Name: metabolic labeling of leucine rich repeat kinases 1 and 2 with radioactive phosphate
Uploaded: 2013-09-18T11:00:00
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Wir sind auch dankbar, dass der Michael J. Fox Foundation unterstützt diese Studie. Wir danken der Forschungsgemeinschaft - FWO Flandern (FWO Projekt G.0666.09, Senior Researcher Stipendium für JMT), die Binnenschifffahrt SBO/80020 Projekt Neuro-TARGET, die KU Leuven (OT/08/052A und IOF-KP/07 / 001) für ihre Unterstützung. Diese Forschung wurde zum Teil auch von den Fonds-Druwé Eerdekens von der König-Baudouin-Stiftung verwaltet JMT unterstützt.

Die vorliegende Protokoll verwendet radioaktiven 32 P-markierten Orthophosphat, um zelluläre Phosphorylierung von LRRK2 folgen. Es ist wichtig, im Auge zu behalten, dass alle Operationen mit radioaktiven Reagenzien sollte unter Verwendung geeigneter Schutzmaßnahmen, um die Exposition von radioaktiver Strahlung an den Betreiber und die Umwelt zu minimieren, durchgeführt werden. Verbindungen, die Isotope, die ionisierende Strahlung aussenden können sich schädlich auf die menschliche Gesundheit und strengen...

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	<li>Hanafusa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leucine-rich+repeat+kinase+LRRK1+regulates+endosomal+trafficking+of+the+EGF+receptor.">Leucine-rich repeat kinase LRRK1 regulates endosomal trafficking of the EGF receptor.</a> Nat Commun. 2, 158 (2011).</li><li>Titz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proximal+signaling+network+of+the+BCR-ABL1+oncogene+shows+a+modular+organization.">The proximal signaling network of the BCR-ABL1 oncogene shows a modular organization.</a> Oncogene. 29, 5895-5910 (2010).</li><li>Cookson, M. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=14-3-3+binding+to+LRRK2+is+disrupted+by+multiple+Parkinson's+disease-associated+mutations+and+regulates+cytoplasmic+localization.">14-3-3 binding to LRRK2 is disrupted by multiple Parkinson's disease-associated mutations and regulates cytoplasmic localization.</a> Biochem J. 430, 393-404 (2010).</li><li>Greggio, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+LRRK2/dardarin+associated+with+Parkinson+disease+are+more+toxic+than+equivalent+mutations+in+the+homologous+kinase+LRRK1.">Mutations in LRRK2/dardarin associated with Parkinson disease are more toxic than equivalent mutations in the homologous kinase LRRK1.</a> J.Neurochem. 102, 93-102 (2007).</li><li>Taymans, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRK2+Kinase+Activity+Is+Dependent+on+LRRK2+GTP+Binding+Capacity+but+Independent+of+LRRK2+GTP+Binding.">LRRK2 Kinase Activity Is Dependent on LRRK2 GTP Binding Capacity but Independent of LRRK2 GTP Binding.</a> PLoS One. 6, 23207-23 (2011).</li><li>Dani&#235;ls, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insight+into+the+mode+of+action+of+the+LRRK2+Y1699C+pathogenic+mutant.">Insight into the mode of action of the LRRK2 Y1699C pathogenic mutant.</a> J Neurochem. 116, 304-315 (2011).</li><li>Civiero, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+characterization+of+highly+purified+leucine-rich+repeat+kinases+1+and+2+demonstrates+formation+of+homodimers.">Biochemical characterization of highly purified leucine-rich repeat kinases 1 and 2 demonstrates formation of homodimers.</a> PLoS One. 7, e43472 (2012).</li><li>Taymans, J. M., Van den Haute, C., Baekelandt, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+PINK1+and+LRRK2+in+rat+and+mouse+brain.">Distribution of PINK1 and LRRK2 in rat and mouse brain.</a> J.Neurochem. 98, 951-961 (2006).</li><li>Lewis, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assaying+the+kinase+activity+of+LRRK2+in+vitro.">Assaying the kinase activity of LRRK2 in vitro.</a> J Vis Exp. , (2012).</li><li>Lobbestael, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+detection+of+transgene+expression+in+the+brain+using+small+epitope+tags.">Immunohistochemical detection of transgene expression in the brain using small epitope tags.</a> BMC Biotechnol. 10, 16 (2010).</li><li>Davies, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+Characterization+and+Optimization+of+Leucine+Rich+Repeat+Kinase+2+(LRRK2)+Monoclonal+Antibodies.">Comprehensive Characterization and Optimization of Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) Monoclonal Antibodies.</a> Biochem J. , (2013).</li><li>West, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson's+disease-associated+mutations+in+LRRK2+link+enhanced+GTP-binding+and+kinase+activities+to+neuronal+toxicity.">Parkinson's disease-associated mutations in LRRK2 link enhanced GTP-binding and kinase activities to neuronal toxicity.</a> Hum.Mol.Genet. 16, 223-232 (2007).</li><li>Sheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ser1292+autophosphorylation+is+an+indicator+of+LRRK2+kinase+activity+and+contributes+to+the+cellular+effects+of+PD+mutations.">Ser1292 autophosphorylation is an indicator of LRRK2 kinase activity and contributes to the cellular effects of PD mutations.</a> Sci Transl Med. 4, 164ra161 (2012).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation-dependent+14-3-3+binding+to+LRRK2+is+impaired+by+common+mutations+of+familial+Parkinson's+disease.">Phosphorylation-dependent 14-3-3 binding to LRRK2 is impaired by common mutations of familial Parkinson's disease.</a> PLoS One. 6, e17153 (2011).</li><li>Dzamko, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+LRRK2+kinase+activity+leads+to+dephosphorylation+of+Ser(910)/Ser(935),+disruption+of+14-3-3+binding+and+altered+cytoplasmic+localization.">Inhibition of LRRK2 kinase activity leads to dephosphorylation of Ser(910)/Ser(935), disruption of 14-3-3 binding and altered cytoplasmic localization.</a> Biochem J. 430 (910), 405-413 (2010).</li></ol>

