Name: protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis
Uploaded: 2013-08-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis at JoVE.com

Эта работа была частично поддержана Внутренние программы исследований NIH, Национальный институт рака, Центра по исследованию рака, соглашение о сотрудничестве между NCI исследований и Calidris терапии; Американского онкологического общества грант IRG 97-152-17 к а, и федеральные средства из Национальный институт рака, NIH, по контракту HHSN26120080001E.

1. Приготовление клеточных лизата Этот протокол предназначен для прилипшие клетки, экспрессирующие GFP-любое слитого белка. Необходимое количество клеток может варьироваться от самого низкого показателя 10 6 до целых 20 х 10 6 клеток, в зависимости от уровня экспр?...

<ol>
	<li>Lea, W. A., Simeonov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+polarization+assays+in+small+molecule+screening.">Fluorescence polarization assays in small molecule screening.</a> Expert. Opin. Drug Discov. 6, 17-32 (2011).</li><li>Willander, M., Al-Hilli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+biomolecules+using+surface+plasmons.">Analysis of biomolecules using surface plasmons.</a> Methods Mol. Biol. 544, 201-229 (2009).</li><li>Hulme, E. C., Trevethick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand+binding+assays+at+equilibrium:+validation+and+interpretation.">Ligand binding assays at equilibrium: validation and interpretation.</a> Br. J. Pharmacol. 161, 1219-1237 (2010).</li><li>Ghai, R., Falconer, R. J., Collins, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+isothermal+titration+calorimetry+in+pure+and+applied+research--survey+of+the+literature+from+2010.">Applications of isothermal titration calorimetry in pure and applied research--survey of the literature from 2010.</a> J. Mol. Recognit. 25, 32-52 (2012).</li><li>Vuignier, K., Schappler, J., Veuthey, J. L., Carrupt, P. A., Martel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-protein+binding:+a+critical+review+of+analytical+tools.">Drug-protein binding: a critical review of analytical tools.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. , 398-3953 (2010).</li><li>Lebowitz, J., Lewis, M. S., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modern+analytical+ultracentrifugation+in+protein+science:+a+tutorial+review.">Modern analytical ultracentrifugation in protein science: a tutorial review.</a> Protein Sci. 11, 2067-2079 (2002).</li><li>Duhr, S., Braun, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+molecules+move+along+a+temperature+gradient.">Why molecules move along a temperature gradient.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 19678-19682 (2006).</li><li>Zillner, K., Jerabek-Willemsen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+thermophoresis+as+a+sensitive+method+to+quantify+protein:+nucleic+acid+interactions+in+solution.">Microscale thermophoresis as a sensitive method to quantify protein: nucleic acid interactions in solution.</a> Methods Mol. Biol. 815, 241-252 (2012).</li><li>Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-binding+assays+in+biological+liquids+using+microscale+thermophoresis.">Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis.</a> Nat. Commun. 1, 100 (2010).</li><li>Stark, G. R., Darnell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+JAK-STAT+pathway+at+twenty.">The JAK-STAT pathway at twenty.</a> Immunity. 36, 503-514 (2012).</li><li>Ehret, G. B., Reichenbach, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+binding+specificity+of+different+STAT+proteins.+Comparison+of+in+vitro+specificity+with+natural+target+sites.">DNA binding specificity of different STAT proteins. Comparison of in vitro specificity with natural target sites.</a> J. Biol. Chem. 276, 6675-6688 (2001).</li><li>Yang, J., Stark, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+unphosphorylated+STATs+in+signaling.">Roles of unphosphorylated STATs in signaling.</a> Cell Res. 18, 443-451 (2008).</li><li>Timofeeva, O. A., Chasovskikh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+unphosphorylated+STAT3+transcription+factor+binding+to+DNA.">Mechanisms of unphosphorylated STAT3 transcription factor binding to DNA.</a> J. Biol. Chem. 287, 14192-14200 (2012).</li><li>Timofeeva, O. A., Tarasova, N. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT3+suppresses+transcription+of+proapoptotic+genes+in+cancer+cells+with+the+involvement+of+its+N-terminal+domain.">STAT3 suppresses transcription of proapoptotic genes in cancer cells with the involvement of its N-terminal domain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2013).</li><li>Patterson, G., Day, R. N., Piston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+spectra.">Fluorescent protein spectra.</a> J. Cell Sci. 114, 837-838 (2001).</li></ol>

Выражение и очистка белка является трудоемким и дорогостоящим шагом, который, однако, необходимы для определения K взаимодействий &quot;D большинство используемых в настоящее время способом. Применение MST позволяет избежать очистки белка таким образом, значительно упрощая и ускоря...

