Name: cell death associated with abnormal mitosis observed by confocal imaging in live cancer cells
Uploaded: 2013-08-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell Death Associated with Abnormal Mitosis Observed by Confocal Imaging in Live Cancer Cells at JoVE.com

Les sources de financement de cette recherche: un fonds commun de la société de l&#39;Université de Tel Aviv de transfert technologique, Ramot et le Centre Sheba-Medical (M. CA et SI)., ICRF - Fondation de la recherche sur le cancer israélien (M. CA.) Et la Fondation israélienne des sciences ( SI).

1. Culture cellulaire Préparation Cellules MDA-MB-231 ont été achetés auprès de l&#39;ATCC (American Type Culture Collection) et stockés dans de l&#39;azote liquide. <ol><li> Seed 10 6 cellules MDA-MB-231 cellules dans 92 mm de diamètre boîte de Pétri dans 10 ml de milieu complet contenant Dulbeco Modified Eagle Medium (DMEM), 10% de sérum de cheval, 1% de L-glutamine et 1% Penstrep-Amphotéricine B. Laisser les cellules à proliférer à environ 80-100% de co...

<ol>
	<li>Jagtap, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+phananthridine+inhibitors+of+poly(adenosine+5'-diphosphate-ribose)+synthetase:+Potent+cytoprotective+and+antishock+agents.">Novel phananthridine inhibitors of poly(adenosine 5'-diphosphate-ribose) synthetase: Potent cytoprotective and antishock agents.</a> Crit. Care Med. 30, 1071-1082 (2002).</li><li>Castiel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+molecule+exclusively+eradicates+human+cancer+cells:+Extra-centrosomes+de-clustering+agent.">A small molecule exclusively eradicates human cancer cells: Extra-centrosomes de-clustering agent.</a> BMC Cancer. 11 (1), 412 (2011).</li><li>Inbar-Rozensal, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+selective+eradication+of+human+nonhereditary+breast+cancer+cells+by+phenanthridine+-derived+polyADP-ribose+polymerase+inhibitors.">A selective eradication of human nonhereditary breast cancer cells by phenanthridine -derived polyADP-ribose polymerase inhibitors.</a> Breast Cancer Res. 11 (6), R78 (2009).</li><li>Gergely, F., Basto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+centrosomes:+together+they+stand,+divided+they+fall.">Multiple centrosomes: together they stand, divided they fall.</a> Genes Dev. 22, 2291-2296 (2008).</li><li>Godinho, S. A., Kwon, M., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosomes+and+cancer:+how+cancer+cells+divide+with+too+many+centrosomes.">Centrosomes and cancer: how cancer cells divide with too many centrosomes.</a> Canc. Met. Rev. 28, 85-98 (2009).</li><li>Doxsey, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-evaluating+centrosome+function.">Re-evaluating centrosome function.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 688-698 (2001).</li><li>Walczak, C. E., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+mitotic+spindle+assembly+and+function.">Mechanisms of mitotic spindle assembly and function.</a> International Rev. of Cytology. 265, 111-158 (2008).</li><li>Ogden, A., Rida, P. C. G., Aneja, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Let's+huddle+to+prevent+a+muddle:+centrosome+declustering+as+an+attractive+anticancer+strategy.">Let's huddle to prevent a muddle: centrosome declustering as an attractive anticancer strategy.</a> Cell Death Differ. 19, 1255-1267 (2012).</li><li>Kramer, A., Anderhub, S., Maier, B., Schatten, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+Consequences+of+centrosomes+clustering+in+cancer+cells.">Mechanisms and Consequences of centrosomes clustering in cancer cells.</a> The Centrosome: Cell and Molecular mechanisms of functions and disfunctions in disease. , 255-277 (2012).</li><li>Galimberti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaphase+Catastrophe+Is+a+Target+for+Cancer+Therapy.">Anaphase Catastrophe Is a Target for Cancer Therapy.</a> Clin. Cancer Res. 17, 1218-1222 (2011).</li><li>Kanai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haploinsufficiency+of+poly(ADP-ribose)+polymerase-1-mediated+poly(ADP-ribosyl)ation+for+centrosome+duplication.">Haploinsufficiency of poly(ADP-ribose) polymerase-1-mediated poly(ADP-ribosyl)ation for centrosome duplication.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 359, 426-430 (2007).</li><li>Gartner, E. M., Burger, A. M., Lorusso, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(ADP-ribose)+polymerase+inhibitors:+a+novel+drug+class+with+a+promising+future.">Poly(ADP-ribose) polymerase inhibitors: a novel drug class with a promising future.</a> Cancer J. 16, 83-90 (2010).</li><li>Wahlberg, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Family-wide+chemical+profiling+and+structural+analysis+of+PARP+and+tankyrase+inhibitors.">Family-wide chemical profiling and structural analysis of PARP and tankyrase inhibitors.</a> Nature Biotechnology. 30, 283-288 (2012).</li><li>Rouleau, M., Patel, A., Hendze, M. J., Kaufmann, S. H., Poirier, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP+inhibition:+PARP1+and+beyond.">PARP inhibition: PARP1 and beyond.</a> Nature Rev. Cancer. 10, 293-301 (2010).</li><li>Leber, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteins+Required+for+Centrosome+Clustering+in+Cancer+Cells.">Proteins Required for Centrosome Clustering in Cancer Cells.</a> Sci. Transl. Med. 2 (33), 33-38 (2010).</li><li>Kwon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+to+suppress+multipolar+division+in+cancer+cells+with+extra+centrosomes.">Mechanisms to suppress multipolar division in cancer cells with extra centrosomes.</a> Gene Dev. 22, 2189-2203 (2008).</li></ol>

