Name: visualization of craniofacial development in the sox10: kaede transgenic zebrafish line using time-lapse confocal microscopy
Uploaded: 2013-09-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy at JoVE.com

Författarna tackar Robert Kelsh för vänligt dela zebrafisk sox10 promotorn reagens.

1. Embryo Insamling för Photoconversion <ol><li> Sätt upp minst tio par sox10: Kaede transgena zebrafisk mellan 5 och 18:00 på kvällen. </li><li> Nästa morgon, dra avdelare och samla ägg runt middagstid. Ta dem till petriskålar och sätta dem i 28,5 ° C inkubator. </li><li> Vid ungefär 24 timmar efter befruktning, rengör petriskålar genom att ta bort döda embryon. Kontrollera utvecklingsstadiet av embryon 13 med hjälp av ljusfältmikroskop och eventuella fluorescerande mikroskop med förbättra...

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+at+Birth+of+Cleft+Lip+With+or+Without+Cleft+Palate:+Data+From+the+International+Perinatal+Database+of+Typical+Oral+Clefts+(IPDTOC).">Prevalence at Birth of Cleft Lip With or Without Cleft Palate: Data From the International Perinatal Database of Typical Oral Clefts (IPDTOC).</a> Cleft Palate Craniofac. J. 48 (1), 66-81 (2011).</li><li>Dixon, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleft+lip+and+palate:+understanding+genetic+and+environmental+influences.">Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences.</a> Nat. Rev. Genet. 12 (3), 167-178 (2011).</li><li>Mangold, E., Ludwig, K. U., Nothen, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breakthroughs+in+the+genetics+of+orofacial+clefting.">Breakthroughs in the genetics of orofacial clefting.</a> Trends Mol. Med. 17 (12), 725-733 (2011).</li><li>Kimmel, C. B., Miller, C. T., Moens, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+and+morphogenesis+of+the+zebrafish+larval+head+skeleton.">Specification and morphogenesis of the zebrafish larval head skeleton.</a> Dev. Biol. 233 (2), 239-257 (2001).</li><li>Dougherty, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+Fate+Map+of+First+Pharyngeal+Arch+Structures+in+the+sox10:+kaede+Zebrafish+Transgenic+Model.">Embryonic Fate Map of First Pharyngeal Arch Structures in the sox10: kaede Zebrafish Transgenic Model.</a> J. Craniofac. Surg. 23 (5), 1333-1337 (2012).</li><li>Trainor, P. A., Krumlauf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hox+genes,+neural+crest+cells+and+branchial+arch+patterning.">Hox genes, neural crest cells and branchial arch patterning.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 13 (6), 698-705 (2001).</li><li>Schilling, T. F., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segment+and+cell+type+lineage+restrictions+during+pharyngeal+arch+development+in+the+zebrafish+embryo.">Segment and cell type lineage restrictions during pharyngeal arch development in the zebrafish embryo.</a> Development. 120 (3), 483-494 (1994).</li><li>Swartz, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examination+of+a+palatogenic+gene+program+in+zebrafish.">Examination of a palatogenic gene program in zebrafish.</a> Dev. Dyn. 240 (9), 2204-2220 (2011).</li><li>McCollum, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+toxicity+screening+in+zebrafish.+Birth+Defects+Res.">Developmental toxicity screening in zebrafish. Birth Defects Res.</a> C. Embryo Today. 93 (2), 67-114 (2011).</li><li>Wada, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signaling+is+required+for+cranial+neural+crest+morphogenesis+and+chondrogenesis+at+the+midline+in+the+zebrafish+skull.">Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull.</a> Development. 132 (17), 3977-3988 (2005).</li><li>Eberhart, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Hedgehog+signaling+from+neural+to+oral+epithelium+organizes+anterior+craniofacial+development.">Early Hedgehog signaling from neural to oral epithelium organizes anterior craniofacial development.</a> Development. 133 (6), 1069-1077 (2006).</li><li>Ando, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optical+marker+based+on+the+UV-induced+green-to-red+photoconversion+of+a+fluorescent+protein.">An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 99 (20), 12651-12656 (2002).</li><li>Kimmel, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. Dyn. 203 (3), 253-310 (1993).</li><li>Kawakami, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish-secreted+matrix+protein+you/scube2+is+implicated+in+long-range+regulation+of+hedgehog+signaling.">The zebrafish-secreted matrix protein you/scube2 is implicated in long-range regulation of hedgehog signaling.</a> Curr. Biol. 15 (5), 480-488 (2005).</li><li>Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+tracking+using+photoconvertible+proteins+during+zebrafish+development.">Cell tracking using photoconvertible proteins during zebrafish development.</a> J. Vis. Exp. (67), e4350 (2012).</li></ol>

