Name: examination of synaptic vesicle recycling using fm dyes during evoked, spontaneous, and miniature synaptic activities
Uploaded: 2014-03-31T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities at JoVE.com

De auteurs danken de leden van de harata lab voor nuttige discussies tijdens de uitvoering van dit werk. Dit werk werd gefinancierd door subsidies van de American Heart Association, de Dystonie Medical Research Foundation, de Edward Mallinckrodt, Jr Foundation, de National Science Foundation, en de Whitehall Stichting NCH

1. Primaire Cultuur van neuronen van de hersenen van zoogdieren Alle dierlijke procedures uitgevoerd in deze studie worden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de Universiteit van Iowa. <ol><li> Bereid de gedissocieerde celkweek van de CA3-CA1 regio van hippocampus van muizen of ratten op postnatale dagen 0-1 19,20. Plate hippocampale cellen op 12-mm dekglaasjes (dikte getal 0) preseeded de ratten gliale feeder-laag, in 24 putjes en met een dichthe...

We hebben protocollen beschreven voor het kleuren en ontkleuren synaptische blaasjes in reactie op opgewekte, spontane en miniatuur synaptische activiteit en voor het afbeelden in de ontkleuroplossing fase. Naast de bestaande protocollen, hebben we een nieuw protocol observeren de FM ontkleuroplossing basis van miniatuur synaptische activiteit inbegrepen. Met deze protocollen we eerder geïdentificeerde afwijkingen in gekweekte neuronen van een muismodel van de beweging dystonie. In vergelijking met hun tegenhangers in ...

