Name: a quantitative assay to study protein:dna interactions, discover transcriptional regulators of gene expression, and identify novel anti-tumor agents
Uploaded: 2013-08-31T07:00:00
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メリーランド大学Greenebaumがんセンターのトランスレーショナル基盤施設、特に博士の技術支援および計測。レナLapidusはとMariola Sadowskaは、深く感謝している。このアッセイの開発を担当して作業がAHA費補助金GRNT2130014、APへのVA優秀賞、およびマレーネ·スチュワートに提供メリーランド大学のタバコ反発基金（CRF）により、NIH RO1CA108846によって部分的に資金を供給されたGreenebaumがんセンター。

いくつかのステップは、前もって実行され、いくつかの試薬は、処置の前に調製され、記憶される：（1）細胞培養およびタンパク質の単離、（2）オリゴヌクレオチドの調製、（3）96ウェルプレートを調製する、（4）核抽出物インキュベーション一晩。手順が原因DNAオリゴヌクレオチドとの核タンパク質の一晩のインキュベーションの2日間を必要とします。 1。バッファ?...

<ol>
	<li>Hellman, L. M., Fried, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+mobility+shift+assay+(EMSA)+for+detecting+protein-nucleic+acid+interactions.">Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions.</a> Nat. Protoc. 2, 1849-1861 (2007).</li><li>Bhattacharya, N., Sarno, A., Idler, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+detection+of+nuclear+factor-kappaB+activity+using+a+sensitive+oligo-based+chemiluminescent+enzyme-linked+immunosorbent+assay.">High-throughput detection of nuclear factor-kappaB activity using a sensitive oligo-based chemiluminescent enzyme-linked immunosorbent assay.</a> Int. J. Cancer. 127, 404-411 (2010).</li><li>Hartzell, D. D., Trinklein, N. D., Mendez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+analysis+of+the+CREB+signaling+pathway+using+HaloCHIP-chip+and+high+throughput+reporter+assays.">A functional analysis of the CREB signaling pathway using HaloCHIP-chip and high throughput reporter assays.</a> BMC Genomics. 10, 497 (2009).</li><li>Vuori, K. A., Ahlskog, J. K., Sistonen, L., Nikinmaa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TransLISA,+a+novel+quantitative,+nonradioactive+assay+for+transcription+factor+DNA-binding+analyses.">TransLISA, a novel quantitative, nonradioactive assay for transcription factor DNA-binding analyses.</a> FEBS J. 276, 7366-7374 (2009).</li><li>D'Souza, D. R., Salib, M. M., Bennett, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperglycemia+Regulates+RUNX2+Activation+and+Cellular+Wound+Healing+through+the+Aldose+Reductase+Polyol+Pathway.">Hyperglycemia Regulates RUNX2 Activation and Cellular Wound Healing through the Aldose Reductase Polyol Pathway.</a> J. Biol. Chem. 284, 17947-17955 (2009).</li><li>Underwood, K. F., D'Souza, D. R., Mochin, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+RUNX2+transcription+factor-DNA+interactions+and+cell+proliferation+by+Vitamin+D3+(cholecalciferol)+prohormone+activity.">Regulation of RUNX2 transcription factor-DNA interactions and cell proliferation by Vitamin D3 (cholecalciferol) prohormone activity.</a> J. Bone Miner Res. 27, 913-925 (2012).</li><li>Held, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+ß-galactosidase+activity+using+the+PowerWave+HT+and+Gen5+data+analysis+software:+basic+enzyme+kinetic+determinations.">Kinetic analysis of ß-galactosidase activity using the PowerWave HT and Gen5 data analysis software: basic enzyme kinetic determinations.</a> Biotek Instruments Application Note. , (2007).</li><li>Renard, P., Ernest, I., Houbion, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+sensitive+multi-well+colorimetric+assay+for+active+NFkappaB.">Development of a sensitive multi-well colorimetric assay for active NFkappaB.</a> Nucleic Acids Res. 29, E21 (2001).</li><li>Pommier, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+topoisomerase+I+inhibitors:+chemistry,+biology,+and+interfacial+inhibition.">DNA topoisomerase I inhibitors: chemistry, biology, and interfacial inhibition.</a> Chem Rev. 109, 2894-2902 (2009).</li><li>Pennisi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomics.+ENCODE+project+writes+eulogy+for+junk+DNA.">Genomics. ENCODE project writes eulogy for junk DNA.</a> Science. 337, 1159-1161 (2012).</li></ol>

