Name: metabolic labeling of leucine rich repeat kinases 1 and 2 with radioactive phosphate
Uploaded: 2013-09-18T11:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Metabolic Labeling of Leucine Rich Repeat Kinases 1 and 2 with Radioactive Phosphate at JoVE.com

Мы также благодарны Майкл Дж. Фокс Фонд в поддержку этого исследования. Мы благодарим исследовательский фонд - Фландрия FWO (проект FWO G.0666.09, старший научный сотрудник общение на JMT), проект Нейро-TARGET ВВТ SBO/80020, Ку-Левен (OT/08/052A и IOF-KP/07 / 001) за их поддержку. Это исследование было также частично поддержана Фондом Druwé-Eerdekens управляемых Фонд короля Бодуэна в JMT.

Настоящий протокол использует радиоактивный 32 P-меченых ортофосфат следовать сотовой фосфорилирования LRRK2. Важно иметь в виду, что все операции с радиоактивными реагентами должны быть выполнены с использованием соответствующих защитных мер для минимизации воздействия радиоак?...

<ol>
	<li>Hanafusa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leucine-rich+repeat+kinase+LRRK1+regulates+endosomal+trafficking+of+the+EGF+receptor.">Leucine-rich repeat kinase LRRK1 regulates endosomal trafficking of the EGF receptor.</a> Nat Commun. 2, 158 (2011).</li><li>Titz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proximal+signaling+network+of+the+BCR-ABL1+oncogene+shows+a+modular+organization.">The proximal signaling network of the BCR-ABL1 oncogene shows a modular organization.</a> Oncogene. 29, 5895-5910 (2010).</li><li>Cookson, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+leucine-rich+repeat+kinase+2+(LRRK2)+in+Parkinson's+disease.">The role of leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) in Parkinson's disease.</a> Nat Rev Neurosci. 11, 791-797 (2010).</li><li>Taymans, J. M., Cookson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+dominant+parkinsonism;+the+toxic+triangle+of+LRRK2,+alpha-synuclein+and+tau.">Mechanisms of dominant parkinsonism; the toxic triangle of LRRK2, alpha-synuclein and tau.</a> Bioessays. 32, 227-235 (2010).</li><li>Lewis, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+function+of+ROCO+proteins+in+health+and+disease.">The function of ROCO proteins in health and disease.</a> Biol Cell. 101, 183-191 (2009).</li><li>Marin, I., van Egmond, W. N., van Haastert, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Roco+protein+family:+a+functional+perspective.">The Roco protein family: a functional perspective.</a> FASEB J. 22, 3103-3110 (2008).</li><li>Marin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Parkinson+disease+gene+LRRK2:+evolutionary+and+structural+insights.">The Parkinson disease gene LRRK2: evolutionary and structural insights.</a> Mol.Biol.Evol. 23, 2423-2433 (2006).</li><li>Marin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ancient+origin+of+the+Parkinson+disease+gene+LRRK2.">Ancient origin of the Parkinson disease gene LRRK2.</a> J Mol Evol. 67, 41-50 (2008).</li><li>Lobbestael, E., Baekelandt, V., Taymans, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+LRRK2:+from+kinase+to+substrate.">Phosphorylation of LRRK2: from kinase to substrate.</a> Biochem Soc Trans. 40, 1102-1110 (2012).</li><li>Gloeckner, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphopeptide+Analysis+Reveals+Two+Discrete+Clusters+of+Phosphorylation+in+the+N-Terminus+and+the+Roc+Domain+of+the+Parkinson-Disease+Associated+Protein+Kinase+LRRK2.">Phosphopeptide Analysis Reveals Two Discrete Clusters of Phosphorylation in the N-Terminus and the Roc Domain of the Parkinson-Disease Associated Protein Kinase LRRK2.</a> J Proteome Res. 9, 1738-1745 (2010).</li><li>Nichols, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=14-3-3+binding+to+LRRK2+is+disrupted+by+multiple+Parkinson's+disease-associated+mutations+and+regulates+cytoplasmic+localization.">14-3-3 binding to LRRK2 is disrupted by multiple Parkinson's disease-associated mutations and regulates cytoplasmic localization.</a> Biochem J. 430, 393-404 (2010).