Name: cell death associated with abnormal mitosis observed by confocal imaging in live cancer cells
Uploaded: 2013-08-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell Death Associated with Abnormal Mitosis Observed by Confocal Imaging in Live Cancer Cells at JoVE.com

Finansiering kilder til denne forskningen: et felles fond av Tel Aviv University teknologioverføring selskapet, Ramot og Sheba-Medical Center (M. CA og SI.), ICRF - Israelsk Cancer Research Foundation (M. CA.) Og Israel Science Foundation ( SI).

En. Cell Culture Forberedelse MDA-MB-231-celler ble kjøpt fra ATCC (American Type Culture Collection) og lagret i flytende nitrogen. <ol><li> Seed 10 6 MDA-MB-231 celler i 92 mm diameter petriskål i 10 ml komplett medium som inneholder Dulbeco Modified Eagle Medium (DMEM), 10% hest serum, 1% L-glutamin, og 1% Penstrep-Amfotericin B. Tillat celler å spre seg til ca 80-100% samløpet. </li><li> Fjern kultur medium fra fatet og kast. </li><li> Vask celleskiktet kort med...

<ol>
	<li>Jagtap, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+phananthridine+inhibitors+of+poly(adenosine+5'-diphosphate-ribose)+synthetase:+Potent+cytoprotective+and+antishock+agents.">Novel phananthridine inhibitors of poly(adenosine 5'-diphosphate-ribose) synthetase: Potent cytoprotective and antishock agents.</a> Crit. Care Med. 30, 1071-1082 (2002).</li><li>Castiel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+molecule+exclusively+eradicates+human+cancer+cells:+Extra-centrosomes+de-clustering+agent.">A small molecule exclusively eradicates human cancer cells: Extra-centrosomes de-clustering agent.</a> BMC Cancer. 11 (1), 412 (2011).</li><li>Inbar-Rozensal, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+selective+eradication+of+human+nonhereditary+breast+cancer+cells+by+phenanthridine+-derived+polyADP-ribose+polymerase+inhibitors.">A selective eradication of human nonhereditary breast cancer cells by phenanthridine -derived polyADP-ribose polymerase inhibitors.</a> Breast Cancer Res. 11 (6), R78 (2009).</li><li>Gergely, F., Basto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+centrosomes:+together+they+stand,+divided+they+fall.">Multiple centrosomes: together they stand, divided they fall.</a> Genes Dev. 22, 2291-2296 (2008).</li><li>Godinho, S. A., Kwon, M., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosomes+and+cancer:+how+cancer+cells+divide+with+too+many+centrosomes.">Centrosomes and cancer: how cancer cells divide with too many centrosomes.</a> Canc. Met. Rev. 28, 85-98 (2009).</li><li>Doxsey, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-evaluating+centrosome+function.">Re-evaluating centrosome function.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 688-698 (2001).</li><li>Walczak, C. E., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+mitotic+spindle+assembly+and+function.">Mechanisms of mitotic spindle assembly and function.</a> International Rev. of Cytology. 265, 111-158 (2008).</li><li>Ogden, A., Rida, P. C. G., Aneja, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Let's+huddle+to+prevent+a+muddle:+centrosome+declustering+as+an+attractive+anticancer+strategy.">Let's huddle to prevent a muddle: centrosome declustering as an attractive anticancer strategy.</a> Cell Death Differ. 19, 1255-1267 (2012).</li><li>Kramer, A., Anderhub, S., Maier, B., Schatten, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+Consequences+of+centrosomes+clustering+in+cancer+cells.">Mechanisms and Consequences of centrosomes clustering in cancer cells.</a> The Centrosome: Cell and Molecular mechanisms of functions and disfunctions in disease. , 255-277 (2012).</li><li>Galimberti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaphase+Catastrophe+Is+a+Target+for+Cancer+Therapy.">Anaphase Catastrophe Is a Target for Cancer Therapy.</a> Clin. Cancer Res. 17, 1218-1222 (2011).</li><li>Kanai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haploinsufficiency+of+poly(ADP-ribose)+polymerase-1-mediated+poly(ADP-ribosyl)ation+for+centrosome+duplication.">Haploinsufficiency of poly(ADP-ribose) polymerase-1-mediated poly(ADP-ribosyl)ation for centrosome duplication.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 359, 426-430 (2007).</li><li>Gartner, E. M., Burger, A. M., Lorusso, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(ADP-ribose)+polymerase+inhibitors:+a+novel+drug+class+with+a+promising+future.">Poly(ADP-ribose) polymerase inhibitors: a novel drug class with a promising future.</a> Cancer J. 16, 83-90 (2010).</li><li>Wahlberg, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Family-wide+chemical+profiling+and+structural+analysis+of+PARP+and+tankyrase+inhibitors.">Family-wide chemical profiling and structural analysis of PARP and tankyrase inhibitors.</a> Nature Biotechnology. 30, 283-288 (2012).</li><li>Rouleau, M., Patel, A., Hendze, M. J., Kaufmann, S. H., Poirier, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP+inhibition:+PARP1+and+beyond.">PARP inhibition: PARP1 and beyond.</a> Nature Rev. Cancer. 10, 293-301 (2010).</li><li>Leber, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteins+Required+for+Centrosome+Clustering+in+Cancer+Cells.">Proteins Required for Centrosome Clustering in Cancer Cells.</a> Sci. Transl. Med. 2 (33), 33-38 (2010).</li><li>Kwon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+to+suppress+multipolar+division+in+cancer+cells+with+extra+centrosomes.">Mechanisms to suppress multipolar division in cancer cells with extra centrosomes.</a> Gene Dev. 22, 2189-2203 (2008).</li></ol>

