Name: cell death associated with abnormal mitosis observed by confocal imaging in live cancer cells
Uploaded: 2013-08-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell Death Associated with Abnormal Mitosis Observed by Confocal Imaging in Live Cancer Cells at JoVE.com

Fontes de financiamento da pesquisa: um fundo comum de empresa da Universidade de Tel Aviv transferência de tecnologia, RAMOT eo Centro-Sheba Medical (M. CA e SI.), ICRF - Câncer israelense fundação de pesquisa (M. CA.) E Fundação Israel ciência ( SI).

1. Cultura celular Preparação MDA-MB-231 de células foram adquiridos a partir da ATCC (American Type Culture Collection) e armazenada em azoto líquido. <ol><li> Semente 10 6 MDA-MB-231 células em 92 mm de diâmetro, uma placa de Petri em 10 ml de meio completo contendo Dulbeco Modified Eagle Médium (DMEM), 10% de soro de cavalo, 1% de L-glutamina, e 1% de Penstrep-Anfotericina B. Permitir células a proliferar até cerca de 80-100% de confluência. </li><li> Remov...

<ol>
	<li>Jagtap, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+phananthridine+inhibitors+of+poly(adenosine+5'-diphosphate-ribose)+synthetase:+Potent+cytoprotective+and+antishock+agents.">Novel phananthridine inhibitors of poly(adenosine 5'-diphosphate-ribose) synthetase: Potent cytoprotective and antishock agents.</a> Crit. Care Med. 30, 1071-1082 (2002).</li><li>Castiel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+molecule+exclusively+eradicates+human+cancer+cells:+Extra-centrosomes+de-clustering+agent.">A small molecule exclusively eradicates human cancer cells: Extra-centrosomes de-clustering agent.</a> BMC Cancer. 11 (1), 412 (2011).</li><li>Inbar-Rozensal, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+selective+eradication+of+human+nonhereditary+breast+cancer+cells+by+phenanthridine+-derived+polyADP-ribose+polymerase+inhibitors.">A selective eradication of human nonhereditary breast cancer cells by phenanthridine -derived polyADP-ribose polymerase inhibitors.</a> Breast Cancer Res. 11 (6), R78 (2009).</li><li>Gergely, F., Basto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+centrosomes:+together+they+stand,+divided+they+fall.">Multiple centrosomes: together they stand, divided they fall.</a> Genes Dev. 22, 2291-2296 (2008).</li><li>Godinho, S. A., Kwon, M., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosomes+and+cancer:+how+cancer+cells+divide+with+too+many+centrosomes.">Centrosomes and cancer: how cancer cells divide with too many centrosomes.</a> Canc. Met. Rev. 28, 85-98 (2009).</li><li>Doxsey, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-evaluating+centrosome+function.">Re-evaluating centrosome function.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 688-698 (2001).</li><li>Walczak, C. E., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+mitotic+spindle+assembly+and+function.">Mechanisms of mitotic spindle assembly and function.</a> International Rev. of Cytology. 265, 111-158 (2008).</li><li>Ogden, A., Rida, P. C. G., Aneja, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Let's+huddle+to+prevent+a+muddle:+centrosome+declustering+as+an+attractive+anticancer+strategy.">Let's huddle to prevent a muddle: centrosome declustering as an attractive anticancer strategy.</a> Cell Death Differ. 19, 1255-1267 (2012).</li><li>Kramer, A., Anderhub, S., Maier, B., Schatten, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+Consequences+of+centrosomes+clustering+in+cancer+cells.">Mechanisms and Consequences of centrosomes clustering in cancer cells.</a> The Centrosome: Cell and Molecular mechanisms of functions and disfunctions in disease. , 255-277 (2012).</li><li>Galimberti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaphase+Catastrophe+Is+a+Target+for+Cancer+Therapy.">Anaphase Catastrophe Is a Target for Cancer Therapy.</a> Clin. Cancer Res. 17, 1218-1222 (2011).</li><li>Kanai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haploinsufficiency+of+poly(ADP-ribose)+polymerase-1-mediated+poly(ADP-ribosyl)ation+for+centrosome+duplication.">Haploinsufficiency of poly(ADP-ribose) polymerase-1-mediated poly(ADP-ribosyl)ation for centrosome duplication.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 359, 426-430 (2007).</li><li>Gartner, E. M., Burger, A. M., Lorusso, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(ADP-ribose)+polymerase+inhibitors:+a+novel+drug+class+with+a+promising+future.">Poly(ADP-ribose) polymerase inhibitors: a novel drug class with a promising future.</a> Cancer J. 16, 83-90 (2010).</li><li>Wahlberg, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Family-wide+chemical+profiling+and+structural+analysis+of+PARP+and+tankyrase+inhibitors.">Family-wide chemical profiling and structural analysis of PARP and tankyrase inhibitors.</a> Nature Biotechnology. 30, 283-288 (2012).</li><li>Rouleau, M., Patel, A., Hendze, M. J., Kaufmann, S. H., Poirier, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP+inhibition:+PARP1+and+beyond.">PARP inhibition: PARP1 and beyond.</a> Nature Rev. Cancer. 10, 293-301 (2010).</li><li>Leber, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteins+Required+for+Centrosome+Clustering+in+Cancer+Cells.">Proteins Required for Centrosome Clustering in Cancer Cells.</a> Sci. Transl. Med. 2 (33), 33-38 (2010).</li><li>Kwon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+to+suppress+multipolar+division+in+cancer+cells+with+extra+centrosomes.">Mechanisms to suppress multipolar division in cancer cells with extra centrosomes.</a> Gene Dev. 22, 2189-2203 (2008).</li></ol>