Dieses Papier stellt eine Basisprotokoll zum Testen von allgemeinen Phosphorylierung von LRRK2 LRRK1 und in Zelllinien unter Verwendung metabolische Markierung mit 32 P-Orthophosphat. Die Gesamtstrategie ist einfach. LRRK affinitätsmarkierten Proteine ​​in HEK293T-Zellen, die einem Medium mit 32 P-Orthophosphat ausgesetzt sind, ausgedrückt. Die 32 P-Orthophosphat durch die Zellen bereits nach wenigen Stunden Inkubation und alle Moleküle in der Zelle, die Phosphate assimiliert werd...

Leucin rich repeat-Kinasen 1 und 2 (LRRK1 und LRRK2) sind Multidomänen-Paralogen, die eine ähnliche Domäne Organisation teilen. Beide Proteine ​​kodieren, eine GTPase Sequenz ähnlich der Ras-Familie von GTPasen (Ras komplexer Proteine ​​oder ROC) sowie einen C-terminalen Domäne des ROC (COR), effektiv Klassifizieren beide Proteine ​​an den Proteinfamilie ROCO 5,6. N-Terminus der ROC-COR Domain Tandem, beide Proteine ​​kodieren ein Leucin-reichen Repeat-Domäne sowie eine Ankyrin-ähnlichen Domäne, während nur LRRK2 kodiert eine zusätzliche Gürteltier domein 6-8. C-Terminus der ROC-COR, beide Proteine ​​teilen eine Serin-Threonin-Kinase-Domäne, während nur LRRK2 kodiert ein WD40-Domäne in der C-terminalen Region 8. Die genaue Rolle der zellulären LRRK1 und LRRK2 müssen noch aufgeklärt werden, aber LRRK1 in Tyrosinkinase-Rezeptor-Signal 1,2 gebracht worden, während die genetische Beweise deuten auf eine Rolle von LRRK2 in der Pathogenese von Parkinson-Krankheit 3,4. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Die Phosphorylierung von Proteinen ist eine gemeinsame Regulationsmechanismus in den Zellen. Zum Beispiel kann die Phosphorylierung essentiell für die Aktivierung von Enzymen bzw. für die Einstellung von Proteinen mit einem Signalisierungs komplex sein. Die zelluläre Phosphorylierung von LRRK2 wurde umfassend charakterisiert und phosphosite Mapping hat eine Mehrheit der zellulären Phosphorylierungsstellen in einem Cluster zwischen der Ankyrin repeat und Leucin-reichen Wiederholungsdomänen auftreten 9-11 gezeigt. Obwohl LRRK1 zellulären Phosphorylierungsstellen noch nicht abgebildet werden, Beweise aus Studien mit Phosphoprotein-Färbung von Blots von immun LRRK1 Protein aus COS7-Zellen legt nahe, dass LRRK1 Protein in Zellen phosphoryliert 12. Dieses Papier stellt eine Basisprotokoll zum Testen von allgemeinen Phosphorylierung von LRRK2 LRRK1 und in Zelllinien unter Verwendung metabolische Markierung mit 32 P-Orthophosphat. Die Gesamtstrategie ist einfach. Affinity getaggt LRRK proteIns in HEK293T-Zellen, die einem Medium, das 32 ​​P-Orthophosphat ausgesetzt sind ausgedrückt. Die 32 P-Orthophosphat durch die Zellen bereits nach wenigen Stunden Inkubation und alle Moleküle in der Zelle, die Phosphate assimiliert werden dabei radioaktiv markiert. Der Affinitäts-Tag (3xflag) wird dann verwendet, um die LRRK Proteine ​​von anderen zellulären Komponenten durch Immunpräzipitation isoliert werden. Immunpräzipitate werden dann über SDS-PAGE aufgetrennt, auf PVDF-Membranen und Analyse der enthaltenen Phosphate durch Autoradiographie (32 P-Signal) und Western-Detektion (Protein-Signal) der Proteine ​​auf den Blots durchgeführt.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phosphorus-32 Radionuclide, 1 mCi, buffer disodiumphosphate in 1 ml water</td>
 <td>Perkin Elmer</td>
 <td>NEX011001MC</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM) (1X), liquid (high glucose)</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>11971-025</td>
 <td>This medium contains no phosphates</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti Flag M2 affiinty gel</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A2220</td>
 <td>For an equivalent product with red colored gel (useful to more easily visualize the beads), use cat. No. F2426.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Extra thick blotting filter</td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>1703965</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ponceau S solution</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P7170</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

