Name: cell death associated with abnormal mitosis observed by confocal imaging in live cancer cells
Uploaded: 2013-08-21T13:00:00
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本研究の資金源：テルアビブ大学の技術移転会社、运动とシェバ·メディカルセンター（M. CA及びSI）、ICRFの共同ファンド - イスラエルのがん研究財団（M. CA。）とイスラエル科学財団（ SI）。

1。細胞培養の準備 MDA-MB-231細胞は、ATCC（ アメリカン·タイプ·カルチャー·コレクション ）から購入し、液体窒素中で保存した。 <ol><li>シード10 6 MDA-MB-231 Dulbeco改変イーグル培地（DMEM）、血清、1％L-グルタミン、及び1％Penstrep-アンホテリシンBのセルを許可し、10％の馬を含む10ミリリットル完全培地で92ミリメートル径シャーレ内の細胞約80-100％コンフ?...

<ol>
	<li>Jagtap, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+phananthridine+inhibitors+of+poly(adenosine+5'-diphosphate-ribose)+synthetase:+Potent+cytoprotective+and+antishock+agents.">Novel phananthridine inhibitors of poly(adenosine 5'-diphosphate-ribose) synthetase: Potent cytoprotective and antishock agents.</a> Crit. Care Med. 30, 1071-1082 (2002).</li><li>Castiel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+molecule+exclusively+eradicates+human+cancer+cells:+Extra-centrosomes+de-clustering+agent.">A small molecule exclusively eradicates human cancer cells: Extra-centrosomes de-clustering agent.</a> BMC Cancer. 11 (1), 412 (2011).</li><li>Inbar-Rozensal, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+selective+eradication+of+human+nonhereditary+breast+cancer+cells+by+phenanthridine+-derived+polyADP-ribose+polymerase+inhibitors.">A selective eradication of human nonhereditary breast cancer cells by phenanthridine -derived polyADP-ribose polymerase inhibitors.</a> Breast Cancer Res. 11 (6), R78 (2009).</li><li>Gergely, F., Basto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+centrosomes:+together+they+stand,+divided+they+fall.">Multiple centrosomes: together they stand, divided they fall.</a> Genes Dev. 22, 2291-2296 (2008).</li><li>Godinho, S. A., Kwon, M., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosomes+and+cancer:+how+cancer+cells+divide+with+too+many+centrosomes.">Centrosomes and cancer: how cancer cells divide with too many centrosomes.</a> Canc. Met. Rev. 28, 85-98 (2009).</li><li>Doxsey, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-evaluating+centrosome+function.">Re-evaluating centrosome function.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 688-698 (2001).</li><li>Walczak, C. E., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+mitotic+spindle+assembly+and+function.">Mechanisms of mitotic spindle assembly and function.</a> International Rev. of Cytology. 265, 111-158 (2008).</li><li>Ogden, A., Rida, P. C. G., Aneja, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Let's+huddle+to+prevent+a+muddle:+centrosome+declustering+as+an+attractive+anticancer+strategy.">Let's huddle to prevent a muddle: centrosome declustering as an attractive anticancer strategy.</a> Cell Death Differ. 19, 1255-1267 (2012).</li><li>Kramer, A., Anderhub, S., Maier, B., Schatten, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+Consequences+of+centrosomes+clustering+in+cancer+cells.">Mechanisms and Consequences of centrosomes clustering in cancer cells.</a> The Centrosome: Cell and Molecular mechanisms of functions and disfunctions in disease. , 255-277 (2012).</li><li>Galimberti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaphase+Catastrophe+Is+a+Target+for+Cancer+Therapy.">Anaphase Catastrophe Is a Target for Cancer Therapy.</a> Clin. Cancer Res. 17, 1218-1222 (2011).</li><li>Kanai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haploinsufficiency+of+poly(ADP-ribose)+polymerase-1-mediated+poly(ADP-ribosyl)ation+for+centrosome+duplication.">Haploinsufficiency of poly(ADP-ribose) polymerase-1-mediated poly(ADP-ribosyl)ation for centrosome duplication.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 359, 426-430 (2007).</li><li>Gartner, E. M., Burger, A. M., Lorusso, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(ADP-ribose)+polymerase+inhibitors:+a+novel+drug+class+with+a+promising+future.">Poly(ADP-ribose) polymerase inhibitors: a novel drug class with a promising future.</a> Cancer J. 16, 83-90 (2010).</li><li>Wahlberg, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Family-wide+chemical+profiling+and+structural+analysis+of+PARP+and+tankyrase+inhibitors.">Family-wide chemical profiling and structural analysis of PARP and tankyrase inhibitors.</a> Nature Biotechnology. 30, 283-288 (2012).</li><li>Rouleau, M., Patel, A., Hendze, M. J., Kaufmann, S. H., Poirier, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP+inhibition:+PARP1+and+beyond.">PARP inhibition: PARP1 and beyond.</a> Nature Rev. Cancer. 10, 293-301 (2010).</li><li>Leber, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteins+Required+for+Centrosome+Clustering+in+Cancer+Cells.">Proteins Required for Centrosome Clustering in Cancer Cells.</a> Sci. Transl. Med. 2 (33), 33-38 (2010).</li><li>Kwon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+to+suppress+multipolar+division+in+cancer+cells+with+extra+centrosomes.">Mechanisms to suppress multipolar division in cancer cells with extra centrosomes.</a> Gene Dev. 22, 2189-2203 (2008).</li></ol>