</li><li>Greggio, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+LRRK2/dardarin+associated+with+Parkinson+disease+are+more+toxic+than+equivalent+mutations+in+the+homologous+kinase+LRRK1.">Mutations in LRRK2/dardarin associated with Parkinson disease are more toxic than equivalent mutations in the homologous kinase LRRK1.</a> J.Neurochem. 102, 93-102 (2007).</li><li>Taymans, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRK2+Kinase+Activity+Is+Dependent+on+LRRK2+GTP+Binding+Capacity+but+Independent+of+LRRK2+GTP+Binding.">LRRK2 Kinase Activity Is Dependent on LRRK2 GTP Binding Capacity but Independent of LRRK2 GTP Binding.</a> PLoS One. 6, 23207-23 (2011).</li><li>Dani&#235;ls, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insight+into+the+mode+of+action+of+the+LRRK2+Y1699C+pathogenic+mutant.">Insight into the mode of action of the LRRK2 Y1699C pathogenic mutant.</a> J Neurochem. 116, 304-315 (2011).</li><li>Civiero, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+characterization+of+highly+purified+leucine-rich+repeat+kinases+1+and+2+demonstrates+formation+of+homodimers.">Biochemical characterization of highly purified leucine-rich repeat kinases 1 and 2 demonstrates formation of homodimers.</a> PLoS One. 7, e43472 (2012).</li><li>Taymans, J. M., Van den Haute, C., Baekelandt, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+PINK1+and+LRRK2+in+rat+and+mouse+brain.">Distribution of PINK1 and LRRK2 in rat and mouse brain.</a> J.Neurochem. 98, 951-961 (2006).</li><li>Lewis, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assaying+the+kinase+activity+of+LRRK2+in+vitro.">Assaying the kinase activity of LRRK2 in vitro.</a> J Vis Exp. , (2012).</li><li>Lobbestael, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+detection+of+transgene+expression+in+the+brain+using+small+epitope+tags.">Immunohistochemical detection of transgene expression in the brain using small epitope tags.</a> BMC Biotechnol. 10, 16 (2010).</li><li>Davies, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+Characterization+and+Optimization+of+Leucine+Rich+Repeat+Kinase+2+(LRRK2)+Monoclonal+Antibodies.">Comprehensive Characterization and Optimization of Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) Monoclonal Antibodies.</a> Biochem J. , (2013).</li><li>West, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson's+disease-associated+mutations+in+LRRK2+link+enhanced+GTP-binding+and+kinase+activities+to+neuronal+toxicity.">Parkinson's disease-associated mutations in LRRK2 link enhanced GTP-binding and kinase activities to neuronal toxicity.</a> Hum.Mol.Genet. 16, 223-232 (2007).</li><li>Sheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ser1292+autophosphorylation+is+an+indicator+of+LRRK2+kinase+activity+and+contributes+to+the+cellular+effects+of+PD+mutations.">Ser1292 autophosphorylation is an indicator of LRRK2 kinase activity and contributes to the cellular effects of PD mutations.</a> Sci Transl Med. 4, 164ra161 (2012).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation-dependent+14-3-3+binding+to+LRRK2+is+impaired+by+common+mutations+of+familial+Parkinson's+disease.">Phosphorylation-dependent 14-3-3 binding to LRRK2 is impaired by common mutations of familial Parkinson's disease.</a> PLoS One. 6, e17153 (2011).</li><li>Dzamko, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+LRRK2+kinase+activity+leads+to+dephosphorylation+of+Ser(910)/Ser(935),+disruption+of+14-3-3+binding+and+altered+cytoplasmic+localization.">Inhibition of LRRK2 kinase activity leads to dephosphorylation of Ser(910)/Ser(935), disruption of 14-3-3 binding and altered cytoplasmic localization.</a> Biochem J. 430 (910), 405-413 (2010).</li></ol>

Эта статья обеспечивает базовый протокол для опробования общий уровень фосфорилирования LRRK1 и LRRK2 в клеточных линиях с использованием метаболического маркировку с 32 P-ортофосфатом. Общая стратегия очень проста. Affinity отмеченных LRRK белки экспрессируются в HEK293T клеток, которые подв...

