Name: intravital microscopy for imaging subcellular structures in live mice expressing fluorescent proteins
Uploaded: 2013-09-01T19:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins at JoVE.com

وأيد هذا البحث من قبل برنامج بحوث جماعية من المعاهد الوطنية للصحة، والمعهد الوطني للأبحاث الأسنان والجمجمة.

جزء 1: المجاهر وإعداد الإعداد التصوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي أن يكون أي متحد البؤر المجهر المقلوب مناسبة لIVM. في هذه الدراسة تم استخدام المجهر أوليمبوس IX81 مقلوب، ومجهزة مع وحدة المسح الضوئي ليزر متحد البؤر Fluoview-1000. لتحقيق أفضل قرار مم?...

<ol>
	<li>Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+in+vivo+analyses+of+cell+function+using+fluorescence+imaging+(*).">Emerging in vivo analyses of cell function using fluorescence imaging (*).</a> Annu Rev Biochem. 80, 327-332 (2011).</li><li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+cell-matrix+adhesions+to+the+third+dimension.">Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.</a> Science. 294, 1708-1712 (2001).</li><li>Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy:+a+novel+tool+to+study+cell+biology+in+living+animals.">Intravital microscopy: a novel tool to study cell biology in living animals.</a> Histochem Cell Biol. 133, 481-491 (2010).</li><li>Dunn, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+studies+of+the+kidney+of+living+animals+using+multicolor+two-photon+microscopy.">Functional studies of the kidney of living animals using multicolor two-photon microscopy.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 283, C905-C916 (2002).</li><li>Masedunskas, A., Porat-Shliom, N., Weigert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+exocytosis:+novel+insights+from+intravital+microscopy.">Regulated exocytosis: novel insights from intravital microscopy.</a> Traffic. 13, 627-634 (2012).</li><li>Masedunskas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+the+actomyosin+complex+in+regulated+exocytosis+revealed+by+intravital+microscopy.">Role for the actomyosin complex in regulated exocytosis revealed by intravital microscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 13552-13557 (2011).</li><li>Masedunskas, A., Weigert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+two-photon+microscopy+for+studying+the+uptake+and+trafficking+of+fluorescently+conjugated+molecules+in+live+rodents.">Intravital two-photon microscopy for studying the uptake and trafficking of fluorescently conjugated molecules in live rodents.</a> Traffic. 9, 1801-1810 (2008).</li><li>Sramkova, M., Masedunskas, A., Parente, L., Molinolo, A., Weigert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+plasmid+DNA+in+the+salivary+gland+epithelium:+novel+approaches+to+study+dynamic+cellular+processes+in+live+animals.">Expression of plasmid DNA in the salivary gland epithelium: novel approaches to study dynamic cellular processes in live animals.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 297, C1347-C1357 (2009).</li><li>Sramkova, M., Najman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current Frontiers and Perspectives in Cell Biology. , (2012).</li><li>Masedunskas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Everything+you+need+to+know+about+intravital+microscopy:+A+practical+guide+on+imaging+intracellular+structures+in+live+animals.">Everything you need to know about intravital microscopy: A practical guide on imaging intracellular structures in live animals.</a> Bioarchitecture. 2, (2012).</li><li>Masedunskas, A., Sramkova, M., Parente, L., Weigert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+to+image+membrane+trafficking+in+live+rats.">Intravital microscopy to image membrane trafficking in live rats.</a> Methods Mol. Biol. 931, 153-167 (2013).</li><li>Babbey, C. M., Ryan, J. C., Gill, E. M., Ghabril, M. S., Burch, C. R., Paulman, A., Dunn, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+intravital+microscopy+of+hepatic+transport.">Quantitative intravital microscopy of hepatic transport.</a> Intravital. 1, 44-53 (2012).</li><li>Rothstein, E. C., Nauman, M., Chesnick, S., Balaban, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-photon+excitation+microscopy+in+intact+animals.">Multi-photon excitation microscopy in intact animals.</a> J. Microsc. 222, 58-64 (2006).</li><li>Klinger, A., Orzekowsky-Schroeder, R., von Smolinski, D., Blessenohl, M., Schueth, A., Koop, N., Huettmann, G., Gebert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+morphology+and+functional+dynamics+of+vital+murine+intestinal+mucosa+revealed+by+autofluorescence+2-photon+microscopy.">Complex morphology and functional dynamics of vital murine intestinal mucosa revealed by autofluorescence 2-photon microscopy.</a> Histochem. Cell Biol. 137, 269-278 (2012).</li><li>Peter, B., Van Waarde, M. A., Vissink, A., s-Gravenmade, E. J., Konings, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degranulation+of+rat+salivary+glands+following+treatment+with+receptor-selective+agonists.">Degranulation of rat salivary glands following treatment with receptor-selective agonists.</a> Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 22, 330-336 (1995).</li></ol>