Vivez l&#39;imagerie confocale a fourni une documentation en temps réel de l&#39;effet cytotoxique de PJ-34 dans les cellules multi-centrosomales en direct pendant la mitose (Figure 3 et les informations supplémentaires). Ce fut la première documentation en direct attribuant la cytotoxicité de PJ-34 dans les cellules humaines de cancer de centrosomes supplémentaires de-regroupement et la mort cellulaire, suggérant l&#39;induction de la mort cellulaire de la catastrophe mitotique par PJ-34 5-9...

Phénanthrène dérivé PARP1 inhibiteurs, y compris PJ-34, ont été conçus pour protéger les cellules au repos de la mort cellulaire par apoptose induite par le consommateur d&#39;énergie PARP1 médiation réparation de l&#39;ADN dans des conditions de stress (accident vasculaire cérébral ou infarctus du myocarde) 1. Toutefois, récemment, nous avons découvert que PJ-34, à une concentration deux fois plus élevée que celle induisant PARP1 inhibition, peut exclusivement provoquer la mort cellulaire dans les cellules cancéreuses humaines 2,3. Le plus rapide de la prolifération de la cellule était, le plus efficace à l&#39;éradication des cellules était. L&#39;activité cytotoxique de PJ-34 a été attribuée à des extra-centrosomes de-regroupement dans la mitose 2. Beaucoup humain cellules cancéreuses port multicentrosomes 4,5. L&#39;incubation des cellules cancéreuses du sein humain MDA-MB-231, qui abritent centrosomes surnuméraires, avec 20 uM PJ-34 éradiquée efficacement ces cellules au sein de 72-96 heures sans altérer les cellules au repos ou certaines cellules proliférantes bénignes abriter deux centrosomes dans la mitose <sup&gt; 2,3. Cellules bénignes inclus cellules épithéliales mammaires humaines MCF-10, les cellules endothéliales humaines (HUVEC) et des cellules mésenchymateuses primaires préparées à partir de thymus humain. Ces cellules étaient résistantes à l&#39;activité cytotoxique de PJ-34. PJ-34 n&#39;interfère pas avec leur cycle cellulaire pendant 96 heures d&#39;incubation ou d&#39;affecter leur centrosomes et la formation du fuseau bi-focale 2,3. Assemblée centrosome bipolaire est cruciale pour la formation du fuseau bipolaire dans la mitose 4,5. Par conséquent, les cellules avec plus de deux centrosomes ont mis au point un mécanisme moléculaire à peine compris, le regroupement de leurs centrosomes supplémentaires à deux pôles 4-9. Le défaut de montage bipolaire de leurs centrosomes peut causer multipolaire déformée broches et aberrant chromosomes ségrégation qui arrête le cycle cellulaire en G2 / M arrestation et conduit à la mort cellulaire attribuées à l&#39;échec de la mitose 4,5. Les mécanismes moléculaires sous-jacents à des extra-centrosomes de-clusters sont intensivement étudiées &lt;sup&gt; 10. La compréhension de ce mécanisme de mort permettra l&#39;éradication exclusive des cellules cancéreuses tout en épargnant les tissus sains 5,10. Ainsi, les composés qui activent la mort des cellules catastrophe mitotique offrent un nouveau mode de traitement du cancer sélectif, qui peut être efficace dans un large éventail de résultats de cancers.Our solides humaines suggèrent que l&#39;imagerie confocale peut être utilisé pour identifier les molécules qui affectent extra-centrosomes regroupement en mitose 2,3, ce qui rend ces composés ciblant le cancer des candidats-médicaments. Nous avons documenté l&#39;activité cytotoxique de l&#39;phénanthridiniques PJ-34 par les cellules cancéreuses humaines fixe et direct (avec une forte présence d&#39;extra-centrosomes dans la mitose) par rapport aux cellules normales de numérisation. Une étape par étape description des procédures d&#39;imagerie utilisées pour identifier l&#39;activité cytotoxique de PJ-34 dans les cellules cancéreuses humaines est inclus ci-dessous.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen (GIBCO)</td>
			<td>41965</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal bovine Serum)</td>
			<td>Invitrogen (GIBCO)</td>
			<td>12657</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep-Ampho solution</td>
			<td>Biological Industries, Israel</td>
			<td>03-033-1B</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Invitrogen (GIBCO)</td>
			<td>25030-024</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Tripsin-EDTA</td>
			<td>Invitrogen (GIBCO)</td>
			<td>25200</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>92 mm Petri dishes</td>
			<td>Nunc,Thermo scientific</td>
			<td>150350</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm poly-D-lysine coated glass bottom culture dishes</td>
			<td>MatTek Corporation, USA</td>
			<td>P35GC-0-14-C</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminescent ATP detection assay kit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab113849</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NDS (Normal Donkey Serum)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti &alpha;-tubulin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9026</td>
			<td>1:250 dilution (IF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti &gamma;-tubulin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5192</td>
			<td>1:200 dilution (IF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11017</td>
			<td>1:1,000 dilution (IF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-10042</td>
			<td>1:1,000 dilution (IF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade reagent with DAPI (mounting)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36935</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JetPEI (liposomal transfection reagent )</td>
			<td>Polyplus</td>
			<td>101-10</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica (Mannheim, Germany)</td>
			<td>TCS SP5II</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell death associated with abnormal mitosis observed by confocal imaging in live cancer cells

