Name: intravital microscopy for imaging subcellular structures in live mice expressing fluorescent proteins
Uploaded: 2013-09-01T19:00:00
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本研究は、NIHの学内研究プログラム、歯科および頭蓋顔面研究所の国立研究所によってサポートされていました。

パート1：顕微鏡とイメージングのセットアップの準備<ol><li>任意の倒立型共焦点顕微鏡は、IVMのために適していなければならない。この研究においてFLUOVIEW-1000レーザー走査共焦点ユニットを備えたOlympus IX81倒立顕微鏡を用いた。可能な限り最高の分解能を達成するために、このような水浸UPLSAPO 60x/1.20 Na及び油浸プラン-アポ60x/1.42 NAの高NA対物レンズの使用は、推奨されます。油浸対物レン?...

<ol>
	<li>Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+in+vivo+analyses+of+cell+function+using+fluorescence+imaging+(*).">Emerging in vivo analyses of cell function using fluorescence imaging (*).</a> Annu Rev Biochem. 80, 327-332 (2011).</li><li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+cell-matrix+adhesions+to+the+third+dimension.">Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.</a> Science. 294, 1708-1712 (2001).</li><li>Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy:+a+novel+tool+to+study+cell+biology+in+living+animals.">Intravital microscopy: a novel tool to study cell biology in living animals.</a> Histochem Cell Biol. 133, 481-491 (2010).</li><li>Dunn, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+studies+of+the+kidney+of+living+animals+using+multicolor+two-photon+microscopy.">Functional studies of the kidney of living animals using multicolor two-photon microscopy.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 283, C905-C916 (2002).</li><li>Masedunskas, A., Porat-Shliom, N., Weigert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+exocytosis:+novel+insights+from+intravital+microscopy.">Regulated exocytosis: novel insights from intravital microscopy.</a> Traffic. 13, 627-634 (2012).</li><li>Masedunskas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+the+actomyosin+complex+in+regulated+exocytosis+revealed+by+intravital+microscopy.">Role for the actomyosin complex in regulated exocytosis revealed by intravital microscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 13552-13557 (2011).</li><li>Masedunskas, A., Weigert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+two-photon+microscopy+for+studying+the+uptake+and+trafficking+of+fluorescently+conjugated+molecules+in+live+rodents.">Intravital two-photon microscopy for studying the uptake and trafficking of fluorescently conjugated molecules in live rodents.</a> Traffic. 9, 1801-1810 (2008).</li><li>Sramkova, M., Masedunskas, A., Parente, L., Molinolo, A., Weigert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+plasmid+DNA+in+the+salivary+gland+epithelium:+novel+approaches+to+study+dynamic+cellular+processes+in+live+animals.">Expression of plasmid DNA in the salivary gland epithelium: novel approaches to study dynamic cellular processes in live animals.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 297, C1347-C1357 (2009).</li><li>Sramkova, M., Najman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current Frontiers and Perspectives in Cell Biology. , (2012).</li><li>Masedunskas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Everything+you+need+to+know+about+intravital+microscopy:+A+practical+guide+on+imaging+intracellular+structures+in+live+animals.">Everything you need to know about intravital microscopy: A practical guide on imaging intracellular structures in live animals.</a> Bioarchitecture. 2, (2012).</li><li>Masedunskas, A., Sramkova, M., Parente, L., Weigert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+to+image+membrane+trafficking+in+live+rats.">Intravital microscopy to image membrane trafficking in live rats.</a> Methods Mol. Biol. 931, 153-167 (2013).</li><li>Babbey, C. M., Ryan, J. C., Gill, E. M., Ghabril, M. S., Burch, C. R., Paulman, A., Dunn, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+intravital+microscopy+of+hepatic+transport.">Quantitative intravital microscopy of hepatic transport.</a> Intravital. 1, 44-53 (2012).</li><li>Rothstein, E. C., Nauman, M., Chesnick, S., Balaban, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-photon+excitation+microscopy+in+intact+animals.">Multi-photon excitation microscopy in intact animals.</a> J. Microsc. 222, 58-64 (2006).</li><li>Klinger, A., Orzekowsky-Schroeder, R., von Smolinski, D., Blessenohl, M., Schueth, A., Koop, N., Huettmann, G., Gebert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+morphology+and+functional+dynamics+of+vital+murine+intestinal+mucosa+revealed+by+autofluorescence+2-photon+microscopy.">Complex morphology and functional dynamics of vital murine intestinal mucosa revealed by autofluorescence 2-photon microscopy.</a> Histochem. Cell Biol. 137, 269-278 (2012).</li><li>Peter, B., Van Waarde, M. A., Vissink, A., s-Gravenmade, E. J., Konings, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degranulation+of+rat+salivary+glands+following+treatment+with+receptor-selective+agonists.">Degranulation of rat salivary glands following treatment with receptor-selective agonists.</a> Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 22, 330-336 (1995).</li></ol>