Лейцин богатых повторные киназы 1 и 2 (LRRK1 и LRRK2) являются многодоменные паралоги, которые разделяют подобную организацию домена. Оба белка кодирования последовательность GTPase сродни семьи Рас из GTPases (Ras сложных белков, или РПЦ), а также С-концу РПЦ домена (COR), эффективно классификации оба белка в семье 5,6 ROCO белка. N-терминал доменного тандеме РПЦ-COR, оба белка кодировать лейцин-богатый повтор домен, а также в анкириновых-подобный домен, в то время как только LRRK2 кодирует дополнительный броненосца Domein 6-8. С-конец РПЦ-COR, оба белка поделиться домен киназы серин-треонин в то время как только LRRK2 кодирует домен WD40 в С-концевой области 8. Точные сотовые роли LRRK1 и LRRK2 до сих пор не выяснены, однако LRRK1 был вовлечен в тирозинкиназы рецептора сигнализации 1,2, в то время как генетическая данные указывают на роли LRRK2 в патогенезе болезни Паркинсона 3,4. <pкласс = &quot;jove_content&quot;&gt; фосфорилирования белков является общей механизм регулирования в клетках. Например, фосфорилирование может быть существенным для активации ферментов или для набора белков в комплексе сигнализации. Клеточный фосфорилирование LRRK2 широко характеризуется и отображение phosphosite показал большинство сотовой сайтов фосфорилирования произойти в кластере между повторения анкириновых и богатых лейцином повторных областей 9-11. Хотя LRRK1 сотовой сайты фосфорилирования до сих пор не отображается, данные исследований с использованием фосфопротеин окрашивание блотов иммунопреципитации белка LRRK1 от COS7 клеток показывает, что LRRK1 белок фосфорилируется в клетках 12. Эта статья обеспечивает базовый протокол для опробования общий уровень фосфорилирования LRRK1 и LRRK2 в клеточных линиях с использованием метаболического маркировку с 32 P-ортофосфатом. Общая стратегия очень проста. Affinity отмеченных LRRK PROTEмодули выражены в HEK293T клеток, которые подвергаются среде, содержащей 32 P-ортофосфат. 32 Р-ортофосфат усваивается клетками только после нескольких часов инкубации и всех молекул в ячейке, содержащей фосфаты тем самым радиоактивно метили. Аффинная метка (3xflag) используется для изоляции LRRK белки из других клеточных компонентов путем иммунопреципитации. Иммунопреципитаты затем разделяют с помощью SDS-PAGE, переносили на мембраны ПВДФ и анализа объединенных фосфатов производится авторадиографией (32 P сигнала) и западной обнаружения (сигнал белок) белков на клякс.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phosphorus-32 Radionuclide, 1 mCi, buffer disodiumphosphate in 1 ml water</td>
 <td>Perkin Elmer</td>
 <td>NEX011001MC</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM) (1X), liquid (high glucose)</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>11971-025</td>
 <td>This medium contains no phosphates</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti Flag M2 affiinty gel</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A2220</td>
 <td>For an equivalent product with red colored gel (useful to more easily visualize the beads), use cat. No. F2426.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Extra thick blotting filter</td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>1703965</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ponceau S solution</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P7170</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

metabolic labeling of leucine rich repeat kinases 1 and 2 with radioactive phosphate

