Name: cell death associated with abnormal mitosis observed by confocal imaging in live cancer cells
Uploaded: 2013-08-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell Death Associated with Abnormal Mitosis Observed by Confocal Imaging in Live Cancer Cells at JoVE.com

מקורות מימון של מחקר זה: קרן משותפת של החברה באוניברסיטת תל אביב העברת טכנולוגיה, רמות ומרכז הרפואי שיבא, (מ &#39;ע&quot;א וע&quot;כ.), ICRF - ישראלי לחקר סרטן בבסיס (מ&#39; ע&quot;א.) וקרן לאומית למדע ( SI).

1. הכנת תרבית תאים מד&quot;א-MB-231 תאים נרכשו מATCC (אוסף תרבות סוג אמריקאי) ומאוחסנים בחנקן נוזלי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעי 10 6 מד&quot;א-MB-231 תאים בצלחת פטרי בקוטר 92 מ&quot;מ ב10 מ&quot;ל המכילים בינונית מלא...

<ol>
	<li>Jagtap, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+phananthridine+inhibitors+of+poly(adenosine+5'-diphosphate-ribose)+synthetase:+Potent+cytoprotective+and+antishock+agents.">Novel phananthridine inhibitors of poly(adenosine 5'-diphosphate-ribose) synthetase: Potent cytoprotective and antishock agents.</a> Crit. Care Med. 30, 1071-1082 (2002).</li><li>Castiel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+molecule+exclusively+eradicates+human+cancer+cells:+Extra-centrosomes+de-clustering+agent.">A small molecule exclusively eradicates human cancer cells: Extra-centrosomes de-clustering agent.</a> BMC Cancer. 11 (1), 412 (2011).</li><li>Inbar-Rozensal, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+selective+eradication+of+human+nonhereditary+breast+cancer+cells+by+phenanthridine+-derived+polyADP-ribose+polymerase+inhibitors.">A selective eradication of human nonhereditary breast cancer cells by phenanthridine -derived polyADP-ribose polymerase inhibitors.</a> Breast Cancer Res. 11 (6), R78 (2009).</li><li>Gergely, F., Basto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+centrosomes:+together+they+stand,+divided+they+fall.">Multiple centrosomes: together they stand, divided they fall.</a> Genes Dev. 22, 2291-2296 (2008).</li><li>Godinho, S. A., Kwon, M., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosomes+and+cancer:+how+cancer+cells+divide+with+too+many+centrosomes.">Centrosomes and cancer: how cancer cells divide with too many centrosomes.</a> Canc. Met. Rev. 28, 85-98 (2009).</li><li>Doxsey, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-evaluating+centrosome+function.">Re-evaluating centrosome function.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 688-698 (2001).</li><li>Walczak, C. E., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+mitotic+spindle+assembly+and+function.">Mechanisms of mitotic spindle assembly and function.</a> International Rev. of Cytology. 265, 111-158 (2008).</li><li>Ogden, A., Rida, P. C. G., Aneja, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Let's+huddle+to+prevent+a+muddle:+centrosome+declustering+as+an+attractive+anticancer+strategy.">Let's huddle to prevent a muddle: centrosome declustering as an attractive anticancer strategy.</a> Cell Death Differ. 19, 1255-1267 (2012).</li><li>Kramer, A., Anderhub, S., Maier, B., Schatten, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+Consequences+of+centrosomes+clustering+in+cancer+cells.">Mechanisms and Consequences of centrosomes clustering in cancer cells.</a> The Centrosome: Cell and Molecular mechanisms of functions and disfunctions in disease. , 255-277 (2012).</li><li>Galimberti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaphase+Catastrophe+Is+a+Target+for+Cancer+Therapy.">Anaphase Catastrophe Is a Target for Cancer Therapy.</a> Clin. Cancer Res. 17, 1218-1222 (2011).</li><li>Kanai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haploinsufficiency+of+poly(ADP-ribose)+polymerase-1-mediated+poly(ADP-ribosyl)ation+for+centrosome+duplication.">Haploinsufficiency of poly(ADP-ribose) polymerase-1-mediated poly(ADP-ribosyl)ation for centrosome duplication.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 359, 426-430 (2007).</li><li>Gartner, E. M., Burger, A. M., Lorusso, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(ADP-ribose)+polymerase+inhibitors:+a+novel+drug+class+with+a+promising+future.">Poly(ADP-ribose) polymerase inhibitors: a novel drug class with a promising future.</a> Cancer J. 16, 83-90 (2010).</li><li>Wahlberg, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Family-wide+chemical+profiling+and+structural+analysis+of+PARP+and+tankyrase+inhibitors.">Family-wide chemical profiling and structural analysis of PARP and tankyrase inhibitors.</a> Nature Biotechnology. 30, 283-288 (2012).</li><li>Rouleau, M., Patel, A., Hendze, M. J., Kaufmann, S. H., Poirier, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP+inhibition:+PARP1+and+beyond.">PARP inhibition: PARP1 and beyond.</a> Nature Rev. Cancer. 10, 293-301 (2010).</li><li>Leber, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteins+Required+for+Centrosome+Clustering+in+Cancer+Cells.">Proteins Required for Centrosome Clustering in Cancer Cells.</a> Sci. Transl. Med. 2 (33), 33-38 (2010).</li><li>Kwon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+to+suppress+multipolar+division+in+cancer+cells+with+extra+centrosomes.">Mechanisms to suppress multipolar division in cancer cells with extra centrosomes.</a> Gene Dev. 22, 2189-2203 (2008).</li></ol>

