Name: a quantitative assay to study protein:dna interactions, discover transcriptional regulators of gene expression, and identify novel anti-tumor agents
Uploaded: 2013-08-31T07:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents at JoVE.c

Den teknisk assistanse og instrumentering ved University of Maryland Greenebaum Cancer Center Translasjonell Kjerne Facility, spesielt legene. Rena Lapidus og Mariola Sadowska, er takknemlig erkjent. Arbeidet er ansvarlig for utviklingen av denne analysen ble finansiert delvis av NIH RO1CA108846, AHA Grant-i-Aid GRNT2130014, en VA Merit Award til AP, og ved University of Maryland Sigarett Restitusjons Funds (CRF) gitt til Marlene &amp; Stewart Greenebaum Cancer Center.

Flere trinn utføres på forhånd, og flere reagenser blir fremstilt og lagret forut for fremgangsmåten: (1) cellekultur og protein isolert, (2) fremstilling av oligonukleotid, (3) Fremstilling av 96-brønners plater (4) kjerneekstrakt inkubasjon over natten. Prosedyren krever to dager på grunn av den over natten inkubasjon av kjerneprotein med DNA-oligonukleotider. En. Utarbeidelse av buffere 1,1 Nuclear protein isolasjon <ol><li> Hypotonic Buffer: For å forbe...

<ol>
	<li>Hellman, L. M., Fried, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+mobility+shift+assay+(EMSA)+for+detecting+protein-nucleic+acid+interactions.">Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions.</a> Nat. Protoc. 2, 1849-1861 (2007).</li><li>Bhattacharya, N., Sarno, A., Idler, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+detection+of+nuclear+factor-kappaB+activity+using+a+sensitive+oligo-based+chemiluminescent+enzyme-linked+immunosorbent+assay.">High-throughput detection of nuclear factor-kappaB activity using a sensitive oligo-based chemiluminescent enzyme-linked immunosorbent assay.</a> Int. J. Cancer. 127, 404-411 (2010).</li><li>Hartzell, D. D., Trinklein, N. D., Mendez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+analysis+of+the+CREB+signaling+pathway+using+HaloCHIP-chip+and+high+throughput+reporter+assays.">A functional analysis of the CREB signaling pathway using HaloCHIP-chip and high throughput reporter assays.</a> BMC Genomics. 10, 497 (2009).</li><li>Vuori, K. A., Ahlskog, J. K., Sistonen, L., Nikinmaa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TransLISA,+a+novel+quantitative,+nonradioactive+assay+for+transcription+factor+DNA-binding+analyses.">TransLISA, a novel quantitative, nonradioactive assay for transcription factor DNA-binding analyses.</a> FEBS J. 276, 7366-7374 (2009).</li><li>D'Souza, D. R., Salib, M. M., Bennett, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperglycemia+Regulates+RUNX2+Activation+and+Cellular+Wound+Healing+through+the+Aldose+Reductase+Polyol+Pathway.">Hyperglycemia Regulates RUNX2 Activation and Cellular Wound Healing through the Aldose Reductase Polyol Pathway.</a> J. Biol. Chem. 284, 17947-17955 (2009).</li><li>Underwood, K. F., D'Souza, D. R., Mochin, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+RUNX2+transcription+factor-DNA+interactions+and+cell+proliferation+by+Vitamin+D3+(cholecalciferol)+prohormone+activity.">Regulation of RUNX2 transcription factor-DNA interactions and cell proliferation by Vitamin D3 (cholecalciferol) prohormone activity.</a> J. Bone Miner Res. 27, 913-925 (2012).</li><li>Held, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+ß-galactosidase+activity+using+the+PowerWave+HT+and+Gen5+data+analysis+software:+basic+enzyme+kinetic+determinations.">Kinetic analysis of ß-galactosidase activity using the PowerWave HT and Gen5 data analysis software: basic enzyme kinetic determinations.</a> Biotek Instruments Application Note. , (2007).</li><li>Renard, P., Ernest, I., Houbion, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+sensitive+multi-well+colorimetric+assay+for+active+NFkappaB.">Development of a sensitive multi-well colorimetric assay for active NFkappaB.</a> Nucleic Acids Res. 29, E21 (2001).</li><li>Pommier, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+topoisomerase+I+inhibitors:+chemistry,+biology,+and+interfacial+inhibition.">DNA topoisomerase I inhibitors: chemistry, biology, and interfacial inhibition.</a> Chem Rev. 109, 2894-2902 (2009).</li><li>Pennisi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomics.+ENCODE+project+writes+eulogy+for+junk+DNA.">Genomics. ENCODE project writes eulogy for junk DNA.</a> Science. 337, 1159-1161 (2012).</li></ol>