De functionaliteit van synaptische blaasjes is een belangrijke determinant van synaptische transmissie. Deze blaasjes vrijkomen neurotransmitters als ze fuseren met de presynaptische plasmamembraan (exocytose), en worden ze klaar voor een nieuwe cyclus van vrijlating na wordt geregenereerd uit het plasmamembraan (endocytose) en herladen met neurotransmitter. Onderzoek naar de dynamiek van en de onderliggende mechanismen van synaptische blaasje recycling is sterk versneld door de invoering van styrylkleurstoffen FM kleurstoffen 1. Deze amfipatische moleculen, die positief hebben geladen hydrofiele kopgroepen en hydrofobe staarten (meerdere kleurstoffen in figuur 1A, stereoview van FM1-43 in Figuur 1B), kunnen reversibel invoeren en lipide membranen verlaten zonder doordringt hen. Groepen van FM kleurstoffen onderlinge overeenkomsten vertonen dat het bereik van het licht dat ze uitstralen beïnvloeden. Bijvoorbeeld, FM2-10, FM1-43, en FM1-84 hebben een dubbele binding tussen twee cyclische verbindingen en show groene emissie. Het verschil tussen hen is de lengte van de hydrofobe staart, die haar hydrofobiciteit bepaalt en daarmee de snelheid van uitgang uit het membraan (departitioning). In het geval van FM5-95 en FM4-64, drie dubbele bindingen verbinden de cyclische verbindingen, en ze tonen rode emissie. Deze kleurstoffen verschillen met betrekking tot hun hydrofiele delen. In alle FM kleurstoffen, de fluorescentie-intensiteit toeneemt wanneer ze worden ingebracht in biologische membranen, door een toename in de quantum opbrengst in de hydrofobe omgeving ten opzichte van de hydrofiele omgeving. Dus de veranderingen in de FM-intensiteit geven de veranderingen in de membraan omzet. De verschillende kleuren (emissie spectra) en hydrofobiciteiten maken van de FM-kleurstoffen een veelzijdig onderzoeksinstrument in synaptische blaasje recycling. Op basis van deze eigenschappen worden de FM kleurstoffen meestal gebruikt volgens het volgende schema bij het ​​analyseren synaptische vesikel recycling (figuur 2). Neurons baden in een extracellulaire oplossing die het FM kleurstof, waardoor het worden opgenomen in synaptische blaasjes (SV) aangezien zij via endocytose (kleuring). De kleurstof wordt vervolgens weggewassen door een kleurstof vrij extracellulaire oplossing, dit toont de functionele zenuwuiteinden, namelijk alleen die actief ondergaan endocytose wordt een cluster van synaptische blaasjes die worden geladen met de kleurstof (figuur 2 beneden) bevatten. Na exocytose leidt tot verlies van de FM kleurstof aan de extracellulaire ruimte en een gelijktijdige verlies van fluorescentie (ontkleuren, door zowel de departitioning een hydrofiel milieu en diffusie vanaf de plaats van exocytose). Daarom zijn de veranderingen in de FM-fluorescentie-intensiteit zijn indicatoren van synaptische blaasjes exo-en endocytose. FM kleurstoffen zijn gebruikt om vlekken en Destain de synaptische blaasjes in verschillende organismen en preparaten 2,3. Voorbeelden zijn zoogdieren neuronale culturen 4-9, zoogdierbrein plakjes 10,11, neuromusculaire verbindingen 12,13, retinale bipolaire neuronen 14,15 en haarcellen van slakkenhuis 16. Meestal in dergelijke experimenten, zowel kleuren en ontkleuren worden getriggerd door uitvoerig stimuleren van de neuronen (opgeroepen activiteit). Onlangs echter synaptische vesikel recycling reactie op zwakke stimulatie ook geanalyseerd, evenals recycling in afwezigheid van een externe stimulus (spontane en miniatuur synaptische activiteit) 9,17-19. Spontane en miniatuur synaptische activiteiten worden gedefinieerd als die die in afwezigheid van externe stimuli, met de voormalige waarbij spontane afvuren van actiepotentialen (figuur 3). Deze zwakke synaptische activiteiten geassocieerd met kleinere veranderingen FM signalen dan die veroorzaakt door uitgebreide stimulatie. De meting vereist dat de veranderingen in de FM-tllingen intensiteit nauwkeurig weergeven synaptische vesikel exocytose of endocytose maar niet artefactuele veranderingen in intensiteit. Een oorzaak van het artefact is de aanwezigheid van niet-specifieke kleuring van de plasmamembraan door FM kleurstoffen. Geleidelijke uitspoeling van deze component leidt tot een geleidelijke verandering in de gemeten fluorescentie-intensiteit die ten onrechte wordt toegeschreven aan synaptische activiteiten. Deze factor kan worden verminderd door geschikte methoden (zie Protocol). De meest opvallende oorzaak van het artefact is de photobleaching van FM kleurstof vastgehouden binnen synaptische blaasjes. De photobleaching gerelateerde veranderingen in FM intensiteit moet klein zijn in vergelijking met de biologische (synaptische) veranderingen die worden gemeten. De recente ontwikkeling van gevoelige camera&#39;s, zoals het elektronen vermenigvuldigen ladingsgekoppelde inrichting (EMCCD) camera maakt het mogelijk fotobleken door het verkorten belichtingstijd en verzwakking van de intensiteit van het licht gebruikt om de fluorofoor wekken minimaliseren. Een andere oorzaak van het artefact is een drift in de nadruk niveau van de lichtmicroscoop. De focus drift tijdens een opnamesessie kan worden veroorzaakt door mechanische of thermische effecten, en ten onrechte leiden tot een verandering in de gemeten fluorescentie-intensiteit. Hier beschrijven we protocollen en apparatuur die het mogelijk maken FM kleurstoffen om synaptische vesikel recycling analyseren zelfs in het kader van zwakke of geen stimulatie met name de miniatuur synaptische activiteit. We tonen voorbeelden van de kleuren en ontkleuren van blaasjes tijdens opgewekte en spontane synaptische gebeurtenissen, met behulp van gekweekte knaagdier hippocampus neuronen, en beeldvorming van het ontkleuren fase. We tonen ook hoe de mate van FM kleurstof fotobleking evalueren, bij het ontbreken van een FM-kleurstof verlies als gevolg van synaptische activiteiten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1767">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Pulse generator</td>
			<td>AMPI</td>
			<td>Master-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolated stimulator</td>
			<td>Digitimer</td>
			<td>DS3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TS100</td>
			<td>This is used for assessing the cell morphology at low magnification.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TiE</td>
			<td>This is used for high-resolution fluorescence and transmitted light imaging, with minimal focus drift.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Water-immersion lens is recommended. Oil-immersion lens is usable unless an imaged structure is deep from the coverslip surface (e.g. &#62;10 &#956;m).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cube</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>77032509</td>
			<td>490/20-nm ex, 510-nm dclp, 520-nm-LP em for FM1-43</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cube</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>77032809</td>
			<td>490/20-nm ex, 510-nm dclp, 650-nm-LP em for FM4-64.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD camera</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td>iXon EM+ DU-860</td>
			<td>This EMCCD camera is used for high-sensitivity detection of fluorescence.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid recirculating chiller</td>
			<td>Solid State Cooling Systems</td>
			<td>Oasis 160</td>
			<td>This is used for continuously perfusing the camera with chilled water for maintaining a temperature of -80&#176;C, and thereby reducing noise.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED</td>
			<td>CoolLED-Custom Interconnect</td>
			<td>490 nm&#160;</td>
			<td>This light source is used for rapid on/off control of fluorescence excitation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition software</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td>Solis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-21BRFS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast perfusion system</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SF-77B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNQX</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>1045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D,L-AP5</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>0106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrodotoxin</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>1069</td>
			<td>Caution: toxic reagent. Handle with care.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM1-43</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T35356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aldehyde-fixable FM1-43 (FM1-43FX)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F35355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM4-64</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T13320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aldehyde-fixable FM4-64 (FM4-64FX)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F34653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#8217; balanced salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H2387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>51200-038</td>
			<td>This solution does not contain phenol red that will interfere with fluorescence imaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Caution: toxic reagent. Handle with care.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

examination of synaptic vesicle recycling using fm dyes during evoked, spontaneous, and miniature synaptic activities

