Name: cell death associated with abnormal mitosis observed by confocal imaging in live cancer cells
Uploaded: 2013-08-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell Death Associated with Abnormal Mitosis Observed by Confocal Imaging in Live Cancer Cells at JoVE.com

Financieringsbronnen van dit onderzoek: een gezamenlijk fonds van de Universiteit van Tel Aviv overdracht van technologie bedrijf, RAMOT en het Sheba Medical Center (M. CA en SI.), ICRF - Israëlische Cancer Research Foundation (M. CA.) En Israel Science Foundation ( SI).

1. Cel Cultuur Voorbereiding MDA-MB-231-cellen werden gekocht bij ATCC (American Type Culture Collection) en opgeslagen in vloeibare stikstof. <ol><li> Seed 10 6 MDA-MB-231-cellen in 92 mm Petri-schaal in 10 ml compleet medium bevattende Dulbeco Modified Eagle Medium (DMEM), 10% paardenserum, 1% L-glutamine en 1% Penstrep-Amfotericine B. Laat cellen te prolifereren tot 80-100% confluentie. </li><li> Verwijder kweekmedium uit schotel en gooi. </li><li> Spoel even de cell...

<ol>
	<li>Jagtap, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+phananthridine+inhibitors+of+poly(adenosine+5'-diphosphate-ribose)+synthetase:+Potent+cytoprotective+and+antishock+agents.">Novel phananthridine inhibitors of poly(adenosine 5'-diphosphate-ribose) synthetase: Potent cytoprotective and antishock agents.</a> Crit. Care Med. 30, 1071-1082 (2002).</li><li>Castiel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+molecule+exclusively+eradicates+human+cancer+cells:+Extra-centrosomes+de-clustering+agent.">A small molecule exclusively eradicates human cancer cells: Extra-centrosomes de-clustering agent.</a> BMC Cancer. 11 (1), 412 (2011).</li><li>Inbar-Rozensal, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+selective+eradication+of+human+nonhereditary+breast+cancer+cells+by+phenanthridine+-derived+polyADP-ribose+polymerase+inhibitors.">A selective eradication of human nonhereditary breast cancer cells by phenanthridine -derived polyADP-ribose polymerase inhibitors.</a> Breast Cancer Res. 11 (6), R78 (2009).</li><li>Gergely, F., Basto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+centrosomes:+together+they+stand,+divided+they+fall.">Multiple centrosomes: together they stand, divided they fall.</a> Genes Dev. 22, 2291-2296 (2008).</li><li>Godinho, S. A., Kwon, M., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosomes+and+cancer:+how+cancer+cells+divide+with+too+many+centrosomes.">Centrosomes and cancer: how cancer cells divide with too many centrosomes.</a> Canc. Met. Rev. 28, 85-98 (2009).</li><li>Doxsey, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-evaluating+centrosome+function.">Re-evaluating centrosome function.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 688-698 (2001).</li><li>Walczak, C. E., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+mitotic+spindle+assembly+and+function.">Mechanisms of mitotic spindle assembly and function.</a> International Rev. of Cytology. 265, 111-158 (2008).</li><li>Ogden, A., Rida, P. C. G., Aneja, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Let's+huddle+to+prevent+a+muddle:+centrosome+declustering+as+an+attractive+anticancer+strategy.">Let's huddle to prevent a muddle: centrosome declustering as an attractive anticancer strategy.</a> Cell Death Differ. 19, 1255-1267 (2012).</li><li>Kramer, A., Anderhub, S., Maier, B., Schatten, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+Consequences+of+centrosomes+clustering+in+cancer+cells.">Mechanisms and Consequences of centrosomes clustering in cancer cells.</a> The Centrosome: Cell and Molecular mechanisms of functions and disfunctions in disease. , 255-277 (2012).</li><li>Galimberti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaphase+Catastrophe+Is+a+Target+for+Cancer+Therapy.">Anaphase Catastrophe Is a Target for Cancer Therapy.</a> Clin. Cancer Res. 17, 1218-1222 (2011).</li><li>Kanai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haploinsufficiency+of+poly(ADP-ribose)+polymerase-1-mediated+poly(ADP-ribosyl)ation+for+centrosome+duplication.">Haploinsufficiency of poly(ADP-ribose) polymerase-1-mediated poly(ADP-ribosyl)ation for centrosome duplication.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 359, 426-430 (2007).</li><li>Gartner, E. M., Burger, A. M., Lorusso, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(ADP-ribose)+polymerase+inhibitors:+a+novel+drug+class+with+a+promising+future.">Poly(ADP-ribose) polymerase inhibitors: a novel drug class with a promising future.</a> Cancer J. 16, 83-90 (2010).</li><li>Wahlberg, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Family-wide+chemical+profiling+and+structural+analysis+of+PARP+and+tankyrase+inhibitors.">Family-wide chemical profiling and structural analysis of PARP and tankyrase inhibitors.</a> Nature Biotechnology. 30, 283-288 (2012).</li><li>Rouleau, M., Patel, A., Hendze, M. J., Kaufmann, S. H., Poirier, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP+inhibition:+PARP1+and+beyond.">PARP inhibition: PARP1 and beyond.</a> Nature Rev. Cancer. 10, 293-301 (2010).</li><li>Leber, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteins+Required+for+Centrosome+Clustering+in+Cancer+Cells.">Proteins Required for Centrosome Clustering in Cancer Cells.</a> Sci. Transl. Med. 2 (33), 33-38 (2010).</li><li>Kwon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+to+suppress+multipolar+division+in+cancer+cells+with+extra+centrosomes.">Mechanisms to suppress multipolar division in cancer cells with extra centrosomes.</a> Gene Dev. 22, 2189-2203 (2008).</li></ol>