Лейцин богатых повторные киназы 1 и 2 (LRRK1 и LRRK2) являются паралоги, которые разделяют подобную организацию домена, в том числе серин-треонин домена киназы, в Ras из комплексной области белков (РПЦ), С-терминала РПЦ домена (COR), и лейцин-богатый и анкириновых, как повторяется на N-конце. Точные сотовой роли LRRK1 и LRRK2 до сих пор не выяснены, однако LRRK1 был вовлечен в тирозинкиназы рецептора сигнализации 1,2, в то время как LRRK2 вовлечен в патогенез болезни Паркинсона 3,4. В этом отчете мы приводим протокол маркировать белки LRRK1 и LRRK2 в клетках с 32 P ортофосфата, тем самым предоставляя средства для измерения общего уровня фосфорилирования этих 2 белков в клетках. Короче говоря, близость отмеченных LRRK белки экспрессируются в HEK293T клеток, которые подвергаются среде, содержащей 32 P-ортофосфат. 32 Р-ортофосфат усваивается клетками после лишь немногиеч инкубации и все молекулы в ячейке, содержащей фосфаты тем самым радиоактивно метили. Через аффинной метки (3xflag) в LRRK белки изолированы от других клеточных компонентов путем иммунопреципитации. Иммунопреципитаты затем разделяют с помощью SDS-PAGE, переносили на мембраны ПВДФ и анализа объединенных фосфатов производится авторадиографией (32 P сигнала) и западной обнаружения (сигнал белок) белков на клякс. Протокол может быть легко адаптированы дл контрол фосфорилирование любой другой белок, который может быть выражено в клетках и изолированных с помощью иммунопреципитации.

<html> Для того чтобы сравнить общий уровень фосфорилирования LRRK1 и LRRK2 в клетках, 3xflag отмеченных LRRK1 и LRRK2 были выражены в HEK293T клеток 15. Клетки культивировали в 6-луночные планшеты и метили 32 Р и анализировали, как описано выше в тексте протокола. Рисунок 1 показывает репрезен...

Watch this Scientific Journal Video about Metabolic Labeling of Leucine Rich Repeat Kinases 1 and 2 with Radioactive Phosphate at JoVE.com

Metabolic Labeling of Leucine Rich Repeat Kinases 1 and 2 with Radioactive Phosphate

Лейцин богатых повторные киназы 1 и 2 (LRRK1 и LRRK2) являются многодоменные белки, которые кодируют как GTPase и киназные домены и которые фосфорилируется в клетках. Здесь мы приводим протокол маркировать LRRK1 и LRRK2 в клетках с 32 P ортофосфата, тем самым предоставляя средства для измерения их общий уровень сотовой phophorylation.

Метаболический Маркировка лейцина Rich Повторите киназ 1 и 2 с радиоактивными фосфат

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are paralogs which share a similar domain organization, including a serine-threonine kinase domain, ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Chemistry

Biology

Radioactivity and Nuclear Chemistry

SCIENTISTS IN ACTION

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Маркировка стволовых клеток с флуоресцентными красителями для неинвазивного обнаружения оптических изображений с

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

Изучение мембранных биогенеза с люциферазы основе Пробирной Гена Репортер

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane ...

Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran

Lineage Маркировка данио рерио Клетки с лазерной Uncagable Fluorescein Декстран

A central problem in developmental biology is to deduce the origin of the myriad cell types present in vertebrates as they arise from undifferentiated ...

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

Изображений гликанов в данио рерио Эмбрионы от метаболического Маркировка и Bioorthogonal химии нажмите

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or ...

Metabolic Pathway Confirmation and Discovery Through 13C-labeling of Proteinogenic Amino Acids

Metabolic Pathway Confirmation and Discovery Through 13C-labeling of Proteinogenic Amino Acids

Метаболический Подтверждение пути и Discovery Через 13 C-маркировки протеиногенных Аминокислоты

Microbes have complex metabolic pathways that can be investigated using biochemistry and functional genomics methods. One important technique to examine ...

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

Измерительная ячейка Кинетика цикла прогрессии с метаболическим Маркировка и проточной цитометрии

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture

Метаболический маркировки Недавно Transcribed РНК за большой размер профилирования экспрессии генов синтеза РНК, производство и разложение в культуре клеток

The development of whole-transcriptome microarrays and next-generation sequencing has revolutionized our understanding of the complexity of cellular gene ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Метаболический Маркировка и мембраны фракционирования для сравнительного Proteomic Анализ<em&gt; Арабидопсис</em&gt; Подвеска Клеточные культуры

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

Новый подход к сравнительному анализу мультибелковых комплексов на основе<sup&gt; 15</sup&gt; N Метаболический Маркировка и количественный Масс-спектрометрия

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex ...

Sequence-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins with Methyltransferases and Cofactor Analogues

Последовательность конкретных Маркировка нуклеиновых кислот и белков с метилтрансферазы и кофактора аналогов

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific ...