för huden; 6 anti-inflammatoriska egenskaper, 7 minskad spridning av kolorektal-och prostatacancer celler, 8 och förmågan att bekämpa fetma och främjande of kardiovaskulär hälsa. 9 Linolensyra spelar en roll för att minska parodontal inflammation, 10 och modulerande tromboxan och prostacyklin biosyntes. 11 Arpita 12 studerat påverkan av galla fettsyror och kolesterol på V. cholerae &#39;s uttryck av virulensfaktorer och motilitet. Yamasaki 13 visade att metanol extrakt från röd chilipeppar, och andra naturligt extraherade föreningar, potentiellt kan minska kolera toxin produktion. Det är tänkbart att överväga användningen av livsmedel som är rika på dessa fettsyror (t.ex. linfrön) i förebyggande och lindring av infektiösa sjukdomar såsom kolera genom att ge slemhinneimmunitet. Vi genomförde undersökningar för att lösa fettsyror och att bestämma, med hjälp cellproliferationsanalyser, den högsta koncentrationen av fettsyror som mänskliga tarmepitelceller kan tolerera utan skadliga effekter på cell livskraft. Vi antog att oljesyra, linolsyra och linolensyra ger en gynnsam effekt på cellviabilitet vid lägre koncentrationer, men att vid högre koncentrationer de kommer att vara toxiska för cellerna. Vi solubiliserade också koleratoxinet och bestäms den maximala koncentrationen av koleratoxin att BALB / C-musmakrofager kan tolerera utan en signifikant minskning i cellviabilitet. Vår hypotes är en toxisk effekt av kolera toxin på cellviabilitet även vid mycket låg nivå. Metoden att solubilisera en kolera toxin och använda den för att bestämma den maximala mängden av toxin som cellerna tål utan en signifikant minskning av överlevnadsförmåga ger en fördel för framtida studier. Till exempel kan en kombination av ovanstående metoder kan användas för att avgöra om fettsyror ger celler med slemhinneimmunitet mot kolera infektioner. Så vitt vi känner till har denna rationella och metodik inte undersökts. Vi discuss hur våra preliminära data kan användas i senare undersökningar för att avgöra om oljesyra, linolsyra och linolensyra ger celler med slemhinneimmunitet mot kolera infektion.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cells/Reagent</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mus musculus macrophages</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC RAW 264.7</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2002</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2115</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fetal bovine serum </td>
			<td>Bio-west</td>
			<td>S0250</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Antibiotic/antimycotic </td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV3007901</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Human intestinal epithelial cells </td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATTC CCL-241</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>HybriCare media </td>
			<td>ATCC</td>
			<td>46-X</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Oleic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O1008</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Linoleic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L-1376</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Linolenic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L-2376</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cholera toxin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8052</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>BD Falcon 96-Well Cell Culture Plates</td>
			<td>BD Biosciences </td>
			<td>351172</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Spectrophotometer with Dynex Revelations 4.22 software</td>
			<td>Dynex</td>
			<td>91000101</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

determination of tolerable fatty acids and cholera toxin concentrations using human intestinal epithelial cells and balb/c mouse macrophages

Den positiva roll fettsyror vid förebyggande och lindring av icke-mänskliga och mänskliga sjukdomar har varit och fortsätter att vara väldokumenterade. Dessa roller inkluderar påverkan på smittsamma och icke-smittsamma sjukdomar inklusive förebyggande av inflammation samt slemhinneimmunitet till infektionssjukdomar. Kolera är en akut intestinal sjukdom som orsakas av bakterien Vibrio cholerae. Den förekommer i utvecklingsländer och om den lämnas obehandlad kan leda till döden. Medan vaccin för kolera existerar, de är inte alltid effektiva och andra förebyggande metoder behövs. Vi bestämde oss för att bestämma acceptabla koncentrationer av tre fettsyror (oljesyra, linolsyra och linolensyra) och kolera toxin med hjälp av mus BALB / C makrofager och humana tarmepitelceller, respektive. Vi solubiliserade ovanstående fettsyror och används cellanalyser spridning för att fastställa koncentrationsskillnaderna intervall och specifika koncentrationer av de fettsyror som är ingent skadliga för människors intestinala epitelceller livskraft. Vi löses kolera toxin och använt det i en analys för att fastställa koncentrationsintervallen och specifika koncentrationer av kolera toxin som inte statistiskt minskar cellviabiliteten i BALB / C makrofager. Vi fann de optimala fettsyrekoncentrationer att vara mellan 1-5 ng / ul, och den för koleratoxin att vara &lt;30 ng per behandling. Dessa data kan hjälpa framtida studier som syftar till att hitta en skyddande slemhinna roll för fettsyror i förebyggande eller lindring av kolera-infektioner.