حتى الآن تم تصوير معظمها في البنى التحت خلوية في المختبر (أي مزارع الخلايا) أو في فيفو السابقين (أي الجهاز الثقافات، وشرائح الأنسجة، والاستعدادات عنيبية) نظم النموذج الذي غالبا ما لا ألخص خصائص الأنسجة الحية سليمة 6. في هذا الصدد، والنهج المقدمة هنا يم?...

في العقدين الماضيين أدت ظهور المجهر الحية واستخدام البروتينات الفلورية لاختراقات كبرى على كل عملية الخلوية التي يمكن تخيلها، وبالتالي تعزيز فهمنا للبيولوجيا الخلية 1. وقد استفاد هذا المجال بشكل كبير من استخدام الثقافات خلايا الثدييات التي هي نموذج نظم قوية للغاية، لا سيما عندما يتعلق الأمر التلاعب التجريبية. ومع ذلك، فإنها غالبا ما لا توفر التمثيل الحقيقي للبيولوجيا الكائنات الحية متعددة الخلايا المعقدة 2. وقد بدأت هذه القضية التي يتعين معالجتها من خلال تطوير intravital المجهري (IVM) التي فتحت الباب أمام التحقيق الأسئلة البيولوجية الرئيسية في مجالات مثل علم الأعصاب، علم المناعة والأورام والبيولوجيا 3. حتى الآن، فإن معظم الدراسات على أساس الإدارة المتكاملة للنواقل أجريت على مستوى الأنسجة والخلايا الفردية، دون تقديم أي معلومات عن ديناميات مقصورات التحت خلوية. في الآونة الأخيرة، لدينا مختبر وغيرهاو قد وضعت تقنيات الإدارة المتكاملة للنواقل قادرة على التصوير الهياكل التحت خلوية في القوارض الحية 4-7، 13-15 والسماح التلاعب الدوائية والوراثية في الجسم الحي. وقد استخدم هذا النهج من قبلنا لدراسة الاتجار غشاء في الجسم الحي، وبشكل أكثر تحديدا الإلتقام وينظم إيماس 6،7. ويستند نظامنا النموذج التجريبي على فضح، وتحقيق الاستقرار وتصوير الغدد اللعابية تحت الفك السفلي (اس جي اس) من القوارض تخدير. هو اختيار SGS كجهاز نموذجا للIVM يرجع ذلك إلى حقيقة أن الغدد يمكن الوصول إليها بسهولة عن طريق إجراء عملية جراحية بسيطة، يمكن تخريجها دون المساس بهم علم وظائف الأعضاء، واستقرت للحد من الحركة الفنية بسبب ضربات القلب والتنفس. بالإضافة إلى ذلك، SGS يمكن التلاعب بها وراثيا عن طريق حقن انتقائي ناقلات إما فيروسية أو غير الفيروسية مقرها من خلال القناة اللعابية 8،9. أخيرا، اس جي اس هي الغدد خارجية الإفراز تتألف من epith الاستقطابخلايا الليل، والتي تشكل عنيبات ​​والقنوات، وخلايا عضلية ظهارية، ويبلغ عدد سكانها معقدة من الخلايا اللحمية. لهذا السبب، فهي نموذجا ممتازا لدراسة إيماس، الإلتقام، والتسليم الجينات، والهيكل الخلوي الأكتين، على النحو المبين في دراساتنا الأخيرة 10، وتتيح الفرصة لدراسة جوانب بيولوجيا الخلايا مثل الخلايا القطبية، انقسام الخلايا، خلية تقاطعات الخلية، والقنوات الأيونية. في هذه الورقة نحن تصف بالتفصيل بروتوكول التصوير لتحقيق قرار التحت خلوية في ظهارة من SGS على فأرة الحاسوب حية. على وجه التحديد، وتبين لنا كيفية صورة حبيبات إفرازية في خلايا عنيبية من SGS خلال إيماس المنظمة. كما هو موضح سابقا، على التحفيز مع منبهات مستقبلات بيتا الأدرينالية، وحبيبات إفرازية تلتحم مع غشاء البلازما قمية وتنهار تدريجيا، والإفراج عن محتوياتها في نفيق عنيبية 6. هدفنا هو توفير الأدوات الأساسية للمحققين مع متجربة inimal في العمليات الجراحية والتعامل مع الحيوانات، حتى يتمكنوا من أداء بنجاح IVM في قرار التحت خلوية. منذ الجزء الأكثر تحديا في IVM هو التحضير للحيوان، وهنا نركز على وصف الإجراءات الجراحية الأساسية التي تستخدم لكشف ولشل حركة SGS دون المساس ظيفتها. أما بالنسبة للإجراءات لتسمية البنى التحت خلوية، عدة استراتيجيات، مثل تسليم النظامية من تحقيقات الفلورسنت، واستخدام الحيوانات المعدلة وراثيا، أو مزيج من الاثنين معا، وقد وصفت في مكان آخر 7،11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Isoflourane (Forane)</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>101936-40</td>