Wonen confocale beeldvorming voorzien van een real-time documentatie van het cytotoxische effect van PJ-34 in levende multi-centrosomal cellen tijdens mitose (Figuur 3 en aanvullende informatie). Dit was de eerste levende documentatie toeschrijven de cytotoxiciteit van PJ-34 in menselijke kankercellen extra centrosomes de-clustering en celdood, suggereert inductie van mitotische catastrofe celdood door PJ-34 5-9. Daarentegen werd bifocale clustering van super-numerary centrosomes waargenomen ...

Fenantreen afgeleid PARP1 remmers, waaronder PJ-34, werden ontworpen om latente cellen van apoptotische celdood geïnduceerd door de energieverbruikende PARP1 gemedieerde DNA-reparatie onder stress-omstandigheden (beroerte of myocardinfarct) te beschermen 1. Echter, recent ontdekten we dat PJ-34, twee keer hogere concentratie dan dat inducerende PARP1 remming, kan uitsluitend leiden tot celdood in menselijke kankercellen 2,3. De snellere van de proliferatie van de cel was, hoe efficiënter de uitroeiing van de cellen was. De cytotoxische activiteit van de PJ-34 werd toegeschreven aan extra-centrosomes de-clustering in mitose 2. Veel menselijke kankercellen haven multicentrosomes 4,5. Incubatie van menselijke borstkankercellen MDA-MB-231, die boventallige centrosomen haven, met 20 uM PJ-34 efficiënt uitgeroeid deze cellen binnen 72-96 uur zonder afbreuk rustende cellen of een goedaardige delende cellen die twee centrosomes in mitose <sup&gt; 2,3. Goedaardige cellen opgenomen menselijke mammaire epitheelcellen MCF-10, menselijke endotheelcellen (HUVEC) en primaire mesenchymale cellen bereid uit humane thymus. Deze cellen waren resistent voor de cytotoxische activiteit van PJ-34. PJ-34 niet bemoeien met hun celcyclus gedurende 96 uur incubatie of invloed op hun centrosomes en bi-focale spindel vorming van 2,3. Bipolaire centrosome montage is cruciaal voor bipolaire vorming spil in mitose 4,5. Daarom hebben cellen met meer dan twee centrosomes een nauwelijks begrepen moleculaire mechanisme ontwikkeld clustering hun extra centrosomes tweepolig 4-9. Falen van een bipolaire assemblage van hun centrosomes kan multipolaire vervormde spindels en afwijkende chromosomen segregatie dat de arrestaties de cel-cyclus in de G2 / M arrestatie, en leidt tot celdood toegeschreven aan mitotische mislukking 4,5 veroorzaken. De moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan extra-centrosomes de-clustering worden intensief onderzocht &lt;sup&gt; 10. Inzicht in dit mechanisme dood zal exclusieve uitroeiing van kankercellen in staat stellen terwijl sparen gezonde weefsels 5,10. Aldus verbindingen die mitotische catastrofe celdood activeren bieden een nieuwe manier van een selectieve kankertherapie, die efficiënt kan in een breed spectrum van menselijke vaste cancers.Our resultaten suggereren dat confocale beeldvorming kan worden gebruikt om moleculen die extra-centrosomes clustering worden geïdentificeerd mitose 2,3, waardoor deze verbindingen kanker targeting kandidaat-geneesmiddelen. We hebben de cytotoxische activiteit van de fenanthridine PJ-34 gedocumenteerd door het scannen van vaste en levende menselijke kankercellen (met een hoog voorkomen van extra-centrosomes in mitose) versus normale cellen. Een stapsgewijze beschrijving van de beeldvormende procedures voor de cytotoxische activiteit van PJ-34 in menselijke kankercellen te identificeren is hieronder opgenomen.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen (GIBCO)</td>
			<td>41965</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal bovine Serum)</td>
			<td>Invitrogen (GIBCO)</td>
			<td>12657</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep-Ampho solution</td>
			<td>Biological Industries, Israel</td>
			<td>03-033-1B</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Invitrogen (GIBCO)</td>
			<td>25030-024</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Tripsin-EDTA</td>
			<td>Invitrogen (GIBCO)</td>
			<td>25200</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>92 mm Petri dishes</td>
			<td>Nunc,Thermo scientific</td>
			<td>150350</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm poly-D-lysine coated glass bottom culture dishes</td>
			<td>MatTek Corporation, USA</td>
			<td>P35GC-0-14-C</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminescent ATP detection assay kit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab113849</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NDS (Normal Donkey Serum)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti &alpha;-tubulin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9026</td>
			<td>1:250 dilution (IF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti &gamma;-tubulin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5192</td>
			<td>1:200 dilution (IF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11017</td>
			<td>1:1,000 dilution (IF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-10042</td>
			<td>1:1,000 dilution (IF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade reagent with DAPI (mounting)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36935</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JetPEI (liposomal transfection reagent )</td>
			<td>Polyplus</td>
			<td>101-10</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica (Mannheim, Germany)</td>
			<td>TCS SP5II</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell death associated with abnormal mitosis observed by confocal imaging in live cancer cells