לחיות ההדמיה confocal סיפק תיעוד בזמן אמת של האפקט הרעיל לתאים של PJ-34 בתאים מרובים centrosomal חיה במהלך מיטוזה (איור 3 ומידע משלים). זה היה התיעוד החי הראשון מייחס cytotoxicity של PJ-34 בתאים סרטניים אנושיים לcentrosomes נוסף דה אשכולות ומוות של תאים, דבר המצביע אינדוקציה של מוות של...

Phenanthrene נגזר PARP1 מעכבים, כולל PJ-34, שנועד להגן על תאים שקטים ממוות של תאים אפופטוטיים הנגרמים על ידי אנרגיה רב PARP1 תיווך-DNA תיקון תחת תנאי לחץ (אוטם שריר הלב או שבץ מוחי) 1. עם זאת, לאחרונה גילה שPJ-34, בריכוז גבוה פי שתיים מזה ישכנע עיכוב PARP1, ניתן אך ורק לגרום למוות של תאים בתאים סרטניים אנושיים 2,3. המהירה יותר ההתפשטות של התא הייתה, יעיל יותר למיגור התאים היה. הפעילות ציטוטוקסית של PJ-34 יוחסה לExtra-centrosomes דה אשכולות במיטוזה 2. רבים נמל תאי סרטן אנושי multicentrosomes 4,5. דגירה של תאים אנושיים של סרטן שד מד&quot;א-MB-231, אשר נמל centrosomes העודפים, עם 20 מיקרומטר PJ-34 יעילות להכחיד את התאים האלה בתוך 72-96 שעות מבלי לפגוע בתאים שקטים או כמה תאים מתרבים פירים מחסה שני centrosomes במיטוזה <sup&gt; 2,3. תאים שפירים כללו תאים אנושיים אפיתל החלב MCF-10, תאי אנדותל אנושיים (HUVEC) ותאי mesenchymal ראשוניים שהוכנו מבלוטת התימוס אנושית. תאים אלה היו עמידים לפעילות ציטוטוקסית של PJ-34. PJ-34 לא התערבו במחזור התא שלהם במהלך הדגירה 96 שעות או להשפיע על היווצרות ציר דו מוקדי 2,3 centrosomes ושלהם. ההרכבה centrosome דו קוטבית היא קריטית להיווצרות ציר דו קוטבי במיטוזה 4,5. לכן, תאים עם יותר משני centrosomes פיתחו מנגנון מולקולרי הבין בקושי, אשכולות centrosomes נוסף שלהם בשני קטבים 4-9. כישלון של הרכבה דו קוטבית של centrosomes עלול לגרום להפרדת צירים וחריגים כרומוזומים קוטביים מעוותת שמעצרי מחזור התא במעצר G2 / M, ומוביל למוות של תאים המיוחס לכישלון mitotic 4,5. המנגנונים המולקולריים שבבסיס Extra-centrosomes דה אשכולות נחקרים באינטנסיביות &lt;sup&gt; 10. הבנת מנגנון המוות הזה תאפשר מיגור בלעדי של תאים סרטניים תוך חוסך 5,10 רקמות בריאות. לכן, תרכובות המפעילות מות תאי קטסטרופה mitotic מציעות מצב חדש של טיפול בסרטן סלקטיבית, שעשויה להיות יעילה במגוון רחב של תוצאות cancers.Our מוצקות אדם מראה כי הדמיה confocal יכולה לשמש כדי לזהות מולקולות המשפיעות על אשכולות במיוחד בcentrosomes 2,3 מיטוזה, עיבוד תרכובות סרטן אלה מיקוד לתרופות. אנחנו תעדו את הפעילות ציטוטוקסית של phenanthridine PJ-34 על ידי סריקת תאים קבועים ולחיות עם אדם סרטן (שכיחות גבוהה של Extra-centrosomes במיטוזה) לעומת תאים נורמלים. צעד אחר צעד התיאור של נהלי ההדמיה המשמשים לזיהוי הפעילות ציטוטוקסית של PJ-34 בתאים סרטניים אנושיים כלול להלן.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen (GIBCO)</td>
			<td>41965</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal bovine Serum)</td>
			<td>Invitrogen (GIBCO)</td>
			<td>12657</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep-Ampho solution</td>
			<td>Biological Industries, Israel</td>
			<td>03-033-1B</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Invitrogen (GIBCO)</td>
			<td>25030-024</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Tripsin-EDTA</td>
			<td>Invitrogen (GIBCO)</td>
			<td>25200</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>92 mm Petri dishes</td>
			<td>Nunc,Thermo scientific</td>
			<td>150350</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm poly-D-lysine coated glass bottom culture dishes</td>
			<td>MatTek Corporation, USA</td>
			<td>P35GC-0-14-C</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminescent ATP detection assay kit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab113849</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NDS (Normal Donkey Serum)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti &alpha;-tubulin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9026</td>
			<td>1:250 dilution (IF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti &gamma;-tubulin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5192</td>
			<td>1:200 dilution (IF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11017</td>
			<td>1:1,000 dilution (IF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-10042</td>
			<td>1:1,000 dilution (IF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade reagent with DAPI (mounting)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36935</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JetPEI (liposomal transfection reagent )</td>
			<td>Polyplus</td>
			<td>101-10</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica (Mannheim, Germany)</td>
			<td>TCS SP5II</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell death associated with abnormal mitosis observed by confocal imaging in live cancer cells