ライブ共焦点イメージングは、有糸分裂（ 図3と補足情報）の間にライブマルチ中心体細胞ではPJ-34の細胞毒性効果をリアルタイムに資料を提供した。これは、PJ-34 5-9で細胞分裂異常細胞死の誘導を示唆し、余分な中心体デクラスタリングと細胞死にヒト癌細胞におけるPJ-34の細胞毒性を帰初のライブドキュメントだった。対照的に、超正規の中心体の双方向の焦点クラス...

PJ-34を含むフェナントレン由来PARP1阻害剤は、ストレス条件下でのエネルギ消費PARP1媒介DNA修復（脳卒中または心筋梗塞）1によって誘導されるアポトーシス細胞死からの静止細胞を保護するように設計された。しかし、最近我々はPJ-34のことを発見し、その誘導PARP1阻害よりも倍高い濃度で、独占的にヒト癌細胞2,3における細胞死を引き起こす可能性があります。細胞の増殖であったより迅速に、細胞をより効率的に根絶であった。 PJ-34の細胞傷害活性は、有糸分裂2余分中心体デクラスタリングに起因するものであった。多くのヒト癌細胞の港4,5 multicentrosomes。静止細胞を損なうか、またはいくつかの良性の増殖細胞が有糸分裂で2中心体を保有することなく、20μMPJ-34と港過剰中心体は、効率的に72〜96時間以内にこれらの細胞を根絶ヒト乳癌細胞MDA-MB-231、のインキュベーション<suP&gt; 2,3。良性細胞は、ヒト胸腺から調製されたMCF-10ヒト乳腺上皮細胞、ヒト内皮細胞（HUVEC）とプライマリ間葉細胞を含んでいた。これらの細胞は、PJ-34の細胞傷害活性に耐性であった。 PJ-34は、96時間のインキュベーションの間に彼らの細胞周期に干渉したり、中心体と双方向の焦点紡錘体形成2,3に影響を及ぼさなかった。 バイポーラ中心体アセンブリは、有糸分裂4,5における双極紡錘体形成のために重要です。したがって、以上の2中心体を持つ細胞は、2つの極4-9で彼らの余分中心体をクラスタリング、ほとんど理解していない分子機構を開発しました。彼らの中心体の双極アセンブリの失敗は逮捕はG2 / Mの逮捕で、細胞周期、細胞死に至るが4,5分裂の失敗に起因することが多歪んスピンドルと異常な染色体の分離を引き起こす可能性があります。余分中心体デクラスタリングの基礎となる分子メカニズムは集中的に調査している&lt;&gt; 10（商標）。健康な組織の5,10を温存しながら、この死のメカニズムを理解することは、癌細胞の排他的な根絶が可能になります。 従って、細胞分裂異常細胞死を活性化する化合物は、共焦点画像は、超中心体のクラスタリングに影響する分子を同定するために使用することができることを示唆しているヒト固形cancers.Our結果の広い範囲で効率的であり得る選択的癌療法の新たなモードを提供有糸分裂2,3、薬剤候補をターゲットに、これらの化合物の癌をレンダリング。 我々は、固定やライブヒト癌細胞（有糸分裂で余分中心体の高い発生で）対正常細胞をスキャンすることによってナントPJ-34の細胞傷害活性を文書化している。ヒト癌細胞においてPJ-34の細胞傷害活性を同定するために用いられる撮像手順のステップバイステップの説明が以下に含まれる。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen (GIBCO)</td>
			<td>41965</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal bovine Serum)</td>
			<td>Invitrogen (GIBCO)</td>
			<td>12657</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep-Ampho solution</td>
			<td>Biological Industries, Israel</td>
			<td>03-033-1B</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Invitrogen (GIBCO)</td>
			<td>25030-024</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Tripsin-EDTA</td>
			<td>Invitrogen (GIBCO)</td>
			<td>25200</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>92 mm Petri dishes</td>
			<td>Nunc,Thermo scientific</td>
			<td>150350</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm poly-D-lysine coated glass bottom culture dishes</td>
			<td>MatTek Corporation, USA</td>
			<td>P35GC-0-14-C</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminescent ATP detection assay kit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab113849</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NDS (Normal Donkey Serum)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti &alpha;-tubulin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9026</td>
			<td>1:250 dilution (IF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti &gamma;-tubulin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5192</td>
			<td>1:200 dilution (IF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11017</td>
			<td>1:1,000 dilution (IF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-10042</td>
			<td>1:1,000 dilution (IF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade reagent with DAPI (mounting)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36935</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JetPEI (liposomal transfection reagent )</td>
			<td>Polyplus</td>
			<td>101-10</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica (Mannheim, Germany)</td>
			<td>TCS SP5II</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell death associated with abnormal mitosis observed by confocal imaging in live cancer cells