Moro imagem confocal fornecida uma documentação em tempo real do efeito citotóxico do PJ-34 em células multi-centrosomal vivo durante a mitose (Figura 3 e da informação suplementar). Esta foi a primeira documentação vivo atribuindo a citotoxicidade de PJ-34 em células de cancro humano para centrossomas extras de-agrupamento e da morte celular, o que sugere a indução de morte celular catástrofe mitótica por PJ-34 5-9. Em contraste, clustering bi-focal de centrossomas super-numerá...

Fenantreno derivados inibidores PARP1, incluindo PJ-34, foram projetados para proteger as células quiescentes de morte celular por apoptose induzida pela energia consumindo PARP1 mediada de reparo do DNA sob condições de estresse (acidente vascular cerebral ou infarto do miocárdio) 1. No entanto, recentemente descobrimos que PJ-34, em duas vezes maior concentração do que PARP1 inibição da indução, pode causar exclusivamente morte celular em células cancerosas humanas 2,3. Quanto mais rápida for a proliferação da célula era mais eficiente na erradicação das células era. A atividade citotóxica do PJ-34 foi atribuída a extra-centrosomes de-agrupamento na mitose 2. Muitos humano células cancerosas porto multicentrosomes 4,5. A incubação de células humanas de câncer de mama MDA-MB-231, que abrigam centrosomes supranumerários, com 20 mM PJ-34 eficientemente erradicadas destas células dentro de 72-96 horas, sem prejudicar as células quiescentes ou algumas células em proliferação benigna abrigar dois centrossomas em mitose <sup&gt; 2,3. Células benignas incluídas células epiteliais mamárias humanas MCF-10, as células endoteliais humanas (HUVEC) primárias e células mesenquimais preparadas a partir de timo humano. Estas células eram resistentes à actividade citotóxica de PJ-34. PJ-34 não interferiu com o ciclo celular durante 96 horas de incubação ou afetar seus centrossomas e formação eixo bi-focal 2,3. Montagem centrosome Bipolar é crucial para a formação do fuso bipolar na mitose 4,5. Portanto, células com mais de dois centrossomas desenvolveram um mecanismo molecular mal compreendida, agrupando os centrossomas extras em dois pólos 4-9. Falha de montagem bipolar dos seus centrossomas pode causar multipolar distorcida fusos e aberrante cromossomas segregação que prende o ciclo celular em G2 / M de detenção, e leva à morte das células por falha mitótico 4,5. Os mecanismos moleculares subjacentes extra-centrosomes de-agrupamento são intensamente investigadas &lt;sup&gt; 10. Compreender este mecanismo de morte permitirá erradicação exclusivos das células cancerosas, poupando os tecidos saudáveis ​​5,10. Assim, os compostos que activam a morte celular catástrofe mitótica oferecer um novo modo de tratamento de um cancro selectiva, o que pode ser eficaz numa larga gama de resultados cancers.Our sólidos humanos sugerem que a imagem confocal pode ser utilizado para identificar moléculas que afectam extra-centrossomas no agrupamento mitose 2,3, tornando estes compostos câncer alvo candidatos a fármacos. Nós documentamos a atividade citotóxica do fenantridina PJ-34, verificando células cancerosas humanas fixas e ao vivo (com alta ocorrência de extra-centrossomas na mitose) contra as células normais. Um passo a passo descrição dos procedimentos de imagiologia utilizadas para identificar a actividade citotóxica de PJ-34 em células de cancro humanas estão incluídas a seguir.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen (GIBCO)</td>
			<td>41965</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal bovine Serum)</td>
			<td>Invitrogen (GIBCO)</td>
			<td>12657</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep-Ampho solution</td>
			<td>Biological Industries, Israel</td>
			<td>03-033-1B</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Invitrogen (GIBCO)</td>
			<td>25030-024</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Tripsin-EDTA</td>
			<td>Invitrogen (GIBCO)</td>
			<td>25200</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>92 mm Petri dishes</td>
			<td>Nunc,Thermo scientific</td>
			<td>150350</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm poly-D-lysine coated glass bottom culture dishes</td>
			<td>MatTek Corporation, USA</td>
			<td>P35GC-0-14-C</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminescent ATP detection assay kit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab113849</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NDS (Normal Donkey Serum)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti &alpha;-tubulin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9026</td>
			<td>1:250 dilution (IF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti &gamma;-tubulin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5192</td>
			<td>1:200 dilution (IF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11017</td>
			<td>1:1,000 dilution (IF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-10042</td>
			<td>1:1,000 dilution (IF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade reagent with DAPI (mounting)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36935</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JetPEI (liposomal transfection reagent )</td>
			<td>Polyplus</td>
			<td>101-10</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica (Mannheim, Germany)</td>
			<td>TCS SP5II</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell death associated with abnormal mitosis observed by confocal imaging in live cancer cells

