Name: visualization of craniofacial development in the sox10: kaede transgenic zebrafish line using time-lapse confocal microscopy
Uploaded: 2013-09-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy at JoVE.com

Forfatterne takker Robert Kelsh for venligt deler zebrafisk sox10 promotor reagens.

1.. Embryonindsamling til fotoomdannelse <ol><li> Opretter mindst ti par sox10: kaede transgene zebrafisk mellem 5 og 6 pm i aften. </li><li> Den næste morgen, træk skillevægge og indsamle æg omkring middag. Overfør dem til petriskåle og sætte dem i 28,5 ° C inkubator. </li><li> På omkring 24 timer efter befrugtningen rense petriskåle ved at fjerne døde fostre. Kontroller udviklingsstadiet af embryoner 13 ved hjælp lysfelt-mikroskopi og noget fluorescerende mikroskop med forbedret grønt fluores...

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+at+Birth+of+Cleft+Lip+With+or+Without+Cleft+Palate:+Data+From+the+International+Perinatal+Database+of+Typical+Oral+Clefts+(IPDTOC).">Prevalence at Birth of Cleft Lip With or Without Cleft Palate: Data From the International Perinatal Database of Typical Oral Clefts (IPDTOC).</a> Cleft Palate Craniofac. J. 48 (1), 66-81 (2011).</li><li>Dixon, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleft+lip+and+palate:+understanding+genetic+and+environmental+influences.">Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences.</a> Nat. Rev. Genet. 12 (3), 167-178 (2011).</li><li>Mangold, E., Ludwig, K. U., Nothen, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breakthroughs+in+the+genetics+of+orofacial+clefting.">Breakthroughs in the genetics of orofacial clefting.</a> Trends Mol. Med. 17 (12), 725-733 (2011).</li><li>Kimmel, C. B., Miller, C. T., Moens, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+and+morphogenesis+of+the+zebrafish+larval+head+skeleton.">Specification and morphogenesis of the zebrafish larval head skeleton.</a> Dev. Biol. 233 (2), 239-257 (2001).</li><li>Dougherty, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+Fate+Map+of+First+Pharyngeal+Arch+Structures+in+the+sox10:+kaede+Zebrafish+Transgenic+Model.">Embryonic Fate Map of First Pharyngeal Arch Structures in the sox10: kaede Zebrafish Transgenic Model.</a> J. Craniofac. Surg. 23 (5), 1333-1337 (2012).</li><li>Trainor, P. A., Krumlauf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hox+genes,+neural+crest+cells+and+branchial+arch+patterning.">Hox genes, neural crest cells and branchial arch patterning.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 13 (6), 698-705 (2001).</li><li>Schilling, T. F., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segment+and+cell+type+lineage+restrictions+during+pharyngeal+arch+development+in+the+zebrafish+embryo.">Segment and cell type lineage restrictions during pharyngeal arch development in the zebrafish embryo.</a> Development. 120 (3), 483-494 (1994).</li><li>Swartz, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examination+of+a+palatogenic+gene+program+in+zebrafish.">Examination of a palatogenic gene program in zebrafish.</a> Dev. Dyn. 240 (9), 2204-2220 (2011).</li><li>McCollum, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+toxicity+screening+in+zebrafish.+Birth+Defects+Res.">Developmental toxicity screening in zebrafish. Birth Defects Res.</a> C. Embryo Today. 93 (2), 67-114 (2011).</li><li>Wada, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signaling+is+required+for+cranial+neural+crest+morphogenesis+and+chondrogenesis+at+the+midline+in+the+zebrafish+skull.">Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull.</a> Development. 132 (17), 3977-3988 (2005).</li><li>Eberhart, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Hedgehog+signaling+from+neural+to+oral+epithelium+organizes+anterior+craniofacial+development.">Early Hedgehog signaling from neural to oral epithelium organizes anterior craniofacial development.</a> Development. 133 (6), 1069-1077 (2006).</li><li>Ando, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optical+marker+based+on+the+UV-induced+green-to-red+photoconversion+of+a+fluorescent+protein.">An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 99 (20), 12651-12656 (2002).</li><li>Kimmel, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. Dyn. 203 (3), 253-310 (1993).</li><li>Kawakami, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish-secreted+matrix+protein+you/scube2+is+implicated+in+long-range+regulation+of+hedgehog+signaling.">The zebrafish-secreted matrix protein you/scube2 is implicated in long-range regulation of hedgehog signaling.</a> Curr. Biol. 15 (5), 480-488 (2005).</li><li>Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+tracking+using+photoconvertible+proteins+during+zebrafish+development.">Cell tracking using photoconvertible proteins during zebrafish development.</a> J. Vis. Exp. (67), e4350 (2012).</li></ol>

