Name: intravital microscopy for imaging subcellular structures in live mice expressing fluorescent proteins
Uploaded: 2013-09-01T19:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins at JoVE.com

Denna forskning stöds av Interna forskningsprogram av NIH, National Institute of Dental och Craniofacial forskning.

Del 1: Mikroskop och Beredning av Imaging Setup <ol><li> Varje inverterat konfokalmikroskop bör vara lämplig för IVM. I denna studie var en Olympus IX81 inverterat mikroskop, utrustat med en FluoView-1000 laserskanning konfokala enhet användes. För att uppnå bästa möjliga upplösning, är användning av höga NA-mål, till exempel vatten-immersion UPLSAPO 60x/1.20 NA, och oljeimmersions Plan-Apo 60x/1.42 NA rekommenderas. Olja nedsänkning mål är effektivare insamling och även om de kräver användning av e...

<ol>
	<li>Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+in+vivo+analyses+of+cell+function+using+fluorescence+imaging+(*).">Emerging in vivo analyses of cell function using fluorescence imaging (*).</a> Annu Rev Biochem. 80, 327-332 (2011).</li><li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+cell-matrix+adhesions+to+the+third+dimension.">Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.</a> Science. 294, 1708-1712 (2001).</li><li>Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy:+a+novel+tool+to+study+cell+biology+in+living+animals.">Intravital microscopy: a novel tool to study cell biology in living animals.</a> Histochem Cell Biol. 133, 481-491 (2010).</li><li>Dunn, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+studies+of+the+kidney+of+living+animals+using+multicolor+two-photon+microscopy.">Functional studies of the kidney of living animals using multicolor two-photon microscopy.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 283, C905-C916 (2002).</li><li>Masedunskas, A., Porat-Shliom, N., Weigert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+exocytosis:+novel+insights+from+intravital+microscopy.">Regulated exocytosis: novel insights from intravital microscopy.</a> Traffic. 13, 627-634 (2012).</li><li>Masedunskas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+the+actomyosin+complex+in+regulated+exocytosis+revealed+by+intravital+microscopy.">Role for the actomyosin complex in regulated exocytosis revealed by intravital microscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 13552-13557 (2011).</li><li>Masedunskas, A., Weigert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+two-photon+microscopy+for+studying+the+uptake+and+trafficking+of+fluorescently+conjugated+molecules+in+live+rodents.">Intravital two-photon microscopy for studying the uptake and trafficking of fluorescently conjugated molecules in live rodents.</a> Traffic. 9, 1801-1810 (2008).</li><li>Sramkova, M., Masedunskas, A., Parente, L., Molinolo, A., Weigert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+plasmid+DNA+in+the+salivary+gland+epithelium:+novel+approaches+to+study+dynamic+cellular+processes+in+live+animals.">Expression of plasmid DNA in the salivary gland epithelium: novel approaches to study dynamic cellular processes in live animals.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 297, C1347-C1357 (2009).</li><li>Sramkova, M., Najman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current Frontiers and Perspectives in Cell Biology. , (2012).</li><li>Masedunskas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Everything+you+need+to+know+about+intravital+microscopy:+A+practical+guide+on+imaging+intracellular+structures+in+live+animals.">Everything you need to know about intravital microscopy: A practical guide on imaging intracellular structures in live animals.</a> Bioarchitecture. 2, (2012).</li><li>Masedunskas, A., Sramkova, M., Parente, L., Weigert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+to+image+membrane+trafficking+in+live+rats.">Intravital microscopy to image membrane trafficking in live rats.</a> Methods Mol. Biol. 931, 153-167 (2013).</li><li>Babbey, C. M., Ryan, J. C., Gill, E. M., Ghabril, M. S., Burch, C. R., Paulman, A., Dunn, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+intravital+microscopy+of+hepatic+transport.">Quantitative intravital microscopy of hepatic transport.</a> Intravital. 1, 44-53 (2012).</li><li>Rothstein, E. C., Nauman, M., Chesnick, S., Balaban, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-photon+excitation+microscopy+in+intact+animals.">Multi-photon excitation microscopy in intact animals.</a> J. Microsc. 222, 58-64 (2006).</li><li>Klinger, A., Orzekowsky-Schroeder, R., von Smolinski, D., Blessenohl, M., Schueth, A., Koop, N., Huettmann, G., Gebert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+morphology+and+functional+dynamics+of+vital+murine+intestinal+mucosa+revealed+by+autofluorescence+2-photon+microscopy.">Complex morphology and functional dynamics of vital murine intestinal mucosa revealed by autofluorescence 2-photon microscopy.</a> Histochem. Cell Biol. 137, 269-278 (2012).</li><li>Peter, B., Van Waarde, M. A., Vissink, A., s-Gravenmade, E. J., Konings, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degranulation+of+rat+salivary+glands+following+treatment+with+receptor-selective+agonists.">Degranulation of rat salivary glands following treatment with receptor-selective agonists.</a> Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 22, 330-336 (1995).</li></ol>

Hittills subcellulära strukturer har avbildas mestadels i in vitro (dvs. cellkulturer) eller ex vivo (dvs. orgel-kulturer, vävnadssnitt, acinära preparat) modellsystem som ofta inte rekapitulera egenskaper intakta levande vävnader 6. I detta avseende den metod som presenteras här är ett stort genombrott, eftersom det gör det möjligt att avbilda dynamiken i en specifik membran trafficking steg (dvs. reglerad exocytos) i levande möss. Detta protok...