これまでのところ、細胞内構造は、 インビトロ （ すなわち 、細胞培養）またはex vivoで （ すなわち 、臓器培養、組織切片、腺房の準備）は、多くの場合、完全な生体組織6の特性を再現しないモデル系で主に画像化されています。それは生きているマウスでは、特定の膜輸送の段階（ すなわち規制エキソサイトーシス）の動態を画像化することが?...

過去20年間で、ライブ顕微鏡の出現と蛍光タンパク質の使用は、細胞生物1の我々の理解を進め、ありとあらゆる細胞プロセスに大きなブレークスルーにつながっている。このフィールドには、それは実験操作に来る場合は特に、非常に強力なモデル系である哺乳動物細胞培養の使用から途方も恩恵を受けている。しかし、彼らはしばしば、複雑な多細胞生物2の生物学の真の表現を提供していません。この問題は、このような神経生物学、免疫学、腫瘍生物学の3などの分野で重要な生物学的な質問を調査への扉を開いた生体顕微鏡（IVM）の開発によって対処され始めている。今のところ、IVMに基づいて、研究のほとんどは、細胞内区画の動力学に関する情報を提供せずに、組織および個々の細胞のレベルで行われている。最近では、我々の研究室や他のsは、生きたげっ歯類4-7に13〜15細胞内構造を画像化およびインビボでの薬理学的および遺伝的操作を可能にすることができるIVM技術を開発した。このアプローチは、 インビボで膜輸送を研究し、より具体的には、エンドサイトーシスおよび調節性エキソサイトーシス6,7するために我々が使用されている。 我々の実験モデルシステムは、麻酔をかけたげっ歯類の顎下唾液腺（SGSに）安定化とイメージング、露光に基づいています。 IVMのモデル器官としてのSGの選択は、腺小手術を行うことで、容易にアクセス可能であるという事実に起因して、その生理機能を損なうことなく外部化、ハートビートと呼吸によるモーションアーチファクトを低減するために安定させることができる。また、SGsアソシエイトを選択的に唾液管8,9を介して、ウイルスまたは非ウイルスベースのベクターのいずれかを注入することにより、遺伝的に操作することができる。最後に、SGSは偏epithで構成される外分泌腺である腺房や導管、筋上皮細胞、間質細胞の複雑な集団を形成elial細胞。このため、彼らは我々の最近の研究10で強調されているように、エキソサイトーシス、エンドサイトーシス、遺伝子送達、およびアクチン細胞骨格を研究し、そのような細胞極性、細胞分裂、細胞などの細胞生物学の側面を研究する機会を提供するための優れたモデルである細胞間結合、およびイオンチャネル。 本論文では詳細に生きたマウスののSGの上皮で細胞内分解能を達成するための撮影プロトコルを記述します。具体的には、どのように画像を調整されたエキソサイトーシスの間のSGの腺房細胞内の分泌顆粒をするには、show。以前に示されているように、β-アドレナリン受容体のアゴニストで刺激すると、分泌顆粒は、頂端形質膜と融合し、徐々に崩壊し、腺房細管6にその内容を解放する。私たちの目標は、Mと研究者に基本的なツールを提供することです外科的処置の動物取り扱いのinimal経験、それらが正常に細胞内解像度でIVMを実行できるようにします。 IVMの中で最も困難な部分が動物の製造であるので、ここでは、その機能を損なうことなく、SGSに公開し、固定化するために利用されている基本的な手術手順の説明に重点を置いています。全身性蛍光プローブの送達は、トランスジェニック動物の使用、または両方の組み合わせとして細胞内構造、いくつかの戦略を標識するための手順としては、他の箇所に記載されている7,11。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Isoflourane (Forane)</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>101936-40</td>
			<td>Handle under chemical hood</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ketamine (ketaved)</td>
			<td>Fort Dodge Animal Health</td>
			<td>57457-034-10</td>
			<td>Stock solution 100 mg/ml</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Xylazine (Anased)</td>
			<td>Akorn, Decatur</td>
			<td>61311-481-10</td>
			<td>Stock solution 100 mg/ml</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Neomycin/Polymyxin B</td>
			<td>Bausch and Lomb</td>
			<td>24208-785-55</td>
			<td>Use to lubricate the eye of the mouse</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Carbomer-940</td>
			<td>Ashalnd, Inc.</td>
			<td>4607-1</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1876</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Triethanolamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>90279</td>
			<td>Add drop wise to prevent the solution to solidify</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Isoproternol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>16504</td>
			<td>Prepare fresh solutions in saline when needed. Stocks can be stored at -20 &deg;C</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Isoflurane V 1.9 (Vaporizer)</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>190AF</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Portable Downdraft table equipped with HEPA filter</td>
			<td>Hazard Technology</td>
			<td>PDDT</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Heat lamp, Model HL1</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>HL-1 US</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>MicroTherma 2T Thermometer</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>TW2</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Operating Scissors (11.5 cm straight</td>
			<td>World Precision Instruments </td>
			<td>5003708-12</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>#7 curved tip tweezers</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14187</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microscissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>503365</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Black Braided Silk suture #4.0</td>
			<td>George &amp; Tiemann &amp; Co</td>
			<td>160-1219-4</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Gauze sponges 2" x 2"</td>
			<td>Tyco Healthcare</td>
			<td>9022</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Lens cleaning tissue</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CL-TISSUE (M97) AX6476</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