Количественная характеристика сродства межмолекулярных взаимодействий важно во многих областях биомедицинских исследований. Связывание константа диссоциации (K D) имеет важное значение не только в лекарственных препаратах, но также является важным параметром в характеристике любого парного взаимодействия в любой биологической системы. Биохимические методы, используемые для выявления белок-белковых взаимодействий, таких как дрожжи и иммунопреципитацией двугибридная экраны, не сообщите нам о том, как плотно те ​​взаимодействия, в то время как близость определяет, что данный комплекс существует в данных условиях в естественных условиях. В процессе лекарственных средств, обязательного анализа развития является одним из необходимых и часто наиболее трудоемких шагов. Наиболее часто используемые методы определения Уб включают поляризации флуоресценции, 1 поверхностного плазмонного резонанса (SPR) технологии, 2 связывания радиоактивного, 3 изотермических калориметрии титрования, 4 равновесиигм диализа (ЭД), 5 ультрафильтрации (UF), 5 и ультрацентрифугирования (UC). 6 Все они требуют значительных количеств очищенного белка-мишени. Микромасштабные термофореза (MST) является быстро развивающийся метод, обнаруживающий направленное движение молекул в микроскопической градиента температуры. Любые изменения гидратной оболочки биомолекул приводит к относительному изменению движение вдоль градиента температуры. 7 MST используется для определения аффинности связывания и был применен для исследования связывания лиганда с флуоресцентно меченых белков или флуоресцентных лигандов с белком-мишенью. 8, 9 MST позволяет измерять взаимодействие непосредственно в растворе без необходимости иммобилизации на поверхности (иммобилизации без технологии). Практически любое связывание сопровождается изменением MST сигнал, хотя размер изменение отличается от системы к системе значительно. Для обнаружения движения молекул по MST, они должны быть флуоресцируютNT. Это главное ограничение метода можно превратить в преимущество. Если белок экспрессируется как GFP синтеза в любой системе, это будет только флуоресцентные молекулы и, следовательно, могут быть изучены без выделения из клеточного лизата или бесклеточной системе экспрессии. Генерация клеточных лизатов, которые позволяют условия связывания с минимальными артефактами является серьезной проблемой. Здесь мы опишем протокол клеточного лизата подготовки и MST эксперимент, который может быть использован для различных растворимых и мембранных белков. STAT белки скрыты цитоплазматическими факторами транскрипции активируется фосфорилирование тирозина в ответ на внеклеточные сигналы и участвуют во многих биологических процессах, включая иммунитет, кроветворение, воспаление и развитие. 10 У млекопитающих, STAT семья состоит из STAT 1, 2, 3, 4 , 5A, 5B и 6. Все активированные статы известно, связывается с той же самой последовательности ДНК, так называемого газового мотив, IFN-гамма активирован последовательности. Тем не менее, transcriptional последствия различные статистические данные очень разные. +11 несмотря на участие во многих патологических процессов и обширные исследования получая более 17000 изданий, Уб STAT взаимодействий с различными последовательностями ДНК не были определены. Только относительной близости различных статистику, чтобы варианты ГАЗ Мотив был охарактеризован. 11 Трудности в выражении и очистки белков являются основными препятствиями в характеристике ДНК STATs &#39;селективности связывания. Хотя большинство исследований были сосредоточены на роли &quot;активированный&quot; статистику, которая стала синонимом Тир-фосфорилированному транскрипционный фактор, роль нефосфорилированные STATs (U-STATs) в регуляции транскрипции быстро развивается. 12 Тем не менее, эти механизмы изучены плохо, и неясно, является ли U-STATs фактически связываются с ДНК или действовать через взаимодействие с другими факторами транскрипции. Недавно мы показали, что U-STAT3 может связываться с ДНК последовательномCES отличается от ГАЗ мотивы с еще более высоким сродством. +13 открытие имеет большое значение для нашего понимания биологических функций этого важного белка. Мы применили микромасштабной термофореза для определения относительного сродства STAT3 на газ и АТ-богатых олигонуклеотидных S +100 (рис. 4). Почти одинаковый протокол не был использован для определения K D для связывания различных STAT3 лиганд, липопептидный ингибитора. 14 Нет связывания связанных фактора транскрипции, GFP-STAT1, который был использован в качестве отрицательного контроля могут быть обнаружены таким образом подтверждая селективность взаимодействия. 14