			<td>Handle under chemical hood</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ketamine (ketaved)</td>
			<td>Fort Dodge Animal Health</td>
			<td>57457-034-10</td>
			<td>Stock solution 100 mg/ml</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Xylazine (Anased)</td>
			<td>Akorn, Decatur</td>
			<td>61311-481-10</td>
			<td>Stock solution 100 mg/ml</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Neomycin/Polymyxin B</td>
			<td>Bausch and Lomb</td>
			<td>24208-785-55</td>
			<td>Use to lubricate the eye of the mouse</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Carbomer-940</td>
			<td>Ashalnd, Inc.</td>
			<td>4607-1</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1876</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Triethanolamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>90279</td>
			<td>Add drop wise to prevent the solution to solidify</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Isoproternol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>16504</td>
			<td>Prepare fresh solutions in saline when needed. Stocks can be stored at -20 &deg;C</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Isoflurane V 1.9 (Vaporizer)</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>190AF</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Portable Downdraft table equipped with HEPA filter</td>
			<td>Hazard Technology</td>
			<td>PDDT</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Heat lamp, Model HL1</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>HL-1 US</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>MicroTherma 2T Thermometer</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>TW2</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Operating Scissors (11.5 cm straight</td>
			<td>World Precision Instruments </td>
			<td>5003708-12</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>#7 curved tip tweezers</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14187</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microscissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>503365</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Black Braided Silk suture #4.0</td>
			<td>George &amp; Tiemann &amp; Co</td>
			<td>160-1219-4</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Gauze sponges 2" x 2"</td>
			<td>Tyco Healthcare</td>
			<td>9022</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Lens cleaning tissue</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CL-TISSUE (M97) AX6476</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

intravital microscopy for imaging subcellular structures in live mice expressing fluorescent proteins