Synaptische blaasjes in functionele zenuwuiteinden ondergaan exocytose en endocytose. Deze synaptische vesikel recycling effectief kan worden geanalyseerd met behulp FM styryl kleurstoffen, die membraan omzet onthullen. Gebruikelijke protocollen voor het gebruik van FM kleurstoffen zijn ontworpen voor het analyseren neuronen na gestimuleerde (opgeroepen) synaptische activiteit. Onlangs zijn protocollen beschikbaar voor het analyseren van de FM-signalen die zwakker synaptische activiteiten, zoals spontane of miniatuur synaptische gebeurtenissen gevoegd worden. Analyse van deze kleine veranderingen FM signalen vereist dat het beeldvormingssysteem is voldoende gevoelig voor kleine veranderingen in intensiteit detecteren, maar dat kunstmatig veranderingen van grote amplitude worden onderdrukt. Hier beschrijven we een protocol dat kan worden toegepast opgeroepen, spontaan en miniatuur synaptische activiteiten en gebruik gekweekte hippocampale neuronen als voorbeeld. Dit protocol omvat ook een middel bepalen van de omvang van fotobleken FM kleurstoffen, aangezien dit een belangrijkebron van artefacten wanneer beeldvorming kleine veranderingen in de intensiteit.

Als voorbeeld tonen wij representatieve resultaten voor de ontkleuroplossing tijdsverloop van synaptische vesicles (figuur 4). Gekweekte hippocampale neuronen gekleurd met FM4-64 met de spontane synaptische activiteit (stap 2.3) en gewassen met kleurstofvrije oplossing (spoeloplossing 2). De beeldvorming toont de initiële ontkleuroplossing tijdsverloop behulp van spontane activiteit (stap 5.3) (eerste onderdeel van de continue lijn, figuur 4A). Dit wordt gevolgd door de ontkleuroplossi...

Watch this Scientific Journal Video about Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities at JoVE.com

Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities

We beschrijven het gebruik van styrylkleurstoffen FM kleurstoffen aan het synaptische blaasje recycling in functionele zenuwuiteinden. Dit protocol kan niet alleen opgeroepen, maar ook spontane en miniatuur synaptische activiteiten worden toegepast. Het protocol breidt het aantal synaptische gebeurtenissen die effectief kan worden geëvalueerd.

Onderzoek van de synaptische vesikel Recycling FM Kleurstoffen Tijdens Evoked, Spontaan, en Miniature Synaptic Activiteiten

Synaptic vesicles in functional nerve terminals undergo exocytosis and endocytosis. This synaptic vesicle recycling can be effectively analyzed using ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Neuroscience

Cellular Processes

Membranes and Cellular Transport

SCIENTISTS IN ACTION

Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes

Studeren Synaptic Blaasjes zwembaden met behulp van Photoconversion van styrylkleurstoffen

The fusion of synaptic vesicles with the plasma membrane (exocytosis) is a required step in neurotransmitter release and neuronal communication. The ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

Kwantitatieve analyse van synaptische Blaasjes Pool Replenishment in gekweekte Cerebellaire Korrel Neuronen met behulp van FM-kleurstoffen

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Laterale diffusie en Exocytose van membraaneiwitten in gekweekte zenuwcellen gemeten met behulp van Fluorescence Recovery en fluorescentie-verlies fotobleken

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

Afleiden van de Time Cursus van Glutamaat Clearance met een Deconvolutie Analyse van astrocyten Transporter Currents

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

Meten van Synaptic vesikel endocytose in gekweekte Hippocampal neuronen

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Synaptische plasticiteit opnemen in Acute Hippocampal plakjes onderhouden in een kleine volumes Recycling-, perfusie-, en onderdompeling-type kamer systeem

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

Kweken In Vivo-graag lymfkliertest astrocyten met behulp van de snelle, eenvoudige en goedkope AWESAM-Protocol

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...

Pentylenetetrazole-Induced Kindling Mouse Model

Pentylenetetrazole-geïnduceerde aanmaakhout muismodel

Pentylenetetrazole (PTZ) is a GABA-A receptor antagonist. An intraperitoneal injection of PTZ into an animal induces an acute, severe seizure at a high ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

Optogenetics combineren met kunstmatige microRNAs te karakteriseren van de effecten van Gene Knockdown op presynaptische functie binnen Intact neuronale Circuits

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

An Optical Assay for Synaptic Vesicle Recycling in Cultured Neurons Overexpressing Presynaptic Proteins

Een optische Assay voor Synaptic vesikel Recycling in gekweekte neuronen Overexpressing presynaptische eiwitten

At active presynaptic nerve terminals, synaptic vesicles undergo cycles of exo- and endocytosis. During recycling, the luminal domains of SV transmembrane ...