<table border="1">
	<tbody>
 <tr>
 <td>Name of the Reagent/material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RIPA buffer</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>20-188</td>
 <td>Other manufacturer's buffers work as well</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Protease inhibitors cocktail</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P2714</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monolith NT.115</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>G008</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monolith NT.115 Capillary Tray</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>T001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monolith NT.115 Standard Treated Capillaries</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>K002</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NT Control software</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>2.0.2.29</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NT Analysis software</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>1.4.27</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Table-top refrigerated centrifuge</td>
 <td>Eppendorf </td>
 <td>5417R</td>
 <td>Other microtube refrigerated centrifuges</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Protein LoBind Tube 0.5 ml</td>
 <td>Eppendorf </td>
 <td>22431064</td>
 <td></td>
 </tr>
	 </tbody>
 </table>

protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis

Количественная характеристика белковых взаимодействий необходимо практически в любой области наук о жизни, в частности лекарственных препаратов. Большинство доступных в настоящее время методы определения K D необходим доступ к очищенного белка, представляющего интерес, генерация которого может быть трудоемким и дорогим. Мы разработали протокол, который позволяет для определения аффинности связывания по микромасштабной термофореза (MST) без очистки целевого белка из клеточных лизатов. Способ включает гиперэкспрессией GFP-слитого белка и лизиса клеток в неденатурирующих условиях. Применение метода к STAT3-GFP временно экспрессированного в клетках НЕК293, позволил определить впервые сродство хорошо изученных фактора транскрипции олигонуклеотиды с различными последовательностями. Протокол является простым и может иметь различные применения для исследования взаимодействия белков с небольшой молекулы, пептиды, ДНК, РНК и рroteins.

Измерение сродства нефосфорилированные STAT3 связывание белка с олигонуклеотидов. НЕК293 клетках, экспрессирующих STAT3-GFP были использованы в качестве источника флуоресцентно меченных STAT3 для связывания ДНК анализа. Клеточные лизаты получали с использованием RIPA бу?...

Watch this Scientific Journal Video about Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis at JoVE.com

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Микромасштабные термофореза (MST) могут быть широко использованы для определения аффинности связывания без очистки целевого белка из клеточных лизатов. Протокол включает сверхэкспрессии GFP-слитый белок, лизис клеток в неденатурирующих условиях, и обнаружение MST сигнала в присутствии различных концентраций лиганда.

Очистки белков-Free метод привязки Определение Affinity по Микромасштабные Термофорез

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Микрообъеме концентрации белка Определение использованием NanoDrop 2000c Спектрофотометр

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

Важность правильной концентрации белка для кинетики и Affinity Определение в структурно-функционального анализа

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Выделение лабильной Multi-белковые комплексы по В естественных условиях Контролируемые Сотовая сшивания и иммуно-магнитного аффинной хроматографии

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

PAR-Clip - метод идентификации транскриптома всей места связывания РНК-связывающие белки

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

Липидов везикул-опосредованной аффинной хроматографии с использованием магнитных Активированный сортировки клеток (LIMACS): новый метод для анализа Белково-липидные взаимодействия

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Biochemical Reconstitution of Steroid ReceptorÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â¢Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Биохимические Восстановление стероидных рецепторов • Hsp90 белковые комплексы и Реактивация связывания лигандов

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Ортогональные очистки белков Ведущий: Малый Биспецифичные тегов Affinity

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

Идентификация белка взаимодействие партнеров, используя тандем аффинной очистки

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

В режиме реального времени Анализы транспорта ретинола на мембранный рецептор плазменных Retinol Binding Protein

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

Протокол для фагов и Affinity выделение с помощью рекомбинантного белка Приманки

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...