Leve confocal bildebehandling gitt en real-time dokumentasjon av den cytotoksiske effekten av PJ-34 i levende multi-centrosomal celler under mitose (figur 3 og utfyllende informasjon). Dette var den første live dokumentasjon tilskrive cytotoksisitet av PJ-34 i humane kreftceller til ekstra centrosomes de-clustering og celledød, noe som tyder induksjon av Mitotisk Catastrophe celledød ved PJ-34 5-9. I kontrast, ble bi-fokale clustering av super-numerario centrosomes observert i levende ubeh...

Fenantren avledet PARP1 hemmere, inkludert PJ-34 ble utviklet for å beskytte hvilende celler fra celledød ved apoptose indusert av energikrevende PARP1 mediert DNA-reparasjon under stress forhold (slag eller hjerteinfarkt) 1. Men nylig oppdaget vi at PJ-34, på to ganger høyere konsentrasjon enn det inducing PARP1 hemming, kan utelukkende føre til celledød i humane kreftceller 2,3. Jo mer hurtig spredning av cellen var, jo mer effektiv utryddelse av cellene. Cellegiften aktiviteten til PJ-34 ble tilskrevet ekstra-centrosomes de-clustering i mitose to. Mange menneskelig kreft celler havn multicentrosomes 4,5. Inkubasjon av menneskelig brystkreft celler MDA-MB-231, som havna overtallige centrosomes, med 20 mikrometer PJ-34 effektivt utryddet disse cellene innen 72-96 timer uten å svekke hvilende celler eller noen godartede prolifererende celler som to centrosomes i mitose <sup&gt; 2,3. Godartede celler inkludert menneskelige mammary epitelceller MCF-10, Human endotelceller (HUVEC) og primære mesenchymalceller forberedt fra menneskelige thymus. Disse cellene var resistente overfor den cytotoksiske aktivitet av PJ-34. PJ-34 ikke forstyrre med sin celle syklus i løpet av 96 timer inkubasjon eller påvirke deres centrosomes og bi-fokale spindel formasjon 2,3. Bipolar sentrosomen montering er avgjørende for bipolar spindel formasjonen i mitose 4,5. Derfor har celler med mer enn to centrosomes utviklet et knapt forstått molekylære mekanismen, clustering sine ekstra centrosomes på to poler 4-9. Unnlatelse av bipolar montering av sine centrosomes kan forårsake multipolar forvrengt spindler og avvikende kromosomer segregering at arrestasjoner celle-syklus i G2 / M arrest, og fører til celledød tilskrives mitotic svikt 4,5. De molekylære mekanismene bak ekstra-centrosomes de-clustering er intensivt undersøkt &lt;sup&gt; 10. Forstå dette dødsfallet mekanismen vil gjøre eksklusive utrydding av kreftceller mens sparsom sunt vev 5,10. Således kan forbindelser som aktiverer mitotisk katastrofe celledød tilbyr en ny måte av en selektiv cancer terapi, som kan være effektive i et bredt spekter av humane solide cancers.Our resultater tyder på at konfokal avbildning kan anvendes for å identifisere molekyler som påvirker ekstra-centrosomes clustering i 2,3 mitose, rendering disse forbindelser kreft målretting narkotika kandidater. Vi har dokumentert den cytotoksiske aktiviteten til phenanthridine PJ-34 ved å skanne faste og levende humane kreftceller (med høy forekomst av ekstra-centrosomes i mitose) versus normale celler. En trinnvis beskrivelse av imaging prosedyrer som brukes til å identifisere den cytotoksiske aktiviteten til PJ-34 i humane kreftceller er inkludert nedenfor.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen (GIBCO)</td>
			<td>41965</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal bovine Serum)</td>
			<td>Invitrogen (GIBCO)</td>
			<td>12657</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep-Ampho solution</td>