Här har en ny metod för visualisering av craniofacial utveckling i zebrafisk modell visas. De sox10: kaede transgena zebrafisk linje har framgångsrikt använts för att beskriva migrationsmönster CNCC i detalj används som modellorganism 5. Tidigare studier har använt bruttolandmärken som ögat till målceller och har förlitat sig på kaede mRNA injektion, photoconversion analyser eller bur fluorescein dextran för photoconversion 10, 11, 14, 15 sox:. 10 kaede tr...

Orofaciala klyftor representerar den vanligaste kraniofacial missbildning, med 1/700-1, 000 leveranser påverkade 1. Störningar av tidig embryo kraniofaciala utveckling kan leda till bildning av läpp-och gomspalt (CL / P). Även om orsakerna till synd kluven har i stor utsträckning visat, de genetiska och epigenetiska baser av nonsyndromic former av orofacial clefting måste fortfarande avslöjats 2-4. För att förstå etiologin och patogenesen för dessa missbildningar, är det nödvändigt att belysa utvecklingen av kraniofaciala strukturer på en cellulär basis. I alla ryggradsdjur kraniala neurallistceller (CNCC) migrera från den dorsala neuralröret att befolka svalg valv, som bidrar till bildandet av orofaciala strukturer. Störningar av tidig embryo neurallisten utveckling kan leda till bildning av kraniofaciala missbildningar inklusive CL / P 5-7. In adsättning på strukturella likheter mellan zebrafisk och däggdjur kraniofaciala utveckling (CNCCs bor i homologa regioner), är genen reglerande nätverk starkt konservativa. Det har också visats att CNCCs utvecklas på samma sätt mellan amniote arter och zebrafisk 8, vilket gör den zebrafisk en kraftfull organism för studien av utvecklings-och genetiska basen av CL / s. Det har många fördelar, bland annat ringa storlek, snabb och ex-utero foster-utveckling, och höga avelspriser. Dessutom är embryot optiskt transparent, vilket gör den mottaglig för observation av komplexa utvecklings händelser under mikroskop 9. Det är en idealisk djurmodell för studier av migration och differentiering av kraniala neurallistceller. Expanderande på tidigare publicerade verk 8, 10, 11, migrationsmönster CNCC beskrevs i detalj med hjälp av sox10: kaede transgen modell 5. Kaede är en foto-cabriolet protein som turns från grönt till rött efter fotoaktivering och gör det möjligt att spåra CNCCs exakt. Under denna omvandling peptiden ryggraden spjälkas, vilket tyder på att omvandlingen är stabil, vilket innebär att cellerna kan spåras till deras slutliga destination 12. Transgena linjer märkta med kaede under transkriptionskontroll av sox10 visade att amniote gommen och SILBEN platta av zebrafisk bildas homologt genom fusion av bilaterala maxillary protuberanser (MXP) med frontonasal framträdande (FNP) och att Y-formade fusions söm är jämförbar mellan arter. Bland andra program, de sox10: var kaede transgena zebrafisk modell som används för att generera video av zebrafisk embryon vid olika utvecklingsstadier att visa bildandet av normala och onormala kraniofaciala strukturer. Photoconversion av särskilda grupper av celler som gör det möjligt att följa deras utveckling. Med denna metod en metod för att skapa live-avbildning av att utveckla craniofacIAL strukturer i zebrafisk införs, vilket gör det enkelt att visuellt visa detta komplex utvecklingsprocess. Protokollet syftar till att dela upplevelsen av att generera dessa filmer med den normala utvecklingen av SILBEN plattan i sox10: Kaede transgena zebrafisk som exempel. Detta protokoll kan vidare användas till att göra time-lapse video av någon struktur härrör från kraniala neurallistceller i zebrafisk.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sox10: kaede transgenic zebrafish line</td>
			<td>MGH</td>
			<td></td>
			<td>Available via the Liao lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes 100x15 mm</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes 35 mmx10 mm</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>351008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure Low melting point (LMP) Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15517022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Tek 2 Chamber SlideSystem</td>
			<td>LabTek</td>
			<td>154453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloaders 200/pk</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>E5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R Si Confocal Ti series</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>No Catalog number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements Software AR3.2 64-bit</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>No Catalog number</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of craniofacial development in the sox10: kaede transgenic zebrafish line using time-lapse confocal microscopy