נגזרי Phenanthrene מתנהגים כמו PARP1 מעכבים חזקים מנעו אשכולות דו מוקדי של centrosomes העודפים בתאים סרטניים אנושיים רב centrosomal במיטוזה. Phenanthridine PJ-34 הייתה המולקולה חזקה ביותר. Declustering של Extra-centrosomes גורם לכישלון mitotic ומוות של תאים בתאים מרובים centrosomal. יש לי הסרטן אנושי מוצק ביותר שכיחות גבוהה של Extra-centrosomes. הפעילות של PJ-34 תועדה בזמן אמת על ידי ההדמיה confocal של סרטן השד אנושי Live-231-MB מד&quot;א תאי transfected עם וקטורי קידוד עבור γ-טובולין הניאון, שהוא נרחב ביותר בcentrosomes ולניאון הווה H2B ביסטון את הכרומוזומים. הסדרי כרומוזומים חריגים וביטול התקבצו מוקדי γ-טובולין המייצגים centrosomes declustered התגלו במד&quot;א-MB-231 תאי transfected לאחר טיפול עם PJ-34. Un-התקבץ מחוץ לcentrosomes בשני קטבי הכישור קדמו המוות של התאים שלהם. תוצאות אלו מקושרות עבורR בפעם הראשונה את הפעילות ציטוטוקסית הבלעדית זוהתה לאחרונה של PJ-34 בתאים סרטניים אנושיים עם Extra-centrosomes דה אשכולות במיטוזה, וכישלון mitotic מוביל למוות של תאים. על פי ממצאים קודמים שנצפו על ידי ההדמיה confocal של תאים קבועים, PJ-34 תאים סרטניים להכחיד באופן בלעדי עם Multi-centrosomes מבלי לפגוע בתאים נורמלים עוברים מיטוזה עם שני centrosomes וכישורים דו מוקדי. פעילות ציטוטוקסית זה של PJ-34 לא הייתה שותפים PARP1 מעכבי עוצמה אחרים, ונצפתה בPARP1 extracentrosomes מחסה MEF לקוי, דבר המצביעה העצמאות של PARP1 עיכוב שלה. לחיות הדמיה confocal הציע כלי שימושי לזיהוי מולקולות חדשות להשמיד את התאים במהלך מיטוזה.