			<td>Biological Industries, Israel</td>
			<td>03-033-1B</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Invitrogen (GIBCO)</td>
			<td>25030-024</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Tripsin-EDTA</td>
			<td>Invitrogen (GIBCO)</td>
			<td>25200</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>92 mm Petri dishes</td>
			<td>Nunc,Thermo scientific</td>
			<td>150350</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm poly-D-lysine coated glass bottom culture dishes</td>
			<td>MatTek Corporation, USA</td>
			<td>P35GC-0-14-C</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminescent ATP detection assay kit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab113849</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NDS (Normal Donkey Serum)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti &alpha;-tubulin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9026</td>
			<td>1:250 dilution (IF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti &gamma;-tubulin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5192</td>
			<td>1:200 dilution (IF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11017</td>
			<td>1:1,000 dilution (IF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-10042</td>
			<td>1:1,000 dilution (IF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade reagent with DAPI (mounting)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36935</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JetPEI (liposomal transfection reagent )</td>
			<td>Polyplus</td>
			<td>101-10</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica (Mannheim, Germany)</td>
			<td>TCS SP5II</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell death associated with abnormal mitosis observed by confocal imaging in live cancer cells

Fenantren derivater som fungerer som potente PARP1 hemmere hindret bi-fokale clustering av overtallige centrosomes i multi-centrosomal humane kreftceller i mitose. Den phenanthridine PJ-34 var den mest potente molekylet. Declustering av ekstra-centrosomes fører mitotisk svikt og celledød i multi-centrosomal celler. Mest solide kreft hos mennesker har høy forekomst av ekstra-centrosomes. Aktiviteten av PJ-34 ble dokumentert i sanntid ved confocal avbildning av levende menneske brystkreft MDA-MB-231 celler transfektert med vektorer som koder for fluorescerende γ-tubulin, som er svært rik på de centrosomes og for fluorescerende histone H2b stede i kromosomene. Avvikende kromosomer ordninger og de-klynger γ-tubulin brennpunkter representerer declustered centrosomes ble oppdaget i transfekterte MDA-MB-231 celler etter behandling med PJ-34. Un-gruppert ekstra-centrosomes i de to spindel polene innledet sin celledød. Disse resultatene knyttet for første gang nylig oppdaget eksklusive cytotoksisk aktivitet av PJ-34 i humane kreftceller med ekstra-centrosomes de-clustering i mitose, og mitotic svikt fører til celledød. Ifølge tidligere funn observert ved confocal avbildning av faste celler, PJ-34 utelukkende utryddet kreftceller med multi-centrosomes uten å svekke normale celler gjennomgår mitose med to centrosomes og bi-fokale spindler. Dette cytotoksisk aktivitet av PJ-34 ble ikke delt av andre potente PARP1 hemmere, og ble observert i PARP1 mangelfulle MEF skjuler extracentrosomes, noe som tyder sin uavhengighet av PARP1 hemming. Leve confocal bildebehandling tilbudt et nyttig verktøy for å identifisere nye molekyler utrydde celler under mitose.