DNA結合アッセイは、DNAと相互作用する転写因子の能力を測定するために使用される。 DNA結合のためのアッセイは、電気泳動移動度シフト（EMSA）1およびクロマチンimmuneprecipitation（チップ）に基づくアッセイ3だけでなく、このような化学発光アッセイ2として96ウェルフォーマット4を採用したアッセイが含まれる。 EMSAは、非定量的であり、放射性標識...

DNA結合アッセイは、DNAと相互作用する転写因子の能力を測定するのに有用である。 DNA結合のためのアッセイは、放射性標識オリゴヌクレオチドは、1または化学発光アッセイ2に依存する電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）を含む。 96ウェルフォーマット4を用いたクロマチンimmuneprecipitation法（ChIP）に基づくアッセイ3ならびにアッセイも記載されている。しかしながら、EMSA、放射性標識オリゴヌクレオチドの使用を必要とする非定量的アッセイである。核タンパク質は、特定のヌクレオチドプロモーター配列と会合する場合、結合複合体は、ポリアクリルアミドゲル上で遅角であり、特定の転写因子は、抗体「スーパーシフト」で検証することができる。我々は定義されたプロモーター要素iに対応するDNA結合配列とRUNX2の相互作用を測定することができる酵素結合免疫吸着フォーマット（D-ELISA）を用いて定量的DNA結合アッセイを開発したn個のRUNX2標的遺伝子。抗RUNX2抗体の使用は、アッセイに特異性を提供し、放射性標識の不足は、伝統的なゲルシフトアッセイ5からこのアッセイを区別する。結合複合体の検出は、分光測光分析のための着色生成物へのHRP基質テトラメチルベンジジン（TMB）を変換する西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）に結合された二次抗体を用いて可能である。ここで報告アッセイは、対照として変異したDNAオリゴヌクレオチドの使用を組み込むことができ、DNA結合の競合的又は非競合的阻害剤の検出のために使用することができる。新規な抗腫瘍化合物のスクリーニングは、このアッセイでも可能である。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the Reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly dI/dC</td>
			<td>GE Healthcare, Piscataway, NJ</td>
			<td>US20539-5UN</td>
			<td>1 U ~50mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RUNX2 antibody</td>
			<td>MBL International Corp., Woburn, MA</td>
			<td>D130-3</td>
			<td>1 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fab-specific peroxidase conjugated antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>A9917</td>
			<td>7.1 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB Substrate (tetramethyl benzidine)</td>
			<td>EXALPHA Biologicals, Shirley, MA</td>
			<td>X1189S</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>57995</td>
			<td>Plate-fixing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric Acid</td>
			<td>VWR, West Chester, PA</td>
			<td>BDH-39922-1</td>
			<td>Stop solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-well plates</td>
			<td>Greiner Bio-One, Basel, Switzerland</td>
			<td>655996</td>
			<td>Avidin-coated, black sides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HALT</td>
			<td>Thermo-Scientific/Pierce, Rockford, IL</td>
			<td>78440</td>
			<td>Protease and phosphatase inhibitors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td>Various manufacturers</td>
			<td>Laboratory grade</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Table 1. Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer: Biotrak II Visible plate reader</td>
			<td>Amersham Biosciences</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>For use with stop reaction method</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer: Bio-Tek Synergy HT Multi-reaction microplate reader</td>
			<td>Bio-Tek Instruments, Inc.</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>For use with continuous kinetic monitoring</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Table 2. Equipment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a quantitative assay to study protein:dna interactions, discover transcriptional regulators of gene expression, and identify novel anti-tumor agents

