Name: a quantitative assay to study protein:dna interactions, discover transcriptional regulators of gene expression, and identify novel anti-tumor agents
Uploaded: 2013-08-31T07:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents at JoVE.c

المساعدة التقنية والأجهزة لمرفق مركز Greenebaum السرطان بالحركة الأساسية جامعة ميريلاند، وخصوصا الدكاترة. رينا لابيدوس ومارايولا Sadowska، واعترف بامتنان. وقد تم تمويل هذا العمل المسؤول عن تطوير هذا الاختبار في جزء من المعاهد الوطنية للصحة RO1CA108846، AHA المنح التي تقدم للمساعدة GRNT2130014، جائزة الاستحقاق VA لAP، وجامعة ماريلاند السجائر صناديق الاسترداد (CRF) التي قدمت إلى ومارلين ستيوارت مركز السرطان Greenebaum.

يتم تنفيذ عدة خطوات في وقت سابق ويتم إعداد العديد من الكواشف وتخزينها قبل الإجراء: (1) زراعة الخلايا والبروتين العزلة، (2) إعداد نيوكليوتيدات دقيقة، (3) إعداد لوحات 96 بشكل جيد، (4) استخراج النووية الحضانة بين عشية وضحاها. الإجراء يتطلب 2 أيام بسبب الحضانة بين عشية وضحاها م...

<ol>
	<li>Hellman, L. M., Fried, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+mobility+shift+assay+(EMSA)+for+detecting+protein-nucleic+acid+interactions.">Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions.</a> Nat. Protoc. 2, 1849-1861 (2007).</li><li>Bhattacharya, N., Sarno, A., Idler, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+detection+of+nuclear+factor-kappaB+activity+using+a+sensitive+oligo-based+chemiluminescent+enzyme-linked+immunosorbent+assay.">High-throughput detection of nuclear factor-kappaB activity using a sensitive oligo-based chemiluminescent enzyme-linked immunosorbent assay.</a> Int. J. Cancer. 127, 404-411 (2010).</li><li>Hartzell, D. D., Trinklein, N. D., Mendez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+analysis+of+the+CREB+signaling+pathway+using+HaloCHIP-chip+and+high+throughput+reporter+assays.">A functional analysis of the CREB signaling pathway using HaloCHIP-chip and high throughput reporter assays.</a> BMC Genomics. 10, 497 (2009).</li><li>Vuori, K. A., Ahlskog, J. K., Sistonen, L., Nikinmaa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TransLISA,+a+novel+quantitative,+nonradioactive+assay+for+transcription+factor+DNA-binding+analyses.">TransLISA, a novel quantitative, nonradioactive assay for transcription factor DNA-binding analyses.</a> FEBS J. 276, 7366-7374 (2009).</li><li>D'Souza, D. R., Salib, M. M., Bennett, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperglycemia+Regulates+RUNX2+Activation+and+Cellular+Wound+Healing+through+the+Aldose+Reductase+Polyol+Pathway.">Hyperglycemia Regulates RUNX2 Activation and Cellular Wound Healing through the Aldose Reductase Polyol Pathway.</a> J. Biol. Chem. 284, 17947-17955 (2009).</li><li>Underwood, K. F., D'Souza, D. R., Mochin, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+RUNX2+transcription+factor-DNA+interactions+and+cell+proliferation+by+Vitamin+D3+(cholecalciferol)+prohormone+activity.">Regulation of RUNX2 transcription factor-DNA interactions and cell proliferation by Vitamin D3 (cholecalciferol) prohormone activity.</a> J. Bone Miner Res. 27, 913-925 (2012).</li><li>Held, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+ß-galactosidase+activity+using+the+PowerWave+HT+and+Gen5+data+analysis+software:+basic+enzyme+kinetic+determinations.">Kinetic analysis of ß-galactosidase activity using the PowerWave HT and Gen5 data analysis software: basic enzyme kinetic determinations.</a> Biotek Instruments Application Note. , (2007).</li><li>Renard, P., Ernest, I., Houbion, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+sensitive+multi-well+colorimetric+assay+for+active+NFkappaB.">Development of a sensitive multi-well colorimetric assay for active NFkappaB.</a> Nucleic Acids Res. 29, E21 (2001).</li><li>Pommier, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+topoisomerase+I+inhibitors:+chemistry,+biology,+and+interfacial+inhibition.">DNA topoisomerase I inhibitors: chemistry, biology, and interfacial inhibition.</a> Chem Rev. 109, 2894-2902 (2009).</li><li>Pennisi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomics.+ENCODE+project+writes+eulogy+for+junk+DNA.">Genomics. ENCODE project writes eulogy for junk DNA.</a> Science. 337, 1159-1161 (2012).</li></ol>

وتستخدم فحوصات الحمض النووي ملزم لقياس قدرة عوامل النسخ للتفاعل مع الحمض النووي. وتشمل فحوصات الحمض النووي ملزمة للتحول الكهربي التنقل (EMSA) 1 وimmuneprecipitation لونين (رقاقة) المقايسات مقرها 3 وكذلك فحوصات توظيف الأشكال 96-4 بشكل جيد مثل فحوصات chemiluminescent 2.</...