Her er en ny metode til visualisering af kraniofaciale udvikling i zebrafisk model er vist. De sox10: kaede transgene zebrafisk linje er med succes blevet brugt til at beskrive den migrerende mønster af CNCC i detaljer bruges som en model organisme 5.. Tidligere undersøgelser har brugt grove vartegn såsom øjet til at målrette celler og har påberåbt sig kaede mRNA injektion, fotoomdannelse assays eller bur fluorescein dextran for fotoomdannelse 10, 11, 14, 15 Sox:...

Orofaciale kløfter repræsenterer den mest udbredte craniofacial deformitet, med 1/700-1 påvirket 000 leverancer 1.. Forstyrrelse af tidlig embryologiske kraniofaciale udvikling kan føre til dannelse af læbe og gane (CL / P). Mens årsagerne til syndromiske kløft stort set er blevet vist, stadig nødt til at blive afdækket 2-4 de genetiske og epigenetiske baser af nonsyndromic former for orofacial clefting. For at forstå ætiologien og patogenesen af ​​disse misdannelser, er det nødvendigt at belyse udviklingen af ​​kraniofaciale strukturer på celleniveau basis. I alle hvirveldyr kranie neurale crest celler (CNCC) migrere fra dorsale neuralrøret at befolke svælg buer, der vil bidrage til dannelsen af ​​orofaciale strukturer. Forstyrrelse af tidlig embryologiske neural crest udvikling kan føre til dannelse af kraniofaciale misdannelser, herunder CL / P 5-7. I annoncetillæg til strukturelle ligheder mellem zebrafisk og pattedyr kraniofaciale udvikling (CNCCs opholde sig i homologe regioner), er det gen regulerende netværk meget bevares. Det er også blevet vist, at CNCCs udvikle sig på samme måde mellem amniote arter og zebrafisk 8, hvilket gør zebrafisk en stærk organisme til undersøgelse af udviklingsmæssige og genetiske grundlag for CL / P. Det har mange fordele, bl.a. lille størrelse, hurtig og ex-utero embryonale udvikling og høje avl satser. Desuden fosteret er optisk transparent, hvilket gør det muligt at foretage en observation af komplekse udviklingsmæssige begivenheder under lup 9. Det er en ideel dyremodel for studiet af migration og differentiering af kranie neurale crest celler. Udvidelse på tidligere offentliggjorte arbejde 8, 10, 11, den trækmønster af CNCC blev beskrevet i detaljer ved hjælp af de sox10: kaede transgene model 5.. Kaede er et foto-konvertibelt protein, turns fra grøn til rød efter foto aktivering og gør det muligt at spore CNCCs præcist. I løbet af denne forvandling peptidrygraden spaltes, hvilket tyder på, at konverteringen er stabil, hvilket betyder, at cellerne kan spores til deres endelige bestemmelsessted 12. Transgene linier mærket med kaede under transkriptionel kontrol af sox10 viste, at amniote gane og Sibenet plade af zebrafisk dannes homologt ved fusion af bilaterale maxillary prominences (MXP) med frontonasal fremtrædende (FNP), og at Y-formet fusion sømmen er analog mellem arter. Blandt andre applikationer, de sox10: blev kaede transgene zebrafisk model, der anvendes til at generere videoer af zebrafisk embryoner på forskellige udviklingsstadier at vise dannelsen af ​​normale og unormale kraniofaciale strukturer. Fotoomdannelse af specifikke grupper af celler gør det muligt at spore deres udvikling. Med denne metode en tilgang til at skabe levende billeddannelse udvikle craniofacial strukturer i zebrafisk er indført, gør det nemt at visuelt at demonstrere dette kompleks udviklingsproces. Denne protokol har til formål at udveksle erfaringer med at generere disse videoer ved hjælp af den normale udvikling af ethmoid plade i sox10: kaede transgene zebrafisk som et eksempel. Denne protokol kan yderligere anvendes til at gøre time-lapse videoer af enhver struktur stammer fra kranielle neurale crest celler i zebrafisk.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sox10: kaede transgenic zebrafish line</td>
			<td>MGH</td>
			<td></td>
			<td>Available via the Liao lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes 100x15 mm</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes 35 mmx10 mm</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>351008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure Low melting point (LMP) Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15517022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Tek 2 Chamber SlideSystem</td>
			<td>LabTek</td>
			<td>154453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloaders 200/pk</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>E5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R Si Confocal Ti series</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>No Catalog number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements Software AR3.2 64-bit</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>No Catalog number</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of craniofacial development in the sox10: kaede transgenic zebrafish line using time-lapse confocal microscopy