PJ-34 הוא מים יציבים מסיס 1 phenanthridine (איור 1). התוצאות הקודמות שלנו גילו מוות של תאים ודה התקבצו מחוץ לcentrosomes במספר סוגים של תאי סרטן רב centrosomal הקבועים שטופלו בPJ-34. לעומת זאת, תאים מתרבים נורמלים לא היו נפגעים 2,3. Centrosomes זוהה על ידי תיוג כפול עם נוגדנים המ?...

Watch this Scientific Journal Video about Cell Death Associated with Abnormal Mitosis Observed by Confocal Imaging in Live Cancer Cells at JoVE.com

Cell Death Associated with Abnormal Mitosis Observed by Confocal Imaging in Live Cancer Cells

הפעילות ציטוטוקסית של phenanthridine PJ-34 בתאים סרטניים שעברו מיטוזה תועדה בזמן אמת על ידי ההדמיה confocal חי. סרטן PJ-34 להכחיד אנושי שד מד&quot;א-MB-231 תאי מחסה Extra-centrosomes במיטוזה. בניגוד למיטוזה דו מוקדי רגילים, את centrosomes במיוחד לא התקבצו בשני קטבי הכישור בנוכחות של PJ-34.

מוות של תאים הקשורים מיטוזה חריגה נצפה על ידי ההדמיה Confocal בתאי סרטן חיים

Phenanthrene derivatives acting as potent PARP1 inhibitors prevented the bi-focal clustering of supernumerary centrosomes in multi-centrosomal human ...

Research

JoVE Journal

Medicine

High-Efficiency Transduction of Liver Cancer Cells by Recombinant Adeno-Associated Virus Serotype 3 Vectors

יעילות גבוהה התמרה של תאים סרטניים בכבד על ידי סרוטיפ Adeno-Associated וירוס רקומביננטי 3 וקטורים

Recombinant vectors based on a non-pathogenic human parvovirus, the adeno-associated virus 2 (AAV2) have been developed, and are currently in use in a ...

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Ex Vivo זיהום של רקמה חיה עם וירוסים oncolytic

Oncolytic Viruses (OVs) are novel therapeutics that selectively replicate in and kill tumor cells1. Several clinical trials evaluating the effectiveness ...

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Multi-פוטון הדמיה של הפלישה תאים סרטניים במודל עכבר orthotopic של קרצינומה של תאים קשקשיים אוראלי

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Evaluation of Cancer Stem Cell Migration Using Compartmentalizing Microfluidic Devices and Live Cell Imaging

הערכה של נדידת תאי גזע סרטני באמצעות מכשירי microfluidic מידור והדמית תא חייה

In the last 40 years, the United States invested over 200 billion dollars on cancer research, resulting in only a 5% decrease in death rate. A major ...

MAME Models for 4D Live-cell Imaging of Tumor: Microenvironment Interactions that Impact Malignant Progression

מיים מודלים של הדמיה חיה של תאים 4D גידול: אינטראקציות microenvironment המשפיעים ממאירה התקדמות

We have developed 3D coculture models, which we term MAME (mammary architecture and microenvironment engineering), and used them for live-cell imaging in ...

Modeling Colitis-Associated Cancer with Azoxymethane (AOM) and Dextran Sulfate Sodium (DSS)

Modeling Colitis-Associated Cancer with Azoxymethane AOM and Dextran Sulfate Sodium DSS

דוגמנות סרטן קוליטיס-Associated עם Azoxymethane (AOM) ונתרן סולפט dextran (DSS)

Individuals with inflammatory bowel disease (IBD), such as Crohn's disease (CD) or ulcerative colitis (UC) are at increased risk of developing colorectal ...

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

חי הדמיה של תגובות סמים בmicroenvironment הגידול במודלים עכבריים של סרטן השד

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

A Multiplexed Luciferase-based Screening Platform for Interrogating Cancer-associated Signal Transduction in Cultured Cells

פלטפורמת הקרנה מבוססת לוציפראז Multiplexed לחקירת מלחמה בסרטן הקשורים להעברת אותות בתאים בתרבית

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi)  holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable  ...

Assessing Phagocytic Clearance of Cell Death in Experimental Stroke by Ligatable Fluorescent Probes

הערכת עמילות phagocytic של מוות של תאים בשבץ ניסויי על ידי בדיקות ניאון Ligatable

We describe a new histochemical approach for visualization of phagocytic clearance in focal brain ischemia. The approach permits the study of elimination ...

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

פרופיל של מיקרו RNA המוסדר אסטרוגן בתאי סרטן השד

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...