PJ-34 er en stabil vannløselig phenanthridine 1 (figur 1). Våre tidligere resultater avslørt celledød og de-gruppert ekstra-centrosomes i flere typer faste multi-centrosomal kreftceller som ble behandlet med PJ-34. Derimot ble normale prolifererende celler ikke svekket 2,3. Centrosomes ble identifisert ved dobbel merking med antistoffer rettet mot centrine1 og γ-tubulin i de faste ekstra centrosomal celler to. Her ble den cytotoksiske ak...

Watch this Scientific Journal Video about Cell Death Associated with Abnormal Mitosis Observed by Confocal Imaging in Live Cancer Cells at JoVE.com

Cell Death Associated with Abnormal Mitosis Observed by Confocal Imaging in Live Cancer Cells

Den cytotoksiske aktiviteten til phenanthridine PJ-34 i kreftceller som gjennomgår mitose ble dokumentert i sanntid ved konfokal levende avbildning. PJ-34 utryddet menneskelig brystkreft MDA-MB-231 celler som ekstra-centrosomes i mitose. I motsetning til normal bi-fokale mitose, ble de ekstra-centrosomes ikke gruppert i de to spindel polene i nærvær av PJ-34.

Celledød Associated med Unormal Mitosis Observert av Confocal Imaging in Live-kreftceller

Phenanthrene derivatives acting as potent PARP1 inhibitors prevented the bi-focal clustering of supernumerary centrosomes in multi-centrosomal human ...

Research

JoVE Journal

Medicine

High-Efficiency Transduction of Liver Cancer Cells by Recombinant Adeno-Associated Virus Serotype 3 Vectors

Recombinant vectors based on a non-pathogenic human parvovirus, the adeno-associated virus 2 (AAV2) have been developed, and are currently in use in a ...

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Oncolytic Viruses (OVs) are novel therapeutics that selectively replicate in and kill tumor cells1. Several clinical trials evaluating the effectiveness ...

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Evaluation of Cancer Stem Cell Migration Using Compartmentalizing Microfluidic Devices and Live Cell Imaging

Evaluering av Cancer Stem Cell Migration Bruke Compartmentalizing Microfluidic enheter og Live Cell Imaging

In the last 40 years, the United States invested over 200 billion dollars on cancer research, resulting in only a 5% decrease in death rate. A major ...

MAME Models for 4D Live-cell Imaging of Tumor: Microenvironment Interactions that Impact Malignant Progression

Mame Modeller for 4D Live-celle Imaging av tumor: mikromiljøet interaksjoner som Impact Ondartet Progresjon

We have developed 3D coculture models, which we term MAME (mammary architecture and microenvironment engineering), and used them for live-cell imaging in ...

Modeling Colitis-Associated Cancer with Azoxymethane (AOM) and Dextran Sulfate Sodium (DSS)

Modeling Colitis-Associated Cancer with Azoxymethane AOM and Dextran Sulfate Sodium DSS

Modellering Kolitt-Associated Cancer med Azoxymethane (AOM) og dekstransulfat Natrium (DSS)

Individuals with inflammatory bowel disease (IBD), such as Crohn's disease (CD) or ulcerative colitis (UC) are at increased risk of developing colorectal ...

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

Lever Imaging of Drug Responses i svulsten mikromiljøet i musemodeller av Breast Cancer

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

A Multiplexed Luciferase-based Screening Platform for Interrogating Cancer-associated Signal Transduction in Cultured Cells

En Multiplexed Luciferase-basert screening plattform for avhør kreft-assosiert Signal Transduksjon i dyrkede celler

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi)  holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable  ...

Assessing Phagocytic Clearance of Cell Death in Experimental Stroke by Ligatable Fluorescent Probes

Vurdere phagocytic Clearance av celledød i Experimental Stroke av Ligatable fluorescerende prober

We describe a new histochemical approach for visualization of phagocytic clearance in focal brain ischemia. The approach permits the study of elimination ...

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

Profilering av Østrogen-regulerte MicroRNAs i brystkreftceller

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...