このような電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）、化学発光アッセイ、クロマチン免疫沈降法（ChIP）に基づくアッセイ、およびマルチウェルベースの​​アッセイなどの多くのDNA結合アッセイは、転写因子活性を測定するために使用される。しかしながら、これらのアッセイは、非定量的である特異性を欠いている、放射性標識オリゴヌクレオチドの使用を含み得る、DNAおよび結合の阻害剤のスクリーニングに適用可能でなくてもよい。一方、定量的DNA結合酵素結合免疫吸着アッセイ（D-ELISA）アッセイを用いて、我々は、ビオチンに存在するコンセンサスDNA結合配列と特異的会合に依存RUNX2転写因子を用いてDNAを有する核タンパク質相互作用を実証する標識されたオリゴヌクレオチド。細胞は、核タンパク質の抽出、および二本鎖オリゴヌクレオチドの設計の調製が記載されている。アビジン被覆96ウェルプレートを、アルカリ性緩衝液で固定し、ブロッキング緩衝液中のヌクレオチド、核タンパク質と共にインキュベートする。 Follプレートを十分に洗浄するため、特異的一次抗体および二次抗体のインキュベーションは、比色反応の西洋ワサビペルオキシダーゼ基質及び現像を加えている。反応停止モードまたは連続的動力学的モニタリングを定量的DNAとタンパク質の相互作用を測定するために使用した。我々は、非特異的IgGとまたはタンパク質または一次抗体のない治療を含め、適切な特異性を制御し、議論する。アッセイのアプリケーションは、その薬剤スクリーニングにおける有用性​​と代表の正と負の結果が議論されているなど、記載されている。

D-ELISA法であれば、コンセンサス結合部位RUNX2（ACACCA）の3つのコピーを含有する配列特異的二本鎖オリゴヌクレオチドが使用されているとして指定DNA結合タンパク質に高度に特異的である。タンパク質因子を認識し、一次抗体は、特異性を向上させます。二次抗体は、検出を容易にします（ 図1）の着色生成物に明確な基質（テトラメチルベンジジン）に変換共有結合した西洋ワ?...

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A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents

我々は、DNAと転写因子との相互作用を測定するための定量的なDNA結合性、ELISAベースのアッセイを開発した。 RUNX2タンパク質に対して高い特異性は、コンセンサスDNA認識オリゴヌクレオチドと特異的モノクローナル抗体を用いて達成された。酵素結合抗体基質反応と比色検出をリアルタイムでモニターした。

遺伝子発現のDNA相互作用、ディスカバー転写レギュレータ、および新規抗腫瘍剤を同定：タンパク質を研究するために、定量的アッセイ

Many DNA-binding assays such as electrophoretic mobility shift assays (EMSA), chemiluminescent assays, chromatin immunoprecipitation (ChIP)-based assays, ...

Research

JoVE Journal

Biology

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エレクトロポレーションのためのマウス骨髄からの一次造血細胞培養の準備

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生物学

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

高効率で初代培養細胞をトランスフェクトするためにジーンパルサーMXcellのエレクトロポレーションシステムの使用

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

ハイC：ゲノムの三次元構造を研究する方法。

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

ナマルバ細胞におけるIL - 4依存性遺伝子発現のsiRNAのノックダウン：遺伝子発現研究を簡素化する自動化セルカウンターの使い方

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

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ヒト細胞において活性化遺伝子発現のアッセイのダイナミックヒストン修飾のクロマチン免疫沈降（ChIP）

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

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アクティブT.の試験管内再構成でcastaneumのテロメラーゼ

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The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

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培養哺乳動物細胞内の生物学的経路のユビキチンおよびユビキチン様システムレギュレータを識別するために、siRNAのスクリーニング

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...