فحوصات الحمض النووي ملزم لها فائدة في قياس قدرة عوامل النسخ للتفاعل مع الحمض النووي. وتشمل فحوصات الحمض النووي لربط الكهربي المقايسات التحول التنقل (EMSA) التي تعتمد على أليغنوكليوتيد رديولبلد 1 أو 2 المقايسات معان كيميائي. كما تم وصفها المقايسات لونين immuneprecipitation (رقاقة) استنادا 3 وكذلك فحوصات توظيف الأشكال 96 جيدا 4. ومع ذلك، فإن EMSA هو فحص غير الكمية التي يتطلب استخدام أليغنوكليوتيد رديولبلد. عندما ربط البروتينات النووية مع تسلسل النوكليوتيدات محددة المروج والمجمعات الملزمة هي المتخلفين على المواد الهلامية بولكرلميد ويمكن التحقق من صحة عامل النسخ محددة مع الأجسام المضادة &quot;supershift&quot;. قمنا بتطوير فحص الحمض النووي ملزم الكمي باستخدام شكل انزيم مرتبط المناعي (D-ELISA)، والتي هي قادرة على قياس تفاعل RUNX2 مع تسلسل الحمض النووي ملزم المقابلة لعناصر المروج تعريف طالجينات المستهدفة ن RUNX2. استخدام الأضداد المضادة للRUNX2 يوفر خصوصية للفحص وعدم التمييز radiolabel هذا الاختبار من تحول جل مقايسة التقليدية 5. الكشف عن المجمعات ملزم هو ممكن مع استخدام الأجسام المضادة الثانوية إلى جانب أن الفجل البيروكسيداز (HRP)، والذي يحول الركيزة HRP، ميثيل البنزيدين (تمب) إلى منتج للتحليل الطيفي اللون. مقايسة ذكرت هنا يمكن دمج استخدام أليغنوكليوتيد] الحمض النووي تحور والضوابط، ويمكن استخدامها للكشف عن مثبطات تنافسية أو غير تنافسية من الحمض النووي ملزمة. فحص المركبات المضادة للورم الرواية من الممكن أيضا مع هذا الاختبار.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the Reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly dI/dC</td>
			<td>GE Healthcare, Piscataway, NJ</td>
			<td>US20539-5UN</td>
			<td>1 U ~50mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RUNX2 antibody</td>
			<td>MBL International Corp., Woburn, MA</td>
			<td>D130-3</td>
			<td>1 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fab-specific peroxidase conjugated antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>A9917</td>
			<td>7.1 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB Substrate (tetramethyl benzidine)</td>
			<td>EXALPHA Biologicals, Shirley, MA</td>
			<td>X1189S</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>57995</td>
			<td>Plate-fixing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric Acid</td>
			<td>VWR, West Chester, PA</td>
			<td>BDH-39922-1</td>
			<td>Stop solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-well plates</td>
			<td>Greiner Bio-One, Basel, Switzerland</td>
			<td>655996</td>
			<td>Avidin-coated, black sides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HALT</td>
			<td>Thermo-Scientific/Pierce, Rockford, IL</td>
			<td>78440</td>
			<td>Protease and phosphatase inhibitors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td>Various manufacturers</td>
			<td>Laboratory grade</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Table 1. Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer: Biotrak II Visible plate reader</td>
			<td>Amersham Biosciences</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>For use with stop reaction method</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer: Bio-Tek Synergy HT Multi-reaction microplate reader</td>
			<td>Bio-Tek Instruments, Inc.</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>For use with continuous kinetic monitoring</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Table 2. Equipment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a quantitative assay to study protein:dna interactions, discover transcriptional regulators of gene expression, and identify novel anti-tumor agents