نحن هنا وصف الإجراء لصورة هياكل التحت خلوية في القوارض الحية التي تقوم على استخدام intravital المجهري متحد البؤر. كجهاز نموذج، ونحن نستخدم الغدد اللعابية من الفئران الحية نظرا لأنها توفر العديد من المزايا. الأولى، فإنها يمكن أن تتعرض بسهولة لتمكين الوصول إلى البصريات، واستقرت لتسهيل الحد من الحركة الفنية بسبب ضربات القلب والتنفس. هذا يسهل بشكل كبير التصوير وتتبع هياكل التحت خلوية صغيرة. الثانية، فإن معظم السكان خلية من خلايا الغدد اللعابية يمكن الوصول إليها من سطح الجهاز. هذا يسمح باستخدام المجهر متحد البؤر التي لديها القرار المكانية أعلى من غيرها من التقنيات التي استخدمت لفي الجسم الحي التصوير، مثل اثنين من الفوتون المجهري. أخيرا، الغدد اللعابية يمكن التلاعب بها بسهولة عقاقيري وراثيا، وبالتالي توفير نظام قوي للتحقيق في العمليات البيولوجية على المستوى الجزيئي. في هذه الدراسة ونحن نركز على بروتوكول صمم لمتابعة حركية من إيماس من حبيبات إفرازية في خلايا عنيبية وديناميات غشاء البلازما قمية حيث تلتحم الحبيبات الإفرازية على تحفيز مستقبلات بيتا الأدرينالية. على وجه التحديد، ونحن استخدام الماوس المعدلة وراثيا التي تشارك في تعرب عن GFP عصاري خلوي والببتيد التي تستهدف غشاء تنصهر مع بروتين فلوري جنبا إلى جنب، الطماطم. ومع ذلك، فإن الإجراءات التي استخدمناها لتحقيق الاستقرار وصورة الغدد اللعابية يمكن أن تمتد إلى نماذج الماوس الأخرى وإلى جانب لمناهج أخرى لتسمية في الجسم الحي المكونات الخلوية، مما يمكن تصور مختلف الهياكل التحت خلوية، مثل الإندوسومات، الجسيمات الحالة، الميتوكوندريا، و الهيكل الخلوي الأكتين.

في GFP / mTomato الماوس، تظهر عنيبات ​​الهياكل تمييزا واضحا، الذي أعرب عن GFP عصاري خلوي والتي تستهدف غشاء جنبا إلى جنب، الطماطم الببتيد (الشكل 2، خط كسر). في عنيبات ​​الفردية، ويتم رسم خلايا عنيبية من الببتيد جنبا إلى جنب، الطماطم. تم الكشف عن GFP أيضا في نوى التي ه?...

Watch this Scientific Journal Video about Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins at JoVE.com

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

intravital المجهري هو أداة قوية تمكن التصوير العمليات البيولوجية المختلفة في الحيوانات الحية. في هذه المقالة، نقدم طريقة مفصلة لتصوير ديناميات الهياكل التحت خلوية، مثل حبيبات إفرازية، في الغدد اللعابية من الفئران الحية.

حيوي داخلي المجهري للهياكل التصوير التحت خلوية في الفئران لايف تعرب عن البروتينات الفلورية

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Research

JoVE Journal

Biology

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

يعيش تصوير الدماغ الجنينية اسماك الزرد بواسطة الميكروسكوب متحد البؤر

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

يعيش التصوير خلية من طراز F - أكتين حيوية عن طريق الميكروسكوب الرقطة نيون (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

بطاقات المواد الفلورية ذبابة الفاكهة</emهياكل القلب>

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

الفلورسنت وصفها من COS - 7 تعرب عن البروتينات الانصهار SNAP - شعارا لتصوير الخلايا الحية

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

زرع GFP - معربا عن Blastomeres للتصوير لايف التنمية الشبكية والدماغ في الجنين اسماك الزرد همي

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Photoconversion of Purified Fluorescent Proteins and Dual-probe Optical Highlighting in Live Cells

Photoconversion منقى من البروتينات ونيون المزدوجة التحقيق تسليط الضوء البصري في الخلايا الحية

Photoconvertible fluorescent proteins (pc-FPs) are a class of fluorescent proteins with "optical highlighter" capability, meaning that the color of ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

يعيش التصوير من البروتينات التي تحمل علامات GFP في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; البويضات

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

في الجسم الحي تتبع نسيلي من الخلايا الجذعية المكونة للدم والسلف تميزت خمسة البروتينات الفلورية باستخدام الميكروسكوب متحد البؤر وMultiphoton

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

قياس وقت واحد من الميتوكوندريا الكالسيوم والميتوكوندريا غشاء المحتملة في الخلايا الحية التي كتبها نيون الميكروسكوب

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Fluorescence Recovery after Photobleaching of Yellow Fluorescent Protein Tagged p62 in Aggresome-like Induced Structures

الأسفار الانتعاش بعد p62 "فوتوبليتشينج من الأصفر فلوري البروتين معلم" في "الهياكل التي يسببها" مثل أجريسومي

Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)&#160;is a microscopy technique that can be used to quantify protein mobility in live cells. In a typical ...