Bestämning av den optimala koncentrationen av fettsyror Den optimala koncentrationen för fettsyror definieras som den maximala koncentration vid vilken celltillväxten är jämförbar med eller överstiger den för kontrollceller, med relativt låg variabilitet i resultat. För att bestämma den optimala koncentrationen av oljesyra, var linolsyra och linolensyra cellerna initialt behandlade med varierande koncentrationer av varje fettsyra i stora inkrement och senare med mindre steg. ...

Watch this Scientific Journal Video about Determination of Tolerable Fatty Acids and Cholera Toxin Concentrations Using Human Intestinal Epithelial Cells and BALB/c Mouse Macrophages at JoVE.com

Determination of Tolerable Fatty Acids and Cholera Toxin Concentrations Using Human Intestinal Epithelial Cells and BALB/c Mouse Macrophages

Vi bestämde oss för att bestämma acceptabla koncentrationer av tre fettsyror (oljesyra, linolsyra och linolensyra) och kolera toxin som inte signifikant och negativt påverkar cellens överlevnad genom att lösa de fettsyror och toxinet och använda dem i analyser cell överlevnad.

Fastställande av tolerabla fettsyror och kolera Koncentrationer Toxin Använda Human tarmepitelceller och BALB / c Macrophages Mouse

The positive role of fatty acids in the prevention and alleviation of non-human and  human diseases have been and continue to be extensively documented. ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Tillämpning av en mus knyts ihop Peyer s Patch Intestinal Loop-analys för att utvärdera Bakteriell Upptag av M celler

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

Isolering och karakterisering av dendritiska celler och makrofager från mus tarm

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Visualisering av bakterietoxin Inducerade svar Använda Live Mikroskopi Cell Fluorescens

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

Enteriskt Bakteriell invasion av tarmepitelceller<em&gt; In Vitro</em&gt; Dramatiskt förbättras med hjälp av en vertikal modell diffusionskammare

The interactions of bacterial pathogens with host cells have been investigated extensively using in vitro cell culture methods. However as such cell ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

Isolering av myeloida dendritiska celler och epitelceller från Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Att använda RNA-interferens för att undersöka det medfödda immunsvar i musmakrofager

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

Immunofluorescence Analysis of Stress Granule Formation After Bacterial Challenge of Mammalian Cells

Immunofluorescensanalys av stresskristallbildning efter bakteriell utmaning av däggdjursceller

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of ...

Saturated Fatty Acids Induce Ceramide-associated Macrophage Cell Death

Mättade fettsyror inducerar Ceramide-associerade makrofag celldöd

Macrophages highly express epidermal fatty acid-binding protein and adipose fatty acid-binding protein. They actively uptake saturated and unsaturated ...

Mouse- and Human-derived Primary Gastric Epithelial Monolayer Culture for the Study of Regeneration

Mus - och mänskliga-härledda primära Gastric epitelial enskiktslager kultur för studien av regenerering

In vitro studies of gastric wound repair typically involves the use of gastric cancer cell lines in a scratch-wound assay of cellular proliferation and ...

Induction of Drug-Induced, Autoimmune Hepatitis in BALB/c Mice for the Study of Its Pathogenic Mechanisms

Induktion av läkemedelsinducerad, autoimmun hepatit hos BALB / c-möss för studier av dess patogena mekanismer

Drug-induced autoimmune hepatitis (DIH) is the most common hepatic drug-induced hypersensitization process observed in approximately 9 to 12% of patients ...