Under de senaste två decennierna tillkomsten av levande mikroskopi och användning av fluorescerande proteiner har lett till genombrott på varje cellulär process tänkbara, därmed öka kunskaperna om cellbiologi 1. Detta fält har gynnats oerhört från användningen av däggdjurscellkulturer som är extremt kraftfulla modellsystem, i synnerhet när det gäller experimentella manipulationer. Men de är inte ofta ger en sann bild av biologi komplexa flercelliga organismer 2. Denna fråga har börjat ta itu med utvecklingen av intravital mikroskopi (IVM) som har öppnat dörren för att utreda viktiga biologiska frågor inom områden som neurobiologi, immunologi och tumörbiologi 3. Hittills har de flesta av de studier som bygger på IVM har utförts på de nivåer av vävnader och enskilda celler, utan att ge någon information om dynamiken i subcellulära fack. Nyligen, vårt laboratorium och andras har utvecklat IVM tekniker som kan imaging subcellulära strukturer i levande gnagare 4-7, 13-15 och möjliggör farmakologiska och genetiska manipulationer in vivo. Detta tillvägagångssätt har använts av oss att studera membran trafficking in vivo, och mer specifikt endocytos och reglerad exocytos 6,7. Vår experimentella modellsystem bygger på att exponera, stabilisera och avbildning av submandibular spottkörtlar (SGS) i sövda gnagare. Valet av SGS som modell organ för IVM beror på det faktum att de körtlar är lättillgängliga genom att utföra en mindre operation, kan externaliserats utan att äventyra deras fysiologi, och stabiliseras för att minska rörelseartefakter på grund av hjärtslag och andning. Dessutom kan SGs selektivt manipuleras genetiskt genom injektion antingen virala eller icke-virala baserade vektorer genom saliv kanalen 8,9. Slutligen SGS är exokrina körtlar består av polariserad epithElial celler, som bildar acini och trummorna, myoepitelceller, och en komplex population av stromala celler. Av denna anledning, de är en utmärkt modell för att studera exocytos, endocytos, genleverans och aktincytoskelettet, såsom framgår av våra nya studier 10, och erbjuder möjligheten att studera aspekter av cellbiologi såsom cell polaritet, celldelning, cell- cell korsningar och jonkanaler. I denna uppsats beskriver vi i detalj ett bildprotokoll för att uppnå subcellulära upplösning i epitel av SGS i en levande mus. Specifikt visar vi hur bilden de sekretoriska granulerna i körtelcellerna i SGS under reglerad exocytos. Som tidigare visats, vid stimulering med agonister av beta-adrenerg receptor, de sekretoriska granulerna smälta samman med det apikala plasmamembranet och så småningom kollapsa, frigöra deras innehåll in i acinar canaliculi 6. Vårt mål är att ge grundläggande verktyg för utredarna med minimal erfarenhet av kirurgiska procedurer och djurhantering, så att de framgångsrikt kan utföra IVM på en subcellulär upplösning. Eftersom den mest utmanande delen i IVM är beredningen av djur, här fokuserar vi på beskrivningen av de grundläggande kirurgiska ingrepp som utnyttjas för att avslöja och immobilisera SGS utan att äventyra deras funktion. När det gäller förfaranden för att märka subcellulära strukturer, flera strategier, såsom systemisk leverans av fluorescerande prober, användning av transgena djur, eller en kombination av båda, har beskrivits på annan plats 7,11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Isoflourane (Forane)</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>101936-40</td>
			<td>Handle under chemical hood</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ketamine (ketaved)</td>
			<td>Fort Dodge Animal Health</td>
			<td>57457-034-10</td>
			<td>Stock solution 100 mg/ml</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Xylazine (Anased)</td>
			<td>Akorn, Decatur</td>
			<td>61311-481-10</td>
			<td>Stock solution 100 mg/ml</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Neomycin/Polymyxin B</td>
			<td>Bausch and Lomb</td>
			<td>24208-785-55</td>
			<td>Use to lubricate the eye of the mouse</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Carbomer-940</td>
			<td>Ashalnd, Inc.</td>
			<td>4607-1</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1876</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Triethanolamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>90279</td>
			<td>Add drop wise to prevent the solution to solidify</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Isoproternol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>16504</td>
			<td>Prepare fresh solutions in saline when needed. Stocks can be stored at -20 &deg;C</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Isoflurane V 1.9 (Vaporizer)</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>190AF</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Portable Downdraft table equipped with HEPA filter</td>
			<td>Hazard Technology</td>
			<td>PDDT</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Heat lamp, Model HL1</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>HL-1 US</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>MicroTherma 2T Thermometer</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>TW2</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Operating Scissors (11.5 cm straight</td>
			<td>World Precision Instruments </td>
			<td>5003708-12</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>#7 curved tip tweezers</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14187</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microscissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>503365</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Black Braided Silk suture #4.0</td>
			<td>George &amp; Tiemann &amp; Co</td>
			<td>160-1219-4</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Gauze sponges 2" x 2"</td>
			<td>Tyco Healthcare</td>
			<td>9022</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Lens cleaning tissue</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CL-TISSUE (M97) AX6476</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

intravital microscopy for imaging subcellular structures in live mice expressing fluorescent proteins