Hvirveldyr palatogenesis er en meget koreograferet og komplekse udviklingsmæssige proces, som involverer migration af kraniale neuralkam (CNC) celler, konvergens og udvidelse af ansigtets fremspring, og modning af kraniofaciale skelet. At studere bidrag kranie neurale våbenskjold til bestemte områder af zebrafisk ganen en sox10: kaede transgene zebrafisk linje blev genereret. Sox10 giver afstamning begrænsning af kaede reporter protein til den neurale våbenskjold, hvorved cellen mærkning en mere præcis proces end traditionel farvestof eller reporter mRNA injektion. Kaede er et foto-konvertibelt protein, der skifter fra grøn til rød efter foto aktivering og gør det muligt at følge celler præcist. De sox10: kaede transgene linje blev brugt til at udføre afstamning analyse for at afgrænse CNC cellepopulationer der giver anledning til maxillary versus mandiblens elementer og illustrere homologi af ansigtets prominences til amniotes. Denne protokol beskrives trins til at generere en levende time-lapse video af en sox10: kaede zebrafisk foster. Udvikling af ethmoid plade vil tjene som et praktisk eksempel. Denne protokol kan anvendes til at gøre en time-lapse konfokal optagelse under nogen kaede eller lignende photoconvertible reporter protein i transgene zebrafisk. Desuden kan det bruges til at fange ikke blot er normal, men også unormal udvikling af kraniofaciale strukturer i zebrafisk mutanter.

I sox10: kaede transgen linje, vandrende og post vandrende CNCCs er mærket fluorescerende grøn. De CNCC celler mærket med grønne fluorescerende kaede rekapitulere endogene sox10 mRNA udtrykket 5. Blandt andre programmer, blev dette dyr model, der anvendes til bedre at visualisere udviklingen af ​​CNCC afhængige kraniofaciale strukturer. Normal udvikling af specifikke strukturer og også patologisk udvikling af kraniofaciale misdannelser, især læbe og gane er blevet fang...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy at JoVE.com

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

Visualisering af eksperimentelle data er blevet et centralt element i at præsentere resultater til det videnskabelige samfund. Generering af levende tidsforskudt optagelse af voksende embryoner bidrager til en bedre præsentation og forståelse af komplekse udviklingsprocesser. Denne protokol er en trin-for-trin guide til cellemærkning via fotoomdannelse af kaede protein i zebrafisk.

Visualisering af kraniofaciale udvikling i sox10: Kaede Transgene zebrafisk linje ved hjælp af Time-lapse konfokal mikroskopi

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...

Research

JoVE Journal

Biology

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Electroporation of Craniofacial Mesenchyme

Elektroporation af kraniofaciale Mesenchyme

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Kvantitativ analyse af Random migration af celler Brug af Time-lapse Video Microscopy

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

Analyserer kraniofacial Morfogenese i zebrafisk Brug 4D konfokal mikroskopi

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Høj opløsning Time-lapse Imaging og Automatiseret analyse af mikrotubulusdynamik i levende menneske navlestrengsveneendotelceller

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...