Dérivés de phénanthrène agissant comme inhibiteurs puissants PARP1 empêché le regroupement bi-focal de centrosomes surnuméraires dans les cellules cancéreuses humaines multi-centrosomales en mitose. Le phénanthridiniques PJ-34 est la molécule la plus puissante. Declustering d&#39;extra-centrosomes provoque l&#39;échec de la mitose et la mort cellulaire dans les cellules multi-centrosomales. Cancers humains les plus solides ont une forte présence des extra-centrosomes. L&#39;activité de PJ-34 a été documentée en temps réel par imagerie confocale de cancer du sein humain vivant des cellules MDA-MB-231 transfectées avec des vecteurs codant pour fluorescent γ-tubuline, ce qui est très abondant dans les centrosomes et fluorescent histone H2B présent dans les chromosomes. Arrangements de chromosomes aberrants et de cluster-foyers γ-tubuline représentant centrosomes declustered ont été détectés dans les cellules transfectées MDA-MB-231 après le traitement avec PJ-34. Un-cluster-centrosomes supplémentaire dans les deux pôles du fuseau précédé leur mort cellulaire. Ces résultats liés for la première fois l&#39;activité cytotoxique exclusive récemment détecté de PJ-34 dans les cellules cancéreuses humaines avec des extra-centrosomes de-regroupement dans la mitose, et l&#39;échec de la mitose conduisant à la mort cellulaire. Selon les résultats précédents observés par imagerie confocale de cellules fixes, PJ-34 cellules cancéreuses exclusivement éradiqué avec Multi-centrosomes sans altérer les cellules normales en mitose avec deux centrosomes et les broches bi-focal. Cette activité cytotoxique de PJ-34 n&#39;a pas été partagée par d&#39;autres PARP1 inhibiteurs puissants, et a été observée dans PARP1 déficientes MEF extracentrosomes hébergeant, suggérant son indépendance de PARP1 inhibition. Vivez l&#39;imagerie confocale offre un outil utile pour identifier de nouvelles molécules éradiquer les cellules en mitose.

PJ-34 est un stable soluble dans l&#39;eau phénanthridiniques 1 (figure 1). Nos résultats précédents ont révélé la mort cellulaire et de-regroupés extra-centrosomes dans plusieurs types de cellules cancéreuses multi-centrosomales fixes qui ont été traités avec PJ-34. En revanche, les cellules proliférantes normales n&#39;ont pas été altérées 2,3. Centrosomes ont été identifiés par un double marquage avec des anticorps dirigés contre centrine1 et γ-tubuline dan...

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Cell Death Associated with Abnormal Mitosis Observed by Confocal Imaging in Live Cancer Cells

L&#39;activité cytotoxique de l&#39;phénanthridiniques PJ-34 dans les cellules cancéreuses en mitose a été documentée en temps réel par imagerie confocale en direct. 34-PJ cancer du sein humain éradiqué MDA-MB-231 cellules hébergeant des extra-centrosomes dans la mitose. Contrairement à la mitose bifocal normale, les extra-centrosomes sont regroupés dans les deux pôles du fuseau, en présence d&#39;PJ-34.

La mort cellulaire associée à la mitose anormale constatée par imagerie confocale dans des cellules vivantes du cancer

Phenanthrene derivatives acting as potent PARP1 inhibitors prevented the bi-focal clustering of supernumerary centrosomes in multi-centrosomal human ...

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