Derivados fenantreno que actuam como inibidores potentes PARP1 impedido o agrupamento bi-focal de centrossomas excedentários em células de cancro humano multi-centrosomal na mitose. O fenantridina PJ-34 foi a molécula mais potente. Declustering de extra-centrosomes provoca insuficiência mitótico e morte celular em células multi-centrosomal. Cânceres humanos mais sólidos têm alta ocorrência de extra-centrossomas. A actividade de PJ-34 foi documentada em tempo real por imagem confocal de cancro da mama humano vivo MDA-MB-231 transfectadas com vectores que codificam para fluorescente γ-tubulina, que é altamente abundante nos centrossomas e para histona H2B fluorescente presente na os cromossomos. Aberrantes arranjos cromossomos e focos γ-tubulina de-cluster representando centrosomes declustered foram detectados nas transfectadas MDA-MB-231 células após tratamento com PJ-34. Un-cluster extra-centrossomas nos dois pólos do fuso precedeu sua morte celular. Estes resultados ligados for a primeira vez que a atividade citotóxica exclusivo recentemente detectada de PJ-34 em células cancerosas humanas com extra-centrosomes de-agrupamento na mitose e insuficiência mitótico, levando à morte celular. De acordo com descobertas anteriores observados por imagem confocal de células fixas, PJ-34 células cancerosas erradicada exclusivamente com multi-centrosomes sem prejudicar as células normais submetidos a mitose com os dois centrossomas e fusos bi-focal. Esta atividade citotóxica de PJ-34 não foi compartilhada por outros inibidores potentes PARP1, e foi observada em PARP1 deficientes MEF extracentrosomes abrigam, sugerindo a sua independência de PARP1 inibição. Viver de imagem confocal ofereceu uma ferramenta útil para a identificação de novas moléculas células erradicar durante a mitose.

PJ-34 é uma água solúvel estável fenantridina 1 (Figura 1). Os nossos resultados precedentes revelaram a morte celular e de agrupado extra-centrossomas em vários tipos de células cancerosas multi-centrosomal fixas que tenham sido tratados com o PJ-34. Em contraste, a proliferação de células normais não foram prejudicados 2,3. Centrossomas foram identificados por dupla marcação com anticorpos dirigidos contra centrine1 e γ-tubulina nas células extra-centrosomal fixos <...

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Cell Death Associated with Abnormal Mitosis Observed by Confocal Imaging in Live Cancer Cells

A actividade citotóxica do fenantridina PJ-34 em células de cancro sujeitos a mitose foi documentada em tempo real por meio de imagem confocal vivo. PJ-34 erradicou o câncer de mama humano MDA-MB-231 células abrigam extra-centrossomas na mitose. Ao contrário de mitose bi-focal normal, o Extra-centrossomas não foram agrupados nos dois pólos do fuso na presença de PJ-34.

A morte celular associada com mitose anormal observado por imagem confocal em células vivas Câncer

Phenanthrene derivatives acting as potent PARP1 inhibitors prevented the bi-focal clustering of supernumerary centrosomes in multi-centrosomal human ...

Research

JoVE Journal

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