Här beskriver vi ett förfarande för att avbilda subcellulära strukturer i levande gnagare som baseras på användning av konfokal intravital mikroskopi. Som en modell organ använder vi salivkörtlarna hos levande möss eftersom de ger flera fördelar. För det första kan de lätt exponeras för att möjliggöra tillträde till optik, och stabiliseras för att underlätta minskningen av rörelseartefakter på grund av hjärtslag och andning. Detta underlättar avsevärt bildbehandling och spåra små subcellulära strukturer. För det andra, de flesta av de cellpopulationer i spottkörtlarna är åtkomlig från ytan av organet. Detta möjliggör användning av konfokal mikroskopi, som har en högre spatial upplösning än andra tekniker som har använts för in vivo imaging, såsom två-foton-mikroskopi. Slutligen kan spottkörtlar lätt manipuleras farmakologiskt och genetiskt, vilket ger ett robust system för att undersöka biologiska processer på molekylär nivå. I denna studie fokuserar vi på ett protokoll för att följa kinetiken av exocytos av sekretoriska granuler i acinarceller och dynamiken i den apikala plasmamembranet där de sekretoriska granula smälter vid stimulering av beta-adrenerga receptorer. Specifikt använde vi en transgen mus som samar uttrycker cytosolic GFP och ett membran riktade peptid smält med det fluorescerande proteinet tandem-Tomat. Däremot kan de förfaranden som vi används för att stabilisera och bild spottkörtlarna utvidgas till andra musmodeller och kopplad till andra metoder för att märka in vivo cellkomponenter, som möjliggör visualisering av olika subcellulära strukturer, såsom endosomer, lysosomer, mitokondrier, och aktin cytoskelettet.

I GFP / mTomato mus, acini framstå som klart distinkta strukturer, vilka uttrycker cytosoliskt GFP och membran inriktade tandem-Tomat peptid (fig 2, streckade linjer). I enskilda acini är acinarceller avgränsas av tandem-Tomat peptid. GFP detekteras också i kärnan som är klart synliga inuti acinar-celler (figur 2, pilar). Cytosoliskt GFP är undantagna från de sekretoriska granuler som visas som mörka runda blåsor på cirka 1-1,5 um i diameter (Figur 2, infäll...

Watch this Scientific Journal Video about Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins at JoVE.com

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Intravital mikroskopi är ett kraftfullt verktyg som gör det möjligt att avbilda olika biologiska processer i levande djur. I denna artikel presenteras en detaljerad metod för avbildning av dynamiken i subcellulära strukturer, såsom de sekretoriska granuler, i salivkörtlarna hos levande möss.

Intravital Mikroskopi för Imaging subcellulära strukturer i levande möss som uttrycker fluorescerande proteiner

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Research

JoVE Journal

Biology

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

Live avbildning av Zebrafish embryonal hjärna av konfokalmikroskopi

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

Levande cell imaging av F-aktin Dynamics via Fluorescent Speckle Mikroskopi (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

Fluorescerande märkning av Drosophila Heart strukturer

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

Fluorescerande märkning av COS-7 uttrycka SNAP-tagg fusionsproteiner för levande cell imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Transplantation av GFP-uttryckande blastomerer för Live avbildning av näthinnan och hjärnans utveckling hos chimära Zebrafish embryon

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Photoconversion of Purified Fluorescent Proteins and Dual-probe Optical Highlighting in Live Cells

Photoconversion renat fluorescerande proteiner och Dual-probe optisk markering i levande celler

Photoconvertible fluorescent proteins (pc-FPs) are a class of fluorescent proteins with "optical highlighter" capability, meaning that the color of ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

Live avbildning av GFP-märkta proteiner i<em&gt; Drosophila</em&gt; Oocyter

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Klon Spårning av hematopoetiska stam och progenitorceller märkta med fem fluorescerande proteiner med hjälp Konfokal och multifoton mikroskopi

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Samtidig mätning av mitokondrie kalcium och mitokondriell membranpotential i levande celler genom fluorescensmikroskopi

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Fluorescence Recovery after Photobleaching of Yellow Fluorescent Protein Tagged p62 in Aggresome-like Induced Structures

Fluorescens återhämtning efter Fotoblekning av gula fluorescerande Protein taggade p62 i Aggresome-liknande inducerad strukturer

Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)&#160;is a microscopy technique that can be used to quantify protein mobility in live cells. In a typical ...