Fenantreen derivaten die als krachtige PARP1 remmers voorkomen de bifocale clustering van boventallige centrosomes in multi-centrosomal menselijke kankercellen in de mitose. De phenanthridine PJ-34 was de meest potente molecule. Ontclustering van extra-centrosomes veroorzaakt mitotische falen en celdood in multi-centrosomal cellen. Meest solide menselijke kankers hebben hoge voorkomen van extra-centrosomes. De activiteit van PJ-34 werd in real-time gedocumenteerd door confocale beeldvorming van levende menselijke borstkanker MDA-MB-231-cellen getransfecteerd met vectoren die coderen voor fluorescente γ-tubuline, dat veel voorkomt in de centrosomes en fluorescerende histone H2b aanwezig de chromosomen. Afwijkende chromosomen regelingen en de-geclusterde γ-tubuline foci die declustered centrosomes werden gedetecteerd in de getransfecteerde MDA-MB-231-cellen na behandeling met PJ-34. Un-geclusterde extra-centrosomes in de twee polen spindel voorafgegaan hun celdood. Deze resultaten gekoppeld for het eerst onlangs ontdekt exclusieve cytotoxische activiteit van PJ-34 in humane kankercellen met extra centrosomes de-clustering in mitose en mitotische storing die tot celdood. Volgens eerdere bevindingen waargenomen door confocale beeldvorming van vaste cellen, PJ-34 uitsluitend uitgeroeid kankercellen met multi-centrosomes zonder afbreuk normale cellen ondergaan mitose met twee centrosomes en bi-focale spindels. Deze cytotoxische activiteit van PJ-34 werd niet gedeeld door andere krachtige PARP1 remmers, en werd waargenomen in PARP1 deficiënte MEF herbergen extracentrosomes, suggereert haar onafhankelijkheid van PARP1 remming. Wonen confocale beeldvorming bood een nuttig instrument voor het identificeren van nieuwe moleculen uitroeien van cellen tijdens mitose.