Vertebrate palatogenesis är en mycket koreograferad och komplex utvecklings process, som innefattar migration av cranial neural crest (CNC)-celler, konvergens och utvidgning av ansikts protuberanser och mognad av kraniofaciala skelettet. För att studera bidraget från den kraniella neural crest till specifika regioner av zebrafisk gommen en sox10: kaede transgen zebrafisk linje alstrades. Sox10 ger härstamning begränsning av kaede reporter protein till neurallisten, vilket gör cellen märka en mer exakt process än traditionell färg eller reporter mRNA injektion. Kaede är en foto-cabriolet protein som skiftar från grönt till rött efter fotoaktivering och gör det möjligt att följa celler exakt. De sox10: kaede transgen linje användes för att utföra härstamning analys för att avgränsa CNC cellpopulationer som ger upphov till maxillary kontra mandibular element och illustrerar homologi av ansikts protuberanser till amnioternas. Detta protokoll beskriver stegets för att skapa en levande time-lapse video av en sox10: Kaede zebrafisk embryo. Utveckling av SILBEN plattan kommer att fungera som ett praktiskt exempel. Detta protokoll kan användas för att göra ett tidsförlopp konfokala inspelning av någon kaede eller liknande photoconvertible reporter protein i transgena zebrafisk. Dessutom kan den användas för att fånga in inte bara det normala, men även onormal utveckling av kraniofaciala strukturer i zebrafisk mutanter.

I sox10: kaede transgen linje, flyttande och postmigrations CNCCs är märkta fluorescerande grönt. De CNCC celler märkta med grönt fluorescerande kaede rekapitulera endogen sox10 mRNA-uttryck 5. Bland andra program, var denna djurmodell för att bättre visualisera utvecklingen av CNCC beroende kraniofaciala strukturer. Normal utveckling av specifika strukturer samt patologisk utveckling av kraniofaciala missbildningar, speciellt läpp-och gomspalt har fångats. En serie av le...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy at JoVE.com

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

Visualisering av experimentella data har blivit en viktig del i att presentera resultat för forskarvärlden. Generation av levande tidsförlopp inspelning av växande embryon bidrar till en bättre presentation och förståelse för komplexa utvecklingsprocesser. Detta protokoll är en steg-för-steg guide till cellmärkning via photoconversion av kaede protein i zebrafisk.

Visualisering av Kraniofaciala utveckling i sox10: Kaede Transgena Zebrafish Linje Använda Time-lapse konfokalmikroskopi

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...

Research

JoVE Journal

Biology

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

Övervakning Actin demontering med Time-lapse Mikroskopi

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Två-foton axotomy och Time-lapse konfokala imaging i levande zebrafisk embryon

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

Live avbildning av Zebrafish embryonal hjärna av konfokalmikroskopi

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Time-lapse avbildning av Mitos Efter siRNA Transfektion

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation

Multicolor Time-lapse avbildning av Transgena Zebrafish: Visualisering Retinal Stamceller Aktiveras genom riktade neuronal cell Ablation

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Mikroskopi av tidig embryogenesen i Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Electroporation of Craniofacial Mesenchyme

Elektroporation av Craniofacial mesenkym

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Kvantitativ analys av Random migration av celler med Time-lapse video Mikroskopi

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

Analysera Kraniofaciala Morphogenesis i Zebrafish Använda 4D konfokalmikroskopi

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Högupplöst time-lapse avbildning och automatiserad analys av mikrotubuli Dynamics i Living Human navelsträngsvenendotelceller

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...