強力PARP1阻害剤として作用しフェナントレン誘導体は有糸分裂におけるマルチ中心体ヒト癌細胞における過剰中心体の双方向の焦点クラスタリングを防いだ。ナントPJ-34は、最も強力な分子であった。余分中心体のデクラスタリングは、マルチ中心体細胞では分裂障害と細胞死を引き起こす。ほとんどの固体ヒトの癌は超中心体の高い発生を持っている。 PJ-34の活性はライブヒト乳癌MDA-MB-231中心体に高度に豊富である蛍光γ-チューブリン、および、蛍光ヒストンH2Bのプレゼントにコードするベクターでトランスフェクトされた細胞の共焦点イメージングによってリアルタイムで文書化されました染色。異常な染色体の手配やdeclustered中心体を表すデクラスタ化γ-チューブリン病巣はPJ-34で処理した後、トランスフェクトMDA-MB-231細胞で検出された。 2紡錘体極でアンクラスタ余分中心体は、細胞死に先行。これらの結果は、foのリンクさR初めて余分中心体細胞分裂におけるデクラスタリング、および細胞死に至る分裂不全のヒト癌細胞におけるPJ-34の最近検出された排他的な細胞傷害活性。 2中心体と双方向の焦点スピンドルと有糸分裂を受けて正常な細胞を損なうことなく、多中心体ともっぱら根絶癌細胞PJ-34、固定した細胞の共焦点イメージングにより観察前の調査結果による。 PJ-34のこの細胞傷害活性は、他の強力なPARP1阻害剤によって共有されていなかった、とPARP1阻害のその独立性を示唆し、PARP1欠損MEF宿すextracentrosomesで観察された。共焦点イメージングを生きるには、有糸分裂中の細胞を根絶する新しい分子を同定するための有用なツールを提供した。

PJ-34安定した水溶性のフェナント1（ 図1）である。我々の以前の結果は、PJ-34で処理した固定マルチ中心体癌細胞のいくつかのタイプに細胞死および非クラスタ化された余分中心体を明らかにした。対照的に、正常な増殖細胞を2,3損なわれていなかった。中心体は、2つの固定余分中心体細胞でcentrine1とγ-チューブリンに対する抗体で二重標識により同定?...

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Cell Death Associated with Abnormal Mitosis Observed by Confocal Imaging in Live Cancer Cells

有糸分裂を受けている癌細胞でナントPJ-34の細胞傷害活性は、ライブ共焦点イメージングによりリアルタイムで文書化されました。 PJ-34根絶ヒト乳癌MDA-MB-231細胞分裂に余分中心体を保有する細胞。通常の双方向の焦点有糸分裂とは異なり、余分中心体は、PJ-34の存在下で2紡錘体極にクラスタ化されていなかった。

ライブ癌細胞で共焦点イメージングで観測異常有糸分裂と関連付けられる細胞死

Phenanthrene derivatives acting as potent PARP1 inhibitors prevented the bi-focal clustering of supernumerary centrosomes in multi-centrosomal human ...

Research

JoVE Journal

Medicine

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