PJ-34 is een stabiele water oplosbare fenantridine 1 (figuur 1). Onze eerdere resultaten lieten celdood en de-geclusterde extra-centrosomes in verschillende soorten vaste multi-centrosomal kankercellen die behandeld werden met PJ-34. Daarentegen werden de normale delende cellen niet aangetast 2,3. Centrosomes werden geïdentificeerd door dubbele etikettering met antilichamen gericht tegen centrine1 en γ-tubuline in de vaste extra-centrosomal cellen 2. <p class="jove...

Watch this Scientific Journal Video about Cell Death Associated with Abnormal Mitosis Observed by Confocal Imaging in Live Cancer Cells at JoVE.com

Cell Death Associated with Abnormal Mitosis Observed by Confocal Imaging in Live Cancer Cells

De cytotoxische activiteit van de fenanthridine PJ-34 in kankercellen ondergaan mitose werd in real time gedocumenteerd door levende confocale beeldvorming. PJ-34 uitgeroeide menselijke borstkanker MDA-MB-231 cellen die extra-centrosomes in mitose. In tegenstelling tot normale bifocale mitose, werden de extra-centrosomes niet geclusterd in de twee polen spil in aanwezigheid van PJ-34.

Cel dood in verband met abnormale Mitosis Waargenomen door confocale Imaging Live kankercellen

Phenanthrene derivatives acting as potent PARP1 inhibitors prevented the bi-focal clustering of supernumerary centrosomes in multi-centrosomal human ...

Research

JoVE Journal

Medicine

High-Efficiency Transduction of Liver Cancer Cells by Recombinant Adeno-Associated Virus Serotype 3 Vectors

High-Efficiency transductie van leverkanker met behulp van recombinant adeno-geassocieerd virus serotype 3 Vectoren

Recombinant vectors based on a non-pathogenic human parvovirus, the adeno-associated virus 2 (AAV2) have been developed, and are currently in use in a ...

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Ex Vivo Infectie van levend weefsel met oncolytische Virussen

Oncolytic Viruses (OVs) are novel therapeutics that selectively replicate in and kill tumor cells1. Several clinical trials evaluating the effectiveness ...

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Multi-foton Imaging van de tumorcel invasie in een orthotope Muis Model van Oral plaveiselcelcarcinoom

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Evaluation of Cancer Stem Cell Migration Using Compartmentalizing Microfluidic Devices and Live Cell Imaging

Evaluatie van kankerstamcel Migratie Met behulp van compartimentering microfluïdische apparaten en live cell imaging

In the last 40 years, the United States invested over 200 billion dollars on cancer research, resulting in only a 5% decrease in death rate. A major ...

MAME Models for 4D Live-cell Imaging of Tumor: Microenvironment Interactions that Impact Malignant Progression

MAME Modellen voor 4D live-cell imaging van de tumor: micro-omgeving interacties die van invloed zijn Maligne Progression

We have developed 3D coculture models, which we term MAME (mammary architecture and microenvironment engineering), and used them for live-cell imaging in ...

Modeling Colitis-Associated Cancer with Azoxymethane (AOM) and Dextran Sulfate Sodium (DSS)

Modeling Colitis-Associated Cancer with Azoxymethane AOM and Dextran Sulfate Sodium DSS

Modeling Colitis geassocieerde kanker met Azoxymethaan (AOM) en dextransulfaat natrium (DSS)

Individuals with inflammatory bowel disease (IBD), such as Crohn's disease (CD) or ulcerative colitis (UC) are at increased risk of developing colorectal ...

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

Leef Imaging van de Drug antwoorden in de tumor micro-omgeving in muismodellen van Kanker van de Borst

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

A Multiplexed Luciferase-based Screening Platform for Interrogating Cancer-associated Signal Transduction in Cultured Cells

Een Multiplexed Luciferase-gebaseerde screening Platform voor ondervragen Kanker-geassocieerde signaaltransductie in gekweekte cellen

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi)  holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable  ...

Assessing Phagocytic Clearance of Cell Death in Experimental Stroke by Ligatable Fluorescent Probes

Het beoordelen Fagocytische Ontruiming van celdood in Experimental Stroke door ligeerbare fluorescerende probes

We describe a new histochemical approach for visualization of phagocytic clearance in focal brain ischemia. The approach permits the study of elimination ...

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

Profilering van oestrogeen-gereguleerde MicroRNA in borstkankercellen

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...