DNA-bindingsanalysene er brukt til å måle evnen av transkripsjonsfaktorene til å interagere med DNA. Analyser for DNA bindende omfatter elektromobilitet shift (EMSA) 1 og kromatin immuneprecipitation (chip) baserte analyser 3 samt analyser sysselsetter 96-brønners formater fire som kjemiluminescente analyser to. EMSA er ikke-kvantitative og bruker radiomerket (32 P) oligonukleotider. Disse inkuberes med kjerneproteiner og binde komplekser separeres på agarose-e...

DNA-binding assays kan anvendes for å måle evnen av transkripsjonsfaktorene til å interagere med DNA. Analyser for DNA bindende omfatter elektromobilitet skift analyser (EMSA) som er avhengige av radiomerket oligonukleotider en eller chemiluminescence analyser to. Kromatin immuneprecipitation (chip) baserte analyser 3 samt analyser sysselsetter 96-brønners formater 4 har også blitt beskrevet. Imidlertid er EMSA en ikke-kvantitativ analyse som krever bruk av radioaktivt merkede oligonukleotider. Når kjerneproteiner forbinder med den spesielle nukleotid-promotorsekvensene, bindende komplekser er retardert på polyakrylamidgeler og den spesifikke transkripsjonsfaktor kan bekreftes med et antistoff &quot;supershift&quot;. Vi har utviklet en kvantitativ DNA-bindingsanalyse ved bruk av en enzym-bundet immunosorbent-format (D-ELISA), som er i stand til å måle interaksjonen av RUNX2 med DNA-bindende sekvenser som tilsvarer definerte promotorelementer in RUNX2 målgener. Anvendelse av et anti-antistoff RUNX2 gir spesifisitet til analysen og mangel på radiomerket substans skille denne analysen fra den tradisjonelle gel shift assay 5. Påvisning av bindingskomplekser er mulig med bruk av et sekundært antistoff koplet til pepperrotperoksidase (HRP), som omdanner et HRP-substrat, tetrametylbenzidin (TMB) til et farget produkt for spektrofotometrisk analyse. Analysen rapportert her, kan omfatte bruk av muterte DNA-oligonukleotider som kontroller, og kan brukes for deteksjon av konkurrerende eller ikke-konkurrerende hemmere av DNA-binding. Den screening av nye anti-tumorforbindelser er også mulig med denne analysen.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the Reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly dI/dC</td>
			<td>GE Healthcare, Piscataway, NJ</td>
			<td>US20539-5UN</td>
			<td>1 U ~50mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RUNX2 antibody</td>
			<td>MBL International Corp., Woburn, MA</td>
			<td>D130-3</td>
			<td>1 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fab-specific peroxidase conjugated antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>A9917</td>
			<td>7.1 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB Substrate (tetramethyl benzidine)</td>
			<td>EXALPHA Biologicals, Shirley, MA</td>
			<td>X1189S</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>57995</td>
			<td>Plate-fixing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric Acid</td>
			<td>VWR, West Chester, PA</td>
			<td>BDH-39922-1</td>
			<td>Stop solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-well plates</td>
			<td>Greiner Bio-One, Basel, Switzerland</td>
			<td>655996</td>
			<td>Avidin-coated, black sides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HALT</td>
			<td>Thermo-Scientific/Pierce, Rockford, IL</td>
			<td>78440</td>
			<td>Protease and phosphatase inhibitors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td>Various manufacturers</td>
			<td>Laboratory grade</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Table 1. Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer: Biotrak II Visible plate reader</td>
			<td>Amersham Biosciences</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>For use with stop reaction method</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer: Bio-Tek Synergy HT Multi-reaction microplate reader</td>
			<td>Bio-Tek Instruments, Inc.</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>For use with continuous kinetic monitoring</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Table 2. Equipment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a quantitative assay to study protein:dna interactions, discover transcriptional regulators of gene expression, and identify novel anti-tumor agents