metabolic labeling of leucine rich repeat kinases 1 and 2 with radioactive phosphate

Leucin-reichen Repeat-Kinasen 1 und 2 (LRRK1 und LRRK2) Paraloge, die eine ähnliche Domänenorganisation zu teilen, die eine Serin-Threonin-Kinasedomäne, einem Ras komplexer Proteine ​​Domain (ROC), einer C-terminalen Domäne des ROC (COR), und Leucin-reichen und Ankyrin-Repeats, wie am N-Terminus. Die genaue Rolle der zellulären LRRK1 und LRRK2 müssen noch aufgeklärt werden, aber LRRK1 in Tyrosinkinase-Rezeptor-Signal 1,2 gebracht worden, während LRRK2 in der Pathogenese von Parkinson-Krankheit 3,4 gebracht. In diesem Bericht stellen wir ein Protokoll, um die LRRK1 und LRRK2-Proteine ​​in Zellen, die mit 32 P-Orthophosphat zu kennzeichnen, wodurch ein Mittel, um die Gesamt Phosphorylierung dieser 2-Proteine ​​in Zellen zu messen bietet. Kurz, getaggt Affinität LRRK Proteine ​​in HEK293T Zellen, die Medium mit 32 P-Orthophosphat ausgesetzt sind, zum Ausdruck gebracht. Die 32 P-Orthophosphat von den Zellen assimiliert nach wenigenStunden Inkubation und alle Moleküle in der Zelle, die Phosphate sind dabei radioaktiv markiert. Über die Affinitätsmarkierung (3xflag) die LRRK Proteine ​​von anderen zellulären Komponenten durch Immunpräzipitation isoliert. Immunpräzipitate werden dann über SDS-PAGE aufgetrennt, auf PVDF-Membranen und Analyse der enthaltenen Phosphate durch Autoradiographie (32 P-Signal) und Western-Detektion (Protein-Signal) der Proteine ​​auf den Blots durchgeführt. Das Protokoll kann leicht angepasst werden, um die Phosphorylierung von einem anderen Protein, das in Zellen exprimiert wird und durch Immunpräzipitation isoliert werden kann, zu überwachen.

<html> Um die Gesamt Phosphorylierung von LRRK1 und LRRK2 in Zellen zu vergleichen, getaggt 3xflag LRRK1 und LRRK2 wurden in HEK293T-Zellen 15 ausgedrückt. Zellen wurden in 6-Well-Platten und mit 32 P markiert und analysiert, wie oben in dem Protokoll Text beschrieben. Abbildung 1 zeigt repräsentative Ergebnisse für die metabolische Markierung von LRRK1 und LRRK2 in HEK293T-Zellen. Radioaktiven Phosphateinbau wird sowohl LRRK1 und LRRK2 beobachtet. Nach Quantifizierung der 3...

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Metabolic Labeling of Leucine Rich Repeat Kinases 1 and 2 with Radioactive Phosphate

Leucin-reichen Repeat-Kinasen 1 und 2 (LRRK1 und LRRK2) sind Multidomänen-Proteine, die sowohl GTPase und Kinase-Domänen kodieren, und die in Zellen phosphoryliert sind. Hier präsentieren wir ein Protokoll zur LRRK1 und LRRK2 in Zellen mit 32 P-Orthophosphat zu kennzeichnen, wodurch ein Mittel, um ihre Gesamtzell Phosphorylierung zu messen bietet.

Metabolische Markierung von Leucin Rich-Repeat-Kinasen 1 und 2 mit radioaktivem Phosphat

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are paralogs which share a similar domain organization, including a serine-threonine kinase domain, ...

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