وتستخدم العديد من فحوصات الحمض النووي ملزم مثل فحوصات الكهربي التحول التنقل (EMSA)، المقايسات chemiluminescent، مناعي لونين (رقاقة) القائم على المقايسات، ومقرها المقايسات multiwell لقياس النشاط عامل النسخ. ومع ذلك، فإن هذه المقايسات هي nonquantitative، تفتقر إلى الدقة، قد تنطوي على استخدام أليغنوكليوتيد رديولبلد، وربما لا تكون قابلة للتكيف لفحص مثبطات الحمض النووي ملزمة. من ناحية أخرى، وذلك باستخدام الحمض النووي ملزم انزيم مرتبط المناعي فحص الكمية (D-ELISA) الفحص، ونحن لشرح التفاعلات البروتين النووي مع الحمض النووي باستخدام عامل النسخ RUNX2 التي تعتمد على الجمعيات محددة مع الإجماع تسلسل الحمض النووي ملزم موجودة على البيوتين- [أليغنوكليوتيد المسمى. إعداد الخلايا، وصفت استخراج البروتين النووي، وتصميم أليغنوكليوتيد] الذين تقطعت بهم السبل مزدوجة. يتم إصلاحها لوحات 96 جيدا المغلفة أفيدين مع العازلة القلوية وحضنت مع البروتينات النووية في النوكليوتيدات عرقلة العازلة. الفلبسبب الغسيل واسعة من لوحات، والأجسام المضادة الأولية محددة وحضانات الضد الثانوية تليها إضافة الركيزة البيروكسيداز الفجل وتطوير رد الفعل اللونية. واستخدمت طريقة تفاعل توقف أو الرصد المستمر لقياس الحركية كميا البروتين التفاعل مع الحمض النووي. نناقش ضوابط خصوصية المناسبة، بما في ذلك العلاج مع مفتش غير محددة أو بدون البروتين أو الأجسام المضادة الأولية. موصوفة التطبيقات للمقايسة بما في ذلك فائدته في فحص المخدرات وتناقش النتائج الإيجابية والسلبية ممثل.

طريقة D-ELISA هو محددة للغاية للبروتين الحمض النووي ملزم المعينة طالما تم استخدام، المزدوج تقطعت بهم السبل قليل النوكليوتيد تسلسل معين يحتوي على ثلاثة نسخ من موقع ملزم RUNX2 الآراء (ACACCA). الأجسام المضادة الأولية الاعتراف عامل البروتين يعزز أيضا خصوصية. يحتوي على الأجسام ا...

Watch this Scientific Journal Video about A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents at JoVE.c

A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents

قمنا بتطوير الحمض النووي ملزم، فحص ELISA الكمية استنادا لقياس التفاعلات عامل النسخ مع الحمض النووي. وقد تحقق خصوصية عالية للبروتين RUNX2 مع إجماع قليل النوكليوتيد الحمض النووي الاعتراف والأضداد وحيدة النسيلة محددة. تم رصد الكشف اللونية مع رد فعل الأجسام المضادة الركيزة جانب انزيم في الوقت الحقيقي.

A الكمي الفحص لدراسة البروتين: تفاعلات الحمض النووي، اكتشاف المنظمين الترانسكربتي التعبير الجيني، وتحديد رواية وكلاء المضادة للورم

Many DNA-binding assays such as electrophoretic mobility shift assays (EMSA), chemiluminescent assays, chromatin immunoprecipitation (ChIP)-based assays, ...

Research

JoVE Journal

Biology

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

التحضير لزراعة الخلايا المكونة للدم الابتدائية من نخاع عظام الفئران لElectroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

باستخدام الجينات Electroporation MXcell بولسير النظام لTransfect الخلايا الأولية ذات الكفاءة العالية

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

مرحبا - C : طريقة لدراسة الهندسة المعمارية ثلاثي الأبعاد للخريطة جينوم.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

باستخدام خلية مكافحة الآلي لتبسيط دراسات التعبير الجيني : ضربة قاضية سيرنا من IL - 4 التعبير الجيني في الخلايا التابعة Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

Chromatin Immunoprecipitation ChIP to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

مناعي لونين (CHIP) لتعديل هيستون الفحص الحيوي في التعبير الجيني في الخلايا البشرية المنشط

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

إعادة إعماره في المختبر من أحدث T. castaneum تيلوميراز

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

عزلة البروتينية ريبوسوم الوليدة منضم<em&gt; في المختبر</em&gt; لتحديد المواقع وقفة بالحركة على طول مرنا

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

سيرنا فحص لتحديد اليوبيكويتين واليوبيكويتين مثل المنظمين نظام مقررات تمهيدية البيولوجية في خلايا الثدييات مثقف

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...