Mange DNA-binding assays slik som elektroforetisk mobilitet shift assay (EMSA), kjemiluminescerende assay, kromatin immunoutfelling (chip)-baserte analyser, og multibrønn-baserte assays blir brukt til å måle transkripsjonsfaktor-aktivitet. Men disse analysene er nonquantitative, mangler spesifisitet, kan innebære bruk av radioaktivt merkede oligonukleotider, og er kanskje ikke kunne tilpasses for screening av inhibitorer av DNA-binding. På den annen side, ved hjelp av en kvantitativ DNA-bindende enzyme-linked immunosorbent assay (D-ELISA)-analyse, demonstrerer vi atom protein interaksjoner med DNA ved hjelp av RUNX2 transkripsjonsfaktor som er avhengig av spesifikk assosiasjon med konsensus-DNA-bindende sekvenser som er tilstede på biotin- merket oligonukleotider. Fremstilling av celler, utvinning av kjerneprotein, og utformingen av dobbelt-trådet oligonukleotider er beskrevet. Avidin-belagte 96-brønners plater er festet med alkalisk buffer og inkubert med nukleære proteiner i nukleotid-blokkerende buffer. Føllpå grunn av omfattende vasking av platene, spesifikk primære antistoff og sekundære antistoff inkubasjoner blir etterfulgt av tilsetning av pepperrot-peroksydase-substrat og utvikling av kolorimetrisk reaksjon. Stopp reaksjonen modus eller kontinuerlig kinetisk overvåkning ble brukt til kvantitativt å måle protein interaksjon med DNA. Vi diskuterer passende spesifisitet kontroller, inkludert behandling med ikke-spesifikk IgG-eller uten protein eller primære antistoff. Anvendelser av analysen er beskrevet blant annet sin nytte i medikamentscreening og representative positive og negative resultater er omtalt.

Den D-ELISA-metoden er meget spesifikt for det angitte DNA-bindende protein så lenge som en sekvens-spesifikke, dobbeltkjedet oligonukleotid som inneholder tre kopier av konsensus RUNX2 bindingssete (ACACCA) er brukt. Det primære antistoff gjenkjenner proteinfaktoren øker også spesifisitet. Det sekundære antistoff inneholder kovalent koblet pepperrot-peroksydase (HRP) som konverterer en klar substrat (tetrametylbenzidin) til et farget produkt for enkel deteksjon (figur 1). Av disse grunner, flere v...

Watch this Scientific Journal Video about A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents at JoVE.c

A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents

Vi har utviklet en kvantitativ DNA-bindende ELISA-basert assay for å måle transkripsjonsfaktor interaksjon med DNA. Høy spesifisitet for RUNX2 protein ble oppnådd med en konsensus-DNA-gjenkjenning oligonukleotid og spesifikt monoklonalt antistoff. Kolorimetrisk deteksjon med en enzym-koblet antistoff substrat reaksjonen ble overvåket i sann tid.

En kvantitativ analyse for å studere Protein: DNA interaksjoner, Discover Transcriptional regulatorer Gene Expression, og identifisere nye anti-tumor Agenter

Many DNA-binding assays such as electrophoretic mobility shift assays (EMSA), chemiluminescent assays, chromatin immunoprecipitation (ChIP)-based assays, ...

Research

JoVE Journal

Biology

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

Chromatin Immunoprecipitation ChIP to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolering av ribosome Innbundne begynnende polypeptider<em&gt; In vitro</em&gt; For å identifisere translasjonelle Pause steder langs mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

siRNA Screening for å identifisere Ubiquitin og Ubiquitin-lignende system regulatorer av biologiske mekanismer i dyrkede pattedyrceller

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...