intravital microscopy for imaging subcellular structures in live mice expressing fluorescent proteins

ここでは、共焦点生体顕微鏡を使用することに基づいているライブげっ歯類における画像細胞内構造に手順を説明します。彼らはいくつかの利点を提供するため、モデル機関として、我々は、生きたマウスの唾液腺を使用しています。第一に、それらは容易に光学素子へのアクセスを可能にするために露出し、心拍及び呼吸によるモーションアーチファクトの低減を促進するために安定させることができる。これは大幅に画像化し、小さな細胞内構造を追跡を容易にします。第二に、唾液腺の細胞集団の大部分は、器官の表面からアクセス可能である。これは、二光子顕微鏡などのインビボイメージングのために使用されている他の技術よりも高い空間分解能を有する共焦点顕微鏡の使用を可能にする。最後に、唾液腺、容易にこのようにして分子レベルでの生物学的プロセスを調査する堅牢なシステムを提供し、薬理学的および遺伝的に操作することができる。 本研究では、腺房細胞内の分泌顆粒のエキソサイトーシスおよび分泌顆粒は、β-アドレナリン受容体の刺激により融合頂端細胞膜のダイナミクスの動態に従うように設計されたプロトコルに焦点を当てています。具体的には、細胞質ゾル、GFP蛍光タンパク質タンデムトマトと融合した膜を標的とするペプチドを共発現するトランスジェニックマウスを使用していました。しかし、我々は唾液腺を安定させ、画像に使用する手順は、他のマウスモデルに拡張し、そのようなエンドソーム、リソソーム、ミトコンドリアなどの様々な細胞内構造の可視化を可能にする、in vivoでの細胞成分を標識する他のアプローチに結合することができ、アクチン細胞骨格。

GFP / mTomatoマウスでは、腺房細胞質ゾル、GFPと膜を標的とタンデムトマトペプチド（ 図2、破線）を発現するよう明確に異なる構造を、表示されます。個々の腺房では、腺房細胞は、タンデムトマトペプチドによって描写されています。 GFPはまた、腺房細胞（ 図2、矢印）の内部にはっきりと見える核において検出される。細胞質ゾルGFPは、直径約1〜1.5程度の暗い円?...

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Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

生体顕微鏡は、生きた動物の様々な生物学的プロセスを画像化可能にする強力なツールです。この記事では、生きたマウスの唾液腺では、このような分泌顆粒として細胞内構造のダイナミクスを画像化するための